[논문]인간 치주인대 유래 섬유모세포에 대한 흡수성 교원질 차폐막의 생체적합성

권용대; 이백수; 주성숙

인간 치주인대 유래 섬유모세포에 대한 흡수성 교원질 차폐막의 생체적합성
BIOCOMPATIBILITY OF ABSORBABLE COLLAGEN MEMBRANES IN HUMAN PDL-DERIVED FIBROBLASTS IN VITRO 원문보기

大韓口腔顎顔面外科學會誌 = Journal of the Korean Association of Oral and Maxillofacial Surgeons, v.32 no.3, 2006년, pp.272 - 278

권용대 (경희대학교 치과대학 구강악안면외과) , 이백수 (경희대학교 치과대학 구강악안면외과) , 주성숙 (경희대학교 치과대학 구강해부학교실)

Abstract ▼ AI-Helper

Purpose: This study is designed to evaluate biocompatibility of three types of absorbable collagen GBR membrane in vitro. Material and Method: The human PDL fibroblasts culture was obtained through typical way and the cells used in the experiment was forth passage. The membranes examined were Experimental group A, B, C. All the 3-experimental groups were made of bovine pericardium and the membranes were excised into 5$\times$5mm respectively. The samples of the membranes were fixed on the 24-well plate with the double-sided adhesive tape. Then, 2ml of cell suspension which included $2{\times}10^4$cells was inoculated into the 24-well plate, and the cells were cultured for 1 week. Cellular viability and the alkaline phosphatase activity were measured with ELISA. The membranes in the culture were processed to examine with SEM. Results: The survival rate was highest in control and Experimental group A is the next, group B and group C in order of the value. The values are analyzed for statistical difference using Wilcoxon test. All the values of experimental groups are significantly lower than those of control, and the vaules among the experimental groups significantly differ from each other. Alkaline phosphatase level was identical order with the viable cell rate. SEM examination revealed that the PDL fibroblasts adherent on culture dish (control) and group A were spindle-shaped, but on group B and C, the cells were round-shaped without processes.

주제어

AI 본문요약
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문제 정의

본 연구에서 세포증식 대한 연구와 함께 알칼리성 인산분해효소에 대한 연구도 시행하였다. 본 연구에서는 소의 심막 교원질로 이루어진 3종류의 흡수성 차폐막에 대해서 인간 치주인대 섬유모세포의 부착, 증식과 분화를 조사하여 이들 흡수성 차폐막의 생체 적합성에 대하여 실험적으로 평가하고자 하였다.
이에 본 연구는 최근 새로이 만들어진 각종 흡수성 교원질 차폐막에 대한 배양된 인간 치주인대 섬유모세포의 부착, 분화 및 증식을 실험적으로 평가하기 위해 시행되었다.

가설 설정

후)조직 유도재생술(GTR)">조직유도재생술(GTR) 및 골유도 재생술(GBR)에 이용될 수 있는 차폐막으로서의 특징으로는 생체적합성, 조직통합성(tissue integration), 세포차단성(cell occlusivity), 공간유지를 위한 물리적 특성, 임상에서 다루기 편해야 하는 성질이 있다^1-3). 이상적으로 증식, 이주, 분화, 성숙의 기능을 위해서 세포들은 어떤 기질에 부착되어야 하는데 차폐막이 세포의 부착을 촉진시킬 수 있으면 좋을 것이다. Machtei 등⁴⁾이 지적했듯이 다시 꺼낸 차폐막의 내면에서 결합조직의 존재는
제안 방법
- 후)오염소견은">오염 소견은 보이지 않았다. MTT분석은 각 배양기에서 채취한 실험군 A, B, C 및 대조군의 샘플을 ELISA측정기에 넣어 측정 하였다.
- 후)글루타 알데하이드">글루타알데하이드 가교결합(glutaraldehyde cross-linking)을 한 것이며, C는 B에 항혈전제인 heparin sulfate 처리를 한 차폐막이다. 대조군은 차폐막을 부착하지 않은 일반적인 배양접시표면으로 설정하였다.
- 후)초대 배양을">초대배양을 실시하였다. 배양조건은 37℃, 95% 대기와 5% 이산화탄소의 환경으로 배양 인큐베이터를 조절하였다. 배양액은 DMEM(Dulbecco’s Modified Eagle Medium; Wellgene, Seoul, Korea)에 10% 우태아혈청(Fetal Bovine Serum; Wellgene, Seoul, Korea)과 1% 페니실린 및 1%의 Triton X-100을 넣고 약 30분간 반응시킨다. 상업적으로 판매되는 알칼리성 인산분해효소 측정 키트(Bio-Rad Laboratories, Inc. USA)을 이용하여 충분히 반응시킨 후 0.4M NaOH 용액을 넣어 반응을 중지시키고 ELISA측정기로 405nm의 파장하에서 흡광도를 측정하였다.
- 실험군 A, B, C의 각 차폐막을 5×5mm의 정사각형 크기로 잘라 멸균상태의 양면테이프를 이용하여 24-well 배양기에 부착하였다.
- 후)알칼리성인산분해효소">알칼리성 인산분해효소 활성검사 역시 각 배양기에서 채취한 실험군 A, B, C 및 대조군의 샘플을 ELISA 측정기에 넣어 측정하였다.
- 후)스트렙 토마이신을">스트렙토마이신을 첨가하여 사용하였다. 약 2~3일 간격으로 배양액을 교환하였고 계대배양을 통해 얻은 4대째 세포들을 이용하여 실험을 실시하였다.
- 후)인간치주인대">인간 치주인대 섬유모세포를 이용한 본 연구에서는 실험군 A, B, C의 세가지 흡수성 교원질 차폐막을 평가하였다. MTT분석 결과 대조군에서 가장 높은 값을 보이고 실험군 A, B, C의 순으로 그 값을 나타내었다.
- 후)세포 부유액">세포부유액 샘플을 채취한다. 트립판 블루를 사용하여 샘플을 염색하고 혈구계산판(hematocytometer)상에서 세포수를 계산하여 10% 우태아혈청과 항생제를 함유한 DMEM 1ml당 약 1×10⁴ 개의 인간 치주인대 섬유모세포를 포함하는 세포부유액으로 만들어, 앞에서 준비한 24-well 배양기에 세포 부유액을 2ml씩 넣고 1주일간 배양하였다. 배양액을 2~3일 간격으로 교환하였으며 세균이나
  대상 데이터
  
  20대 초반의 남자로부터 얻은 대구치 및 소구치 치근의 중간 1/3부분을 클린벤치 내에서 멸균상태의 외과용 수술도 또는 치과용 큐렛 등을 이용하여 치주인대를 긁어내고 배양접시에서 초대배양을 실시하였다. 배양조건은 37℃, 후)글루타 알데하이드를">글루타알데하이드를 포함한 인산완충용액으로 고정하여 약 4℃에 저장하고 농도를 점진적으로 올린 알코올을 통해 탈수하였다. 각각의 표본들은 임계점 건조기(Critical point dryer; HCP-2, Eiko engineering, Japan)와 금속코팅기(Ion coater; IB-3, Hitachi, Japan)을 통한 건조와 금코팅 과정을 거쳐 표본을 준비하였다. 배양 1주째, 각각의 실험 표본들은 MTT분석, 알칼리성 인산분해효소 (alkaline phosphatase) 활성 검사 그리고 주사전자현미경(SEM) 관찰을 위해 준비되었다.
  
  후)배양접시">배양 접시 위에 배양된 인간 치주인대 섬유모세포들을 트립신-EDTA로 떼어내고 원심분리하여 만든 세포괴를 깨뜨려 얻은 세포부유액 샘플을 채취한다. 트립판 블루를 사용하여 샘플을 염색하고 혈구계산판(hematocytometer)상에서 세포수를 계산하여 10% 우태아혈청과 항생제를 함유한 DMEM 1ml당 약 1×10⁴ 개의 후)배양인큐베이터를">배양 인큐베이터를 조절하였다. 배양액은 DMEM(Dulbecco’s Modified Eagle Medium; Wellgene, Seoul, Korea)에 10% 우태아혈청(Fetal Bovine Serum; Wellgene, Seoul, Korea)과 1% 페니실린 및 스트렙토마이신을 첨가하여 사용하였다. 약 2~3일 간격으로 배양액을 교환하였고 본 연구에서 쓰인 재료는 실험군 A가 동결건조처리된 소의 심막 제1형 교원질이며 실험군 B는 글루타알데하이드 가교결합, 실험군 C는 글루타알데하이드 가교결합시킨 후 heparin sulfate로 처리를 한 것이다. 여러 가지 장점에도 불구하고 그동안 e-PTFE가 차폐막으로서 자리를 확고하게 지키고 있을 수 있던 실험에 쓰인 차폐막 3종 모두 소의 심막의 교원질을 이용해 만든 흡수성 차폐막으로 각각을 실험군 A, B, C로 명명하였다. A는 후)주사 전자현미경은">주사전자현미경은 일본 Hitachi사의 S-3200모델을 사용하였다.
데이터처리
- 05). 또한 도표의 출력을 위해서는 SigmaPlot 8.0 (SPSS Inc., Chicago, USA)을 사용하였다.
- 통계처리를 위해서는 SPSS 12.0 (SPSS Inc., Chicago. USA)를 사용하였으며 ELISA 측정기에 의한 각각의 측정치를 Wilcoxon검정을 이용하여 그 유의성을 검정하였다(p<0.05). 또한 도표의 출력을 위해서는 SigmaPlot 8.

성능/효과

후)1.세포의">1. 세포의 부착과 증식에 있어서는 대조군인 배양접시 표면에서 가장 활발한 부착과 세포의 증식이 일어났으며 실험군 A가 그 다음, 실험군 B, C의 순서였다.
후)2.알칼리성">2. 알칼리성 인산분해 효소 활성 검사결과를 통한 경조직 생성능을 갖는 세포로의 분화정도도 평가 역시 대조군에서 가장 높았으며 실험군 A, B, C의 순서였다.
후)3.주사전자현미경">3. 주사전자현미경 관찰 결과 대조군에서는 방추형의 세포 외형과 세포돌기를 볼 수 있었으며 실험군 A에서도 역시 방추형의 세포외형을 보이는 것으로 보였다. 실험군 B와C에서는 세포들의 외형이 구형을 보이고 있었으며 Wilcoxon검정 결과 실험군 A는 대조군에 대하여 유의한 결과를 나타내었으며, 실험군 B, 실험군 C 각각에 대해서도 유의성 있는 결과를 나타내었다. Wilcoxon검정에 의한 검증 결과 실험군 A, B, C 모두 대조군에 대하여 유의한 차이를 보였다. 동일한 제조사의 유사제품인 실험군 B와 실험군 C간의 통계적 유의성에 대해서도 유의한 차이를 보였다. 한편 실험군 A는 p<0.
후)차폐막에서는">차폐막 에서는 생체적합성이 떨어지는 것으로 보고되고 있다^12,14,15,16). 본 연구에서도 글루타알데하이드로 처리한 실험군 B와 C에서 세포의 부착과 증식이 통계학적으로 유의하게 실험군 A와 대조군에 비해 낮았으며 알칼리성 인산분해효소 활성 역시 낮게 나타났다. 그렇지만 실제 임상에서는 BioMend^Ⓡ와 Bio-Gide^Ⓡ, Ossix^Ⓡ는 모두 교원질로 만들어진 흡수성 차폐막이지만 치주인대 섬유모세포를 배양하여 그 세포수를 측정한 결과 Bio-Gide^Ⓡ와 Ossix^Ⓡ는 비슷한 결과를 보였으나 BioMend^Ⓡ는 통계학적으로 유의할 만한 수준으로 적은 세포수를 보였다¹⁶⁾. 본 연구에서도 실험군 A, B, C는 모두 소의 심막에서 추출한 제 1형 교원질로 만들어진 흡수성 차폐막이었으나 MTT분석 결과 그 측정치가 각 그룹간에 통계학적으로 유의할 만한 차이를 보여 같은 원료로 만들어졌지만 치주인대 섬유모세포의 생존율에 각각 다른 영향을 주는 것으로 나타났다.
실험군 A의 관찰 결과 대조군과 다소 비슷한 방추형의 모양을 보이고 있었으나 대조군보다는 편평하지 못한 양상을 띄었다. 역시 세포돌기들을 내고 있는 모습도 후)생 성능을">생성능을 갖는 세포로의 분화 정도를 가늠할 수 있다. 실험군 C에서 특히 알칼리성 인산분해효소의 측정치가 낮았는데 비율적으로 보아 MTT분석과 비교하면 더욱 낮은 수치를 보였다. 이는 세포의 부착과 증식도 낮지만 세포가 원래의 경조직 생성능을 갖는 섬유모세포로 분화하는 데도 장애를 갖는 것으로 보인다.
후)알칼리성인산분해효소">알칼리성 인산분해효소 활성검사에서도 동일한 순서로 나타났다. 이러한 결과는 실험에서 이용된 모든 교원질 차폐막이 세포의 부착, 분화 및 증식을 저해한다라는 것을 뜻한다고 볼 수 있다. 이는 여러 가지 후)보고되었다">보고 되었다²⁵⁾ . 이러한 보고를 근거로 하면 실험군 B, C에서는 세포가 부착하여 분화, 증식하기에 좋지 못한 기질이며 생체적합성이 저조한 것으로 나타났다. 이러한 결과는 앞에서 언급했듯이 이상의 결과를 종합하여 볼 때, 차폐막의 생체내 흡수를 연장시키기 위한 글루타알데하이드 처리 및 실험군 C에서의 heparin sulfate 처리는 실험실 환경에서 인간 치주인대 섬유모세포의 부착, 증식 및 분화를 저해하였다고 사료된다.
측정 결과MTT 분석과 마찬가지로 대조군에서 가장 높은 값을 나타내었으며 실험군 A, 실험군 B, 실험군 C의 순으로 측정되었다(Fig. 2).

후속연구

후)알칼리성인산분해효소">알칼리성 인산분해효소 활성을 나타낸 것으로 보아 이러한 처치가 실험적으로는 생체적합성을 향상시키는데 오히려 방해가 되었다고 볼 수 있다. 그렇지만 in vitro상에서 얻어진 결과로는 in vivo내에서의 복잡한 많은 상호작용들을 모두 다 재현할 수 없으므로 in vivo모델에서 체계적인 동물실험을 통해 본 연구의 결과를 확인할 필요가 있다. 또한 후)생체 내에">생체내에 매식되는 차폐막들의 물리적, 화학적인 조성을 이해하고 매식되는 주변 생물학적 환경에 대한 이해가 고려되어야 한다. 또한 생체적합성을 감소시키는 요소에 대한 연구가 보다 필요할 것이며 이를 최소화하기 위한 연구와 노력이 경주되어야 할 것이다.

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저자의 다른 논문 :

표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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