본 연구는 미니 돼지와 일반 돼지(Duroc)의 동결융해 후 정자의 수정 능력을 비교하여 동결 보존체계의 기틀을 확립하고자 하였다. 정액 제조는 수압법으로 정액 채취하여 1차 희석하였다. 동결은 LEY (1차: 11% ${\alpha}$-lactose+egg yolk, 2차: 1차 동결액+glycerol+OEP) 동결액을 이용하여 동결을 실시하여 동결 보존하였다. 동결 정액의 융해는 0.5 ml straw를 각각 20, 37 및 $50^{\circ}C$ water bath에서 1분, 40 초 및 10초간 융해하여 세척 과정 후 BTS 5 ml를 첨가하여 $37^{\circ}C$에서 배양하였다. 정자 성상 검사로는 기형율(Rose Bengal staining), 첨체율(Chlortetra-cycline staining) 및 생존율(SYBR-14/PI staining)등을 배양 후 0, 3, 6, 9 및 12시간에서 검토하여 다음과 같은 결과를 얻었다. 정자의 보존 시간에 따른 기형율은 동결 융해 직후 miniature pig가 $19.5{\pm}1.7%$ 로 Duroc의 $13.9{\pm}0.3%$에 비해 유의적으로 높았다. (p<0.05). 첨체 검사에서 수정능 획득이 일어나지 않은 F pattern은 동결 융해 후 miniature pig와 Duroc 종 정액이 $24.1{\pm}2.8%$와 $37.9{\pm}1.1%$로 Duroc 종에서 유의적(p<0.05)으로 높게 나타났으며, 동결 융해후 miniature pig와 Duroc 종의 AR pattern은 $21.1{\pm}1.6%$ 및 $15.5{\pm}2.2%$로 miniature pig가 유의적(p<0.05)으로 높게 나타났다. 융해 온도별 생존율에서는 20과 $37^{\circ}C$에서는 두 종간에서 유의적 차이는 없었으나, $50^{\circ}C$에서는 miniature pig가 $63.8{\pm}3.6%$로 $47.4{\pm}3.2%$인 Duroc 종에 비해 유의적(p<0.05)으로 높게 나타났다. 본 연구의 결과로부터 첨체율과 기형율에 대한 연구를 보완함으로써 miniature pig정액의 안정적인 동결 체계를 확립할 수 있을 것으로 판단된다.
본 연구는 미니 돼지와 일반 돼지(Duroc)의 동결융해 후 정자의 수정 능력을 비교하여 동결 보존체계의 기틀을 확립하고자 하였다. 정액 제조는 수압법으로 정액 채취하여 1차 희석하였다. 동결은 LEY (1차: 11% ${\alpha}$-lactose+egg yolk, 2차: 1차 동결액+glycerol+OEP) 동결액을 이용하여 동결을 실시하여 동결 보존하였다. 동결 정액의 융해는 0.5 ml straw를 각각 20, 37 및 $50^{\circ}C$ water bath에서 1분, 40 초 및 10초간 융해하여 세척 과정 후 BTS 5 ml를 첨가하여 $37^{\circ}C$에서 배양하였다. 정자 성상 검사로는 기형율(Rose Bengal staining), 첨체율(Chlortetra-cycline staining) 및 생존율(SYBR-14/PI staining)등을 배양 후 0, 3, 6, 9 및 12시간에서 검토하여 다음과 같은 결과를 얻었다. 정자의 보존 시간에 따른 기형율은 동결 융해 직후 miniature pig가 $19.5{\pm}1.7%$ 로 Duroc의 $13.9{\pm}0.3%$에 비해 유의적으로 높았다. (p<0.05). 첨체 검사에서 수정능 획득이 일어나지 않은 F pattern은 동결 융해 후 miniature pig와 Duroc 종 정액이 $24.1{\pm}2.8%$와 $37.9{\pm}1.1%$로 Duroc 종에서 유의적(p<0.05)으로 높게 나타났으며, 동결 융해후 miniature pig와 Duroc 종의 AR pattern은 $21.1{\pm}1.6%$ 및 $15.5{\pm}2.2%$로 miniature pig가 유의적(p<0.05)으로 높게 나타났다. 융해 온도별 생존율에서는 20과 $37^{\circ}C$에서는 두 종간에서 유의적 차이는 없었으나, $50^{\circ}C$에서는 miniature pig가 $63.8{\pm}3.6%$로 $47.4{\pm}3.2%$인 Duroc 종에 비해 유의적(p<0.05)으로 높게 나타났다. 본 연구의 결과로부터 첨체율과 기형율에 대한 연구를 보완함으로써 miniature pig정액의 안정적인 동결 체계를 확립할 수 있을 것으로 판단된다.
The purpose of this study was undertaken to compare ability of frozen-thawed sperm characteristics between two strains (miniature pig and Duroc). The semen was collected by gloved-hand method into a pre-warmed ($37^{\circ}C$) thermos bottle. The semen was diluted with same volume extender...
The purpose of this study was undertaken to compare ability of frozen-thawed sperm characteristics between two strains (miniature pig and Duroc). The semen was collected by gloved-hand method into a pre-warmed ($37^{\circ}C$) thermos bottle. The semen was diluted with same volume extender and added to LEY solution for freezing. The diluted semen was placed in 0.5 ml straws, and freezing was initiated by exposing the straws to liquid nitrogen ($LN_2$) vapours for 10 min before placing them into $LN_2$ for cryopreservation. The frozen-semen straw were thawed at 20, 37 and $50^{\circ}C$ for 1 min, 45 sec and 10 sec within water-bath. The semen sample were evaluated at 0, 3, 6, 9, and 12 h after incubation at $37^{\circ}C$ for analysis of sperm ability. Abnormality of spermatozoa in miniature pig was significantly (p<0.05) higher than that in Duroc at 0, 9 and 12 h of post-thawing incubation after frozen-thawing. The percentage of F-patterned spermatozoa in miniature pig was significantly (p<0.05) lower, while the percentage of AR (acrosome reacted spermatozoa) pattern was higher in the miniature than in the Duroc. On the other hand, there was no significant difference in the viability of spermatozoa thawed at different temperature ($20^{\circ}C\;and\;37^{\circ}C$) between two species, but the viability in miniature pig was higher (p<0.05) than in Duroc when sperm was thawed at $50^{\circ}C$. In conclusion, this study suggest that suitable freezing method for miniature pig semen is required for increasing post-thawing viability and fertilization capacity.
The purpose of this study was undertaken to compare ability of frozen-thawed sperm characteristics between two strains (miniature pig and Duroc). The semen was collected by gloved-hand method into a pre-warmed ($37^{\circ}C$) thermos bottle. The semen was diluted with same volume extender and added to LEY solution for freezing. The diluted semen was placed in 0.5 ml straws, and freezing was initiated by exposing the straws to liquid nitrogen ($LN_2$) vapours for 10 min before placing them into $LN_2$ for cryopreservation. The frozen-semen straw were thawed at 20, 37 and $50^{\circ}C$ for 1 min, 45 sec and 10 sec within water-bath. The semen sample were evaluated at 0, 3, 6, 9, and 12 h after incubation at $37^{\circ}C$ for analysis of sperm ability. Abnormality of spermatozoa in miniature pig was significantly (p<0.05) higher than that in Duroc at 0, 9 and 12 h of post-thawing incubation after frozen-thawing. The percentage of F-patterned spermatozoa in miniature pig was significantly (p<0.05) lower, while the percentage of AR (acrosome reacted spermatozoa) pattern was higher in the miniature than in the Duroc. On the other hand, there was no significant difference in the viability of spermatozoa thawed at different temperature ($20^{\circ}C\;and\;37^{\circ}C$) between two species, but the viability in miniature pig was higher (p<0.05) than in Duroc when sperm was thawed at $50^{\circ}C$. In conclusion, this study suggest that suitable freezing method for miniature pig semen is required for increasing post-thawing viability and fertilization capacity.
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문제 정의
본 연구는 미니 돼지와 일반 돼지(Ddmoc)의 동결융해 후 정자의 수정 능력을 비교하여 동결 보존체계의 기틀을 확립하고자 하였다. 정액 제조는 수압 법으로 정액 채취하여 1차 희석하였다.
본 연구의 목적은 miniature pig의 생산성 향상을 위한 인공 수정 기술 개발의 일환으로 정액의 동결보존 체계를 확립하기 위한 기초 자료를 확보하는 데 있다. 이를 위해 이미 본 연구실에서 연구되어온 동결 방법 중 LEY(11% Lactose +egg yolk)를 이용한 간편 동결 방법(김 등, 2004)을 통하여 Duroc 종과 miniature pig의 동결한 정액을 동결 융해 후 정자의 생존율, 기형율 및 첨체율 그리고 융해 온도에 따른 생존율 차이 등을 비교 분석하고자 한다.
가설 설정
Effect of thawing temperature on survival ability of frozen-thawed boar spermatozoa. a, b : Bars with different s니persc「ipts within the same category differ significantly (p<0.05). ' : Significantly difference between two species in same treatment groups (p<0.
제안 방법
1% BSA와 5 1의 SYBR-14 working stck(2 jul SYBR-14+198 1 DMSO)을 첨가하여 incubater(37℃) 내에서 10분간 정치시켰다. 10분 후 5 1의 PI(Pro- pidium Iodide, Molecular Probes, USA, L-7011)를 첨가하여 incubater(37℃)상에서 10분간 정치 후 형광현미경(400배)하에서 관찰하였다.
보완하여 실시하였다. Live sperm과 dead sperm 사이의 DNA의 차이를 이용한 형광 염색방법을 이용하였으며 이때 live sperme 녹색으로, dead sperme 붉은색으로 염색되었다. 실험 과정은 100 의 정액에 1 ml의 HEPES(Sigma) +0.
1% BSA(Albumin bovine serum, Sigma A-4503)}과 혼합 후 원심분리(400xg, 37℃, 10분)하여 상층액을 제거하여 BTS로 부유하였다. 동결 정액은 융해 직후(Oh)에서부터 3시간 간격으로 12시간 후까지 일반 성상 검사 (생존율, 기형율 및첨체율)를 실시하였다.
동결된 각 straw는 water bath를 이용하여 각각 20, 37 및 50℃에서 1분, 45초 및 10초 동안 융해하여세 척 액 {PBS +0.1% BSA(Albumin bovine serum, Sigma A-4503)}과 혼합 후 원심분리(400xg, 37℃, 10분)하여 상층액을 제거하여 BTS로 부유하였다. 동결 정액은 융해 직후(Oh)에서부터 3시간 간격으로 12시간 후까지 일반 성상 검사 (생존율, 기형율 및첨체율)를 실시하였다.
sperm viability kit (Molecular Probes, USA)를 이용한 방법을 수정 . 보완하여 실시하였다. Live sperm과 dead sperm 사이의 DNA의 차이를 이용한 형광 염색방법을 이용하였으며 이때 live sperme 녹색으로, dead sperme 붉은색으로 염색되었다.
등(1995)과 Abeydeera 등(1997)의 방법을 수정 . 보완하여 첨체율을 검사하였다. 정자 부유액 100 1에 2 1의 Hoechst33258(Sigma, B-2883,USA)을 첨가하여 실온에서 3분간 정치 후 1 ml의 3% polyvinylpyrrolidone(PVP, ICN Biomedicals, USA)를 첨가시켜, 실온에서 원심분리(400xg, 5분) 하여상층액을 제거한 후 1001의 PBS로 부유시켰다.
생존율 검사는 Maxwell 과 Johnson 1997)의 Live/ Dead™ sperm viability kit (Molecular Probes, USA)를 이용한 방법을 수정 . 보완하여 실시하였다.
Live sperm과 dead sperm 사이의 DNA의 차이를 이용한 형광 염색방법을 이용하였으며 이때 live sperme 녹색으로, dead sperme 붉은색으로 염색되었다. 실험 과정은 100 의 정액에 1 ml의 HEPES(Sigma) +0.1% BSA와 5 1의 SYBR-14 working stck(2 jul SYBR-14+198 1 DMSO)을 첨가하여 incubater(37℃) 내에서 10분간 정치시켰다. 10분 후 5 1의 PI(Pro- pidium Iodide, Molecular Probes, USA, L-7011)를 첨가하여 incubater(37℃)상에서 10분간 정치 후 형광현미경(400배)하에서 관찰하였다.
이를 위해 이미 본 연구실에서 연구되어온 동결 방법 중 LEY(11% Lactose +egg yolk)를 이용한 간편 동결 방법(김 등, 2004)을 통하여 Duroc 종과 miniature pig의 동결한 정액을 동결 융해 후 정자의 생존율, 기형율 및 첨체율 그리고 융해 온도에 따른 생존율 차이 등을 비교 분석하고자 한다.
FBS 200 로 부유하였다. 정자 부유액 100 1을 side glass 위에 옮겨 도말하여, 실온에서 완전히 건조시킨 후 side glass 위에 Rose-Bengal 염색액 5001를 떨어뜨려 염색한 후 현미경(400배) 하에서 기형 정자를 관찰하였다.
5 ml straw를 각각 20, 37 및 50℃ water bath에서 1분, 40 초 및 10초간 융해하여 세척 과정 후 BTS 5 ml를 첨가하여 37℃에서 배양하였다. 정자 성상 검사로는 기형 율(Rose Bengal staining), 첨체 율(Chlortetracycline staining) 및 생존율(SYBR-14/PI staining) 등을 배양 후 0, 3, 6, 9 및 12시간에서 검토하여 다음과 같은 결과를 얻었다. 정자의 보존 시간에 따른 기형율은 동결 융해 직후 miniature pig가 19.
4)}를 첨가하여 정자를 고정시켰다. 제작된 CTC sample 중 10 1를 slide 잉ass에 분주하여 5 1 의 DABCO와 혼합하여, 형광 현미 경(400배)하에서 정자 두부를 관찰하였다. Fig.
대상 데이터
본 실험에 이용된 정액은 강원도 원주시 영서 Al center에서 종모돈(Duroc)의 시판용 정액과 강원대 학교 목장에서 사육중인 2두의 miniature pig에서 개체당 주1회 음경 수압법으로 정액을 채취한 정액을 이용하였다. 두 품종의 정액은 1차 희석(Mulber- ry ID; modified-Modena B)된 정액으로 3시간 이내에 실험에 사용하였다.
데이터처리
본 실험에서 얻어진 결과는 SAS@8.1 package/PC를 이용하여 최소 유의차 검정 (Least Significant Different test; LSD test)과 General linear model(GLM) 을 적용하여 Duncan의 Multiple Range Test에 의 하여 유의차3<0.05)를 검정하였다.
이론/모형
기틀을 확립하고자 하였다. 정액 제조는 수압 법으로 정액 채취하여 1차 희석하였다. 동결은 LEY (1 차; 11% a-lactose+egg yolk, 2차; 1차 동결액 +glycerol+OEP) 동결액을 이용하여 동결을 실시하여 동결 보존하였다.
성능/효과
Miniature pig와 Duroc종간의 동결 융해 후 기 형 율 변화에 대한 결과는 Fig. 4에서 나타낸 바와 같이 miniature pig가 Duroc종에 비해 동결 전-후 높은기형율을 보였으며, 융해 직후, 9 및 12시간에서 유의적 차이를 나타냈다. 배양시간에 따른 기형 율의 변화에서 miniature pig는 유의적 차이를 보이지 않았으나, Doc종 정자의 기형율은 유의적 (P<0.
O5)으로 높은 생존율을 보였다. 또한 두 종간 융해 온도에 따른 생존율은 Duroc의 경우 37에서 높은 생존율을 보였으며, miniature pig의 경우 50 ℃ 에서 높은 생존율을 나타냈다. 한편 융해후 배양 시간에 따른 생존율 변화는 Fig.
4에서 나타낸 바와 같이 miniature pig가 Duroc종에 비해 동결 전-후 높은기형율을 보였으며, 융해 직후, 9 및 12시간에서 유의적 차이를 나타냈다. 배양시간에 따른 기형 율의 변화에서 miniature pig는 유의적 차이를 보이지 않았으나, Doc종 정자의 기형율은 유의적 (P<0.05) 차이를 보이며 증가하였다.
Gillan 등(1997)에 의하면 신선 정자에 비해 동결 융해 과정을 거친 정자의 경우 B pattern과 AR pattern이 증가한다고 보고하였다. 본 연구의 결과(Fig. 5~7)에서 보여주듯 동결 전에 비해 동결 후 B pattern과 AR pattern의 정자가 증가하였으며, 두 종간의 B pattern에서 유의적3<0.05)인 차이는 없었으나 수정 능력이 상실되는 시기 인 AR pattern 의 경우 miniature pig 에서 높게 나타났다.
이와 같은 결과는 본 연구에서 융해 온도에 따른 생존율에서 일반 돼지인 Duroc 종의 결과와 차이를 보였다. 생존율의 경우 Duroc의 경우 김 등 (2005)이 보고한 37℃에서 45초간 융해한 동결정액이 53.4±1.9%로 가장 높은 생존율을 보였으나, 본 연구의 경우 miniature pig의 정액을 높은 온도에서 융해한 동결 정자가 높은 생존율을 보인 결과와 비슷하게 50℃에서 10초간 융해한 동결 정액이 63.8 ±6.2%로 높은 생존율을 나타냈다(Fig. 2).
5~7에 나타냈다. 수정능 획득이 일어나지 않은 F patterne 동결 전 miniature pig와 Duroc 종에서 55.0±3.8%와 55.9± 1.5%로 유의적인 차이를 보이지 않았으나 동결 융해 후24.1±2.8%와 37.9±1.1%로 Duroc 종이 유의적00.05)으로 높게 나타났으며, 시간이 경과함에 따라 점차 감소하여 12시간째에서는 11.8±0.9%와 18.H41%로 나타났다(Fig.
3에서 나타냈다. 유의적 차이는 없었지만 융해 직후의 생존율에서 miniature pig는 63.8±6.2%, Duroc종은 53.4±1.9%, 12시간 후 miniature pig는 29±3.3%, Duroc종은 28.9± 4.7%로 miniature pig에서 높은 생존율을 나타냈다
05)으로 높게 나타났다. 융해 온도별 생존율에서는 20과 37℃에서는 두 종간에서 유의적 차이는 없었으나, 50℃에서는 miniature pig가 63.8±3.6%로 47.4±3.2%인 Duroc 종에 비해 유의적(p<0.05)으로 높게 나타났다. 본 연구의 결과로부터 첨체율과 기형율에 대한 연구를 보완함으로써 miniature pig 정액의 안정적인 동결 체계를 확립할 수 있을 것으로 판단된다.
2에 나타냈다. 융해 후 생존율은 miniature pig가 Duroc 종에 비해 융해 온도에 관계없이 높게 나타났으며, 특히 50℃에서 유의적 0VO.O5)으로 높은 생존율을 보였다. 또한 두 종간 융해 온도에 따른 생존율은 Duroc의 경우 37에서 높은 생존율을 보였으며, miniature pig의 경우 50 ℃ 에서 높은 생존율을 나타냈다.
05). 첨체 검사에서 수정능 획득이 일어나지 않은 F patterne 동결 융해 후 miniature pig와 Duroc 종 정액이 24.1±2.8%와 37.9H.1%로 Duroc 종에서 유의적 0< 0.05)으로 높게 나타났으며, 동결 융해 후 miniature pig 와 Duroc 종의 AR patterne 21.1 ±1.6% 및 15.5± 2.2%로 miniature pig가 유의적(p<0.05)으로 높게 나타났다. 융해 온도별 생존율에서는 20과 37℃에서는 두 종간에서 유의적 차이는 없었으나, 50℃에서는 miniature pig가 63.
후속연구
그러나 자연 교미의 경우 개량을 위한 종모축의 확보와 산자 생산에 있어 어려움을 겪고 있다. 그러므로 miniature pig의 생산성 향상과 우량 종모축의 이용범위 확대 및 특정 경제 형질의 개선을 위해 인공 수정이 필요할 것으로 생각된다. 일반 돼지의 경우, 유전적으로 능력이 우수한 개체를 대 량으로 생산하기 위해 인공 수정 보급률이 급증하고 있다.
05)으로 높게 나타났다. 본 연구의 결과로부터 첨체율과 기형율에 대한 연구를 보완함으로써 miniature pig 정액의 안정적인 동결 체계를 확립할 수 있을 것으로 판단된다.
본 연구의 결과를 종합해 보면 동결 융해 후 정자의 기 형 율과 CTC의 AR pattern에서 miniature pig 가 Duroc종에 비해 유의적으로 높게 나타나 Duroc 종에 비해 수정 능력과 연관이 되는 첨체 상태와 기형율에 대한 평가에서 그 능력이 떨어지는 것으로 판단되어지며, 반면 생존율에 있어서는 minia- ture pig가 Duroc종에 비해 높은 생존율을 보임으로써 내동성이 높은 것으로 판단되지만 향후 이와 관련된 추가적인 연구를 통하여 miniature pig에 적당한 동결 체계를 확립하는 데 기초 자료로 활용될 수 있을 것으로 생각된다.
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