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문제 정의
- 있다. 그러나 본 연구에서는 특정 화학물질을 제조하거나 이용하는 공장이 아니라, 조선소에서 나오는 배출수와 주변 하천수를 대상으로 하였으므로 그 주변에서 현재 양식되고 있는 네 가지 양식생물 종들(넙치, 조피볼락, 멍게, 피조개)을 이용하여 이들 생물에 미치는 생물독성 영향을 살펴보았다. 이러한 생물학적 영향을 알아보기 위하여 48 시간 급성독성실험과 comet assay를 이용하였다.
- 배제할 수는 없다. 이러한 물질들은 모두 DNA 손상을 유발하는 유전독성물질(Monarca et al.[2000]; Hagger et al 2002]; LafFon et al.[2006])로 알려져 있으므로, 배출수와 주변 하천수에서의 유전독성발현 여부를 조사하기 위하여 comet assay 를 수행하였다.
제안 방법
- 48시간 반치사 실험 후, 생존한 개체를 대상으로 수조 당 4마리씩 DNA 손상 실험을 실시하였다. 어류의 경우, 항문보다 약간 위쪽에 주사기 (Sterile hypodermic syringe, 1 ml, 25 G)를 주입하여 배 주 동맥으로부터 혈액을 채취하였다.
- Comet assay 실험은 Singh et al.[1988]의 실험법을 바탕으로 일부 수정하여 실시하였다. 채취된 세포는 마이크로 원심분리관에서 HBSS 1 ml로 희석하여 어류 및 이매패류는 5,000 rpm, 멍게는 10, 000 rpm에서 5분간 원심분리를 하였다.
- 1). 각각의 시료는 40L씩 채취하여 각 실험생물종에 노출하였다. 넙치는 2004년 8월에, 조피볼락은 11월 피조개와 멍게는 12월에 채취한 시료로 실험을 실시하였으며, 9개 정점에서 동일 시기에 시료를 채취하여 위 양식생물종에 대해 독성실험을 실시하였다.
- 그리고 4 ℃ 에탄올에 5분간 담아둔 후 실온에서 건조시켰다. 건조된 슬라이드는 20 μl ethidium bromide 용액으로 염색하여 형광현미경 (Nikon Eclipse E200)으로 200배 배율에서 관찰하였다.
- 공기는 산소펌프로 주입하였으며, 각 생물종이 서식하기에 알맞은 수온을 유지하도록 하였다. 모든 노출실험에는 여과되어진 통영해수(S)와 염분이 조절되어진 수돗물(W.S)이 대조구로 포함되어 수행되었다.
- 실험에 사용되어진 모든 생물은 해산종이므로 실험에 앞서 모든 시료수는 수입산 해수염 (Sera Premium, Sera Company, Germany)을 이용하여 염분(35 psu>을 맞추었으며, 묽은 염산을 이용하여 수소이온농도(pH 8.0)를 조절하였다. 어류는 40L의 수조에 각 15개체를, 멍게와 피조개는 각 20개체를 넣어 48시간 이후 치사율을 측정하였다.
- 0)를 조절하였다. 어류는 40L의 수조에 각 15개체를, 멍게와 피조개는 각 20개체를 넣어 48시간 이후 치사율을 측정하였다. 48시간 노출 동안에는 사료를 제공하지 않았으며 , 광주기는 12L/12D로 설정하였다.
- 그러나 본 연구에서는 특정 화학물질을 제조하거나 이용하는 공장이 아니라, 조선소에서 나오는 배출수와 주변 하천수를 대상으로 하였으므로 그 주변에서 현재 양식되고 있는 네 가지 양식생물 종들(넙치, 조피볼락, 멍게, 피조개)을 이용하여 이들 생물에 미치는 생물독성 영향을 살펴보았다. 이러한 생물학적 영향을 알아보기 위하여 48 시간 급성독성실험과 comet assay를 이용하였다.
대상 데이터
- 2. Comparison of DNA damage in four test animals between dif ferent effluent water (S: seawater, W.S: tap water + salt, A: acid-rinsing water, L: laundry rinsing water, G: sewa응e, M: mixture effluent water, K: Ko-Hyun stream, J: Jang-pyoung stream, Y: Youn-Cho stream).
- 거제에 위치한 조선소 내 처리수 3개 정점(처리시설을 거쳐 나오는 배출수; 산세척수(A), 세탁폐수(L), 오수(G))과 혼합방류수 3개 정점(처리시설을 거치지 않은 배출수와 공장을 통과하는 하천이 혼합되어진 배출수; Ml, M2, M3), 그리고 조선소 주변 하천수 3개 정점(고현천, 장평천, 연초천)에서 시료를 채취하였다(Fig. 1). 각각의 시료는 40L씩 채취하여 각 실험생물종에 노출하였다.
- 넙치(Paralichtlys olivacens)는 길이 7~10cm인 개체를 국립수산과학원 어류육종센터에서 제공받아 사용하였다. 조피볼락(Sebasfes schlegeli)은 길이 7~12 cm 범위로 경남 통영 양식장에서 구입하였다.
- 각각의 시료는 40L씩 채취하여 각 실험생물종에 노출하였다. 넙치는 2004년 8월에, 조피볼락은 11월 피조개와 멍게는 12월에 채취한 시료로 실험을 실시하였으며, 9개 정점에서 동일 시기에 시료를 채취하여 위 양식생물종에 대해 독성실험을 실시하였다. 시료는 충분한 양을 채취하여 즉시 사용하였고, 여분의 시료는 -20 ℃ 이하에서 냉동 보관하며 차후 노출실험에 재사용하였다.
- 조피볼락(Sebasfes schlegeli)은 길이 7~12 cm 범위로 경남 통영 양식장에서 구입하였다. 멍게(Hakxwthia roretzi)는 5~8 cm 개체로 국립수산과학원 양식환경연구소에서 제공받았다. 피조개(Scapharca broughtonii)는 크기 7~10cm의 개체를 통영인근의 양^업자에게서 제공받아사용하였다.
- 본 연구를 위해 4종의 양^생물종이 사용되었다. 넙치(Paralichtlys olivacens)는 길이 7~10cm인 개체를 국립수산과학원 어류육종센터에서 제공받아 사용하였다.
- 45)을 보였다. 수돗물 (+소금)보다 통계적 (p<0.05)2로 높은 DNA 손상을 보인 시료는 장평천(J)과 2개의 혼합방류수(Ml, M2)였다(Fig. 2).
- 넙치(Paralichtlys olivacens)는 길이 7~10cm인 개체를 국립수산과학원 어류육종센터에서 제공받아 사용하였다. 조피볼락(Sebasfes schlegeli)은 길이 7~12 cm 범위로 경남 통영 양식장에서 구입하였다. 멍게(Hakxwthia roretzi)는 5~8 cm 개체로 국립수산과학원 양식환경연구소에서 제공받았다.
- 멍게(Hakxwthia roretzi)는 5~8 cm 개체로 국립수산과학원 양식환경연구소에서 제공받았다. 피조개(Scapharca broughtonii)는 크기 7~10cm의 개체를 통영인근의 양^업자에게서 제공받아사용하였다.
- 어류 혈액과 마찬가지로 체액 10~100 gl 정도를 뽑아 HBSS 1 ml 로 희석하여 원심분리 후 사용하였다. 피조개는 아가미조직을 실험에 이용하였다. 아가미 조직을 약 2x2 mm의 크기로 떼어내어 HBSS 1 ml와 함께 조직분말기 (tissue grinder)에서 갈아 아가미 세포를 조직에서 분리한 후, 상등액만을 원심분리관에 옮겨 담아 사용하였다.
- 어류의 경우, 항문보다 약간 위쪽에 주사기 (Sterile hypodermic syringe, 1 ml, 25 G)를 주입하여 배 주 동맥으로부터 혈액을 채취하였다. 혈액 10~100 μl를 뽑아 Hank's balanced salt solution(HBSS) 1 ml로 희석하여 원심분리 후 혈장을 제거하여 혈구 세포만을 실험에 이용하였다.
데이터처리
- 각각의 슬라이드에서 50개의 핵을 분석하여 컴퓨터 이미지 프로그램(Komet version 5, Kinet Imagine Ltd.)을 이용하여 DNA tail moment(부서진 DNA 꼬리의 길이 (pim) x 꼬리부분에 있는 DNA(%))를 계산하였다대조구와 처리구의 차이는 student t-test를 이용하여 구하였다.
성능/효과
- 넙치는 통영해수(S)에서 가장 낮은 DNA 손상(DNA tail moment = 평균 1.0)을 보였고, 수돗물에 염을 녹여 염분을 맞춘 대조구 (W.S.)에서는 약간 높은 DNA 손상(평균 1.45)을 보였다. 수돗물 (+소금)보다 통계적 (p<0.
- 또한 comet assay 를 통한 DNA 손상 측정에서도 모든 종들에 대해 동일한 유전독성을 보인 시료는 없었다. 대조구에 비해 유의하게 높은 DNA 손상이 유도된 발현빈도로 볼 때 장평천이 가장 유전독성이 높은 것을 확인할 수 있었다. 세탁폐수와 혼합방류수 1과 2(M1, M2)는 각각 한 생물종에 대해서만 유의하게 높은 DNA 손상을 유도하였다.
- 5 ng/L, PAHs; 45 ng/L)을 제외한 다른 하천수들(K, Y)에서는 낮은 값(TBT<1 ng/L, PAHs<15 ng/L)을 보여주었다. 반면, 처리공정을 거치지 않고 배출수와 공장 안을 통과하는 하천수와 혼합되어 배출되는 혼합방류수(Ml, M2, M3) 중 Ml은 조사대상의 시료들 중에서 가장 높은 TBT (1510 ng/L)와 PAHs (90 ng/L) 농도를 보였으며, 나머지 M2와 M3은 TBT의 경우 각각 22, 25 ng/L의 값을 보여 하천수와 처리수에 비해 상당히 높은 값을 보였고, PAHs의 경우 11, 33 ng/L로 하천수와는 비슷하나 처리수보다는 높은 농도값을 보여주었다.
- 어류에 비해 이매패류에서 낮은 치사를 보인 것은 이매패류의 경우 여과섭식을 통해 선택적 먹이 흡수가 가능하고(Savina and Pouvreau[2004]), 서식환경이 좋지 않을 경우 패각을 닫아 섭식자체를 중단하기 때문으로 판단된다. 본 연구는 48시간이라는 단시간에 시행이 되었고, 피조개가 노출기간동안 패각을 닫고 있는 것을 관찰할 수 있었다. 따라서, 피조개의 여과활동이 저해되어 치사독성이 나타나지 않았을 가능성도 배제할 수 없을 것이다.
- 삼성조선소의 3개 처리수, 3개 혼합방류수 및 주변 3개 하천수를 4종의 실험생물에 48시간 노출시켰을 때 모든 종에서 50%까지 치시-시키는 급성독성을 보여주지는 않았다. 또한 comet assay 를 통한 DNA 손상 측정에서도 모든 종들에 대해 동일한 유전독성을 보인 시료는 없었다.
- 반면 악취를 풍기는 장평천(J)에서 넙치가, 높은 TBT 및 PAHs농도를 보인 혼합방류수 1(M1)에서 조피볼락이, 그리고 어떠한 특징도 관찰되지 않은 고현 천(K)에서 멍게가 약간의 치사를 보여주었다. 어떠한 시료도 모든 생물에 치사를 일으키지 않았으며, 특히 매우 높은 오염물질농도를 보인 혼합방류수 1에서조차 48시간 노출에서 조피볼락에서 만 13%의 치사율을 보였다. 이러한 사실로부터 본 연구에서 조사되어진 조선소 내 처리수를 포함한 모든 시료들은 48시간 반 치사 농도를 계산할 수 없을 만큼 높은 급성독성을 가지고 있지는 않는 것으로 판단되었다.
- 어떠한 시료도 모든 생물에 치사를 일으키지 않았으며, 특히 매우 높은 오염물질농도를 보인 혼합방류수 1에서조차 48시간 노출에서 조피볼락에서 만 13%의 치사율을 보였다. 이러한 사실로부터 본 연구에서 조사되어진 조선소 내 처리수를 포함한 모든 시료들은 48시간 반 치사 농도를 계산할 수 없을 만큼 높은 급성독성을 가지고 있지는 않는 것으로 판단되었다.
- 5)가 가장 높은 DNA 손상값을 보여주었다. 조피볼락의 DNA 손상을 조사한 결과, 대조구보다 통계적으로 유의하게 높은 정점은 장평천으로 나타났으며, 멍게는 세탁폐수에서 나타났다(p<0.05). 피조개는 수돗물 대조구과 비교하여 통계적으로 차이를 보이는 시료는 없었다.
- 멍게의 경우에도 48시간 치사는 고현천에서 관찰되었으나, DNA 손상은 세탁폐수에서 관찰되었다. 피조개는 48시간 치사나 DNA 손상이 어느 시료에서도 나타나지 않은 것으로부터 단기간 노출에 있어서는 다른 생물들에 비해 상당한 저항성을 가지고 있음을 보여주었다.
- 노출에서 13%의 치사율을 보였다(Table 1). 혼합방류수 1에서 검출된 TBT의 농도는 4계절에 걸쳐 1, 106-2, 392 ng/L이며, PAHs 또한 3.9-163 ng/L로 시료 중에서 가장 높은 값을 보여주었다. 이는 혼합방류수 1의 방류구 후면에 위치한 선박페인트 도장 공장에서 흘러나오는 배출수에 의한 오염으로 사료되어진다(한국해양연구원[2005]).
후속연구
- [2002]). 그러나 본 연구에서는 배출수의 영향평가를 할 때 필요한 화학분석(Bervoets et al.[1993])을 직접 실시하지 않았고, 배출수는 일반적으로 계절에 따른 성분변화가 심하여 (Kosmala et al.[1999]) 월별 조사가 필요함에도 반복실험을 실시하지 않아서 정확한 독성 요인을 파악하기는 어려웠다. 또한, 해양연구원 [2005]에서 동일지점에서 4계절에 걸쳐 조사되어진 화학분석자료들은 노출실험에서 양식 생물에서의 치사율과 DNA 손상과는 뚜렷한 상관성은 보여주지 않았다.
- 그럼에도 불구하고, 높은 오염물질 농도를 보이는 혼합방류수 1(M1)의 노출에도 생물에 따라 현저히 다른 치사율을 보이는 점과 장평천의 시료처럼 화학분석에서는 특정 오염물질이 높게 검출되지 않았음에도 넙치에서의 높은 치사율(26%)과 넙치와 조피볼락에서 유의한 유전독성을 일으킨 점 등에 대해서는 앞으로 보다 면밀한 연구가 필요하리라 생각된다.
- 세탁폐수와 혼합방류수 1과 2(M1, M2)는 각각 한 생물종에 대해서만 유의하게 높은 DNA 손상을 유도하였다. 본 연구결과 모든 생물종에 대해 일정한 DNA 손상을 유발하는 시료는 없었지만, 혼합방류수 1(M1)과 장평천에 대해서는 앞으로 보다 자세한 화학분석과 생물독성 실험이 필요하리라 판단되었다.
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