초임계이산화탄소를 이용한 탈카페인녹차 열수추출물의 포유동물 세포주를 이용한 염색체이상시험 Chromosome Aberration Test of Water Extract of Decaffeined Green Tea using Supercritical Carbon Dioxide With Mammalian Cell Line원문보기
There are $10{\sim}30%$ polyphenol and $2{\sim}4%$ caffeine in green tea. Caffeine is a kind of alkaloid containing nitrogen which cause stimulation, impatience, headache, insomnia, low birth weight infant. Because of these negative effect, decaffeined beverage came out and dec...
There are $10{\sim}30%$ polyphenol and $2{\sim}4%$ caffeine in green tea. Caffeine is a kind of alkaloid containing nitrogen which cause stimulation, impatience, headache, insomnia, low birth weight infant. Because of these negative effect, decaffeined beverage came out and decaffeined coffee already have a big market since 1970s. Having proving the physiologic functions of green tea, high consumption of coffee is shifting to green tea. Because of the carcinogenic effect of the organic solvents, decaffeine processing with supercritical carbon dioxide has industrialized and have an advantage in environment-friendly and minimized flavor loss. Decaffeined green tea using supercritical carbon dioxide is considered to be safe but there are not enough study, We investigated the chromosome aberration test with mammalian cell line, CHL. When the cells were treated with 5000, 2000, 1000 ${\mu}g/ml$ and compared with the negative controls, there were no significant (P>0.05) increased chromosome aberration. Same results was observed when adding S9 mixture or not. As a result, water extract of decaffeined green tea using supercritical carbon dioxide does not induce chromosome aberration.
There are $10{\sim}30%$ polyphenol and $2{\sim}4%$ caffeine in green tea. Caffeine is a kind of alkaloid containing nitrogen which cause stimulation, impatience, headache, insomnia, low birth weight infant. Because of these negative effect, decaffeined beverage came out and decaffeined coffee already have a big market since 1970s. Having proving the physiologic functions of green tea, high consumption of coffee is shifting to green tea. Because of the carcinogenic effect of the organic solvents, decaffeine processing with supercritical carbon dioxide has industrialized and have an advantage in environment-friendly and minimized flavor loss. Decaffeined green tea using supercritical carbon dioxide is considered to be safe but there are not enough study, We investigated the chromosome aberration test with mammalian cell line, CHL. When the cells were treated with 5000, 2000, 1000 ${\mu}g/ml$ and compared with the negative controls, there were no significant (P>0.05) increased chromosome aberration. Same results was observed when adding S9 mixture or not. As a result, water extract of decaffeined green tea using supercritical carbon dioxide does not induce chromosome aberration.
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문제 정의
따라서 본 연구진은 초임계 이산화탄소를 이용한 탈카페인 녹차의 안전성을 확인하기 위하여 탈카페인녹차 열수 추출물을 포유동물 세포주 (Chinese hamster lung fibroblast)에 노출시켜 염색체 이상 빈도를 측정함으로서 시험물질의 유전독성을 평가하였다.
제안 방법
CHL celle Eagle's minimal essential medium (EMEM)에 10% fetal bovine serum (FBS)와 1% antibiotic 용액 (Streptomycin/Fenicillin)을 첨가하여 배양액으로 사용하였고 포화습도 하에서 5% CO?를 공급하는 37℃ 배양기에서 배양하였다.
검체는 다음과 같은 방법으로 제작하였다. CHL 세포를 60 mm의 petri-dish에 5 x IO, cel 1/5 ml가 되도록 분주하고 단층세포를 만든 다음, 각각 음성대조물질, 시험물질 및 양성대조 물질을 함유하는 배양액으로 교환하여 6시간 배양한 후 신선한 배지로 교환하여 총 배양시간이 24시간이 되도록 하였다. S9 혼합물을 처리한 경우에는 S9 혼합물을 포함한 배양액과 시험물질 또는 양성대조물질을 혼합하여 각각 처리하였다.
S9 혼합물을 처리한 경우에는 S9 혼합물을 포함한 배양액과 시험물질 또는 양성대조물질을 혼합하여 각각 처리하였다. 각 petri-dish에 세포를 수거하기 2시간 전에 0.25 의 Colcemid를 처리한 다음 세포를 수거하여 검체를 제작하였다.
관찰하였다. 각 검체 당 200개의 세포분열 중기상세포를 관찰하여 염색체 구조이상 (Structural aberration)과 수적 이상 (Numerical aberration) 유무를 관찰하였다. 구조이상은 염색분체형 (Chromatid type)과 염색체형 (Chromosome type) 으로 구분하여 계수하였다.
5 ml의 고정액 으로 3회 고정시킨 후 공기건조법으로 검체를 제작하고 5% Giemsa 염색액으로 10분간 염색하여 탈 이온수로 2~3회 씻 은 후 건조하였다. 각 군 당 염색상태가 양호한 검체를 선 택하여 현미경으로 관찰하였다.
검체는 처리 종료 시각에 각 petri-dish로부터 배양액을 제거흐］•고 PBS (Phosphate buffered saline)로 세척한 후 0.005% Trypsin ED1AS- 세포를 수거하였다. 수거한 세포 를 75mM KCl 용액 7 ml에 현탁시켜 3KC에서 30분간 처리한 후 냉각고정액 (Methyl alchol: Glacial acetic acid = 3 : 1)을 1 ml 혼합하여 10분간 고정하였다.
각 검체 당 200개의 세포분열 중기상세포를 관찰하여 염색체 구조이상 (Structural aberration)과 수적 이상 (Numerical aberration) 유무를 관찰하였다. 구조이상은 염색분체형 (Chromatid type)과 염색체형 (Chromosome type) 으로 구분하여 계수하였다.
있었다. 녹차 및 탈카페인녹차의 caffeine, EGCQ EGC, EC, ECG에 대한 성분분석을 decafifeine 정도에 따라 HPLCS- 수행하였다. Decafifeine을 하지 않은 녹차의 경우에 caffeine과 catechin 성분의 합을 100%로 보았을 때 canine이 13.
염색체이상시험은 OECD와 Ishidate & Odashima (1977) 의 방법을 조금 변형한 방법을 사용하였다.
위의 방법으로 제작된 검체를 현미경하에서 1000배의 배율로 관찰하였다. 각 검체 당 200개의 세포분열 중기상세포를 관찰하여 염색체 구조이상 (Structural aberration)과 수적 이상 (Numerical aberration) 유무를 관찰하였다.
초임계추출법에 의해 디카페 인 된 녹차 추출물을 100에서 5000 曲/血까지 7개 농도에서 용량 결정시험을 실시하여 S9 무첨가군과 S9 첨가군에서 각각 세포분열을 50% 억제하는 농도를 최고 농도로 설정하여 실험을 실시하였다. 최고농도인 5000 |ig/ml에서도 50% 이상의 세포가 생존했기 때문에5000 을 최고농도로 설정하였다.
탈카페 인녹차 열수추출물은 세포배양액에 녹여 1%의 비율로 첨가하여 실험하였다. Mytomycin C (MMC)는 S9 무첨가 군에서, Cyclophosphamide (CP)는 S9 첨가군에서 양성대조물질로 사용하였으며 MMC와 CP는 모두 세포배양액에 녹여 사용하였다.
대상 데이터
첨가하여 실험하였다. Mytomycin C (MMC)는 S9 무첨가 군에서, Cyclophosphamide (CP)는 S9 첨가군에서 양성대조물질로 사용하였으며 MMC와 CP는 모두 세포배양액에 녹여 사용하였다. MM% 1 μg/ml의 농도로 처리하였고 CP는 10|ig/ml의 농도로 처리하여 사용하였다.
고려대학교 식품생물공정 실험실에서 생산된 탈카페인 녹차를 열수추출하여 얻은 연갈색 분말을 차광상태로 냉장보관 하였으며 실험실시 당일 필요한 시료의 질량을 정확히 측량하여 고압멸균 후 세포배양액에 용해시켜 여과하여 사용하였다.
염색체 이상 시험에 광범위하게 사용되고 있어 기초자료가 풍부한 Chinese hamster lung fibroblast (CHL)을 ATCC (American Type Culture Collection)를 통하여 분양받아 사용하였다. CHL celle Eagle's minimal essential medium (EMEM)에 10% fetal bovine serum (FBS)와 1% antibiotic 용액 (Streptomycin/Fenicillin)을 첨가하여 배양액으로 사용하였고 포화습도 하에서 5% CO?를 공급하는 37℃ 배양기에서 배양하였다.
데이터처리
결과의 판정은 200개의 중기 분열상을 관찰한 후 염색체 이상을 가진 세포의 출현율을 계산하여 대조군에 비해 유의성 있게 증가한 경우를 양성으로 판정하였으며, PM0.05의 유의수준에서 Fisher's exact test를 이용하여 통계처리 하였다.
성능/효과
녹차 및 탈카페인녹차의 caffeine, EGCQ EGC, EC, ECG에 대한 성분분석을 decafifeine 정도에 따라 HPLCS- 수행하였다. Decafifeine을 하지 않은 녹차의 경우에 caffeine과 catechin 성분의 합을 100%로 보았을 때 canine이 13.7%의 함량비를 가지고 있었던 것에 비해서 decafifeine 된 녹차의 경우 2.2% 정도로 줄어들었으며 반대로 EGCG의 함량비는 decaffeined- 하지 않았을 경우 48.2% 에서 decaffeine 후 57%로 증가하였다. EGC, EC, ECG도 근소하지만 함량키가 증가하는 결과를 얻었다 (Fig.
2% 에서 decaffeine 후 57%로 증가하였다. EGC, EC, ECG도 근소하지만 함량키가 증가하는 결과를 얻었다 (Fig. 1).
05) 증가를 나타내지 않았다. S9 혼합물과 함께 처리한 양성대조물질 (CP)은 51.0%, S9 혼합물을 첨가하지 않은 양성대조물질 (MMC)도 43.0%로서 현저한 염색체이상을 유발하였다 (각각 P< 0.001). (Table 1) 실험조건에 따른 염색체이상의 종류는 Table 3에 기록하였다.
S9 혼합물을 첨가하지 않고 시험물질을 24시간 동안 연속처리한 경우도 5000, 2000, 1000 昭/ml의 농도에서 염색체의 구조적 이상빈도가 1.0, 0.5, 0.5%로 통계적으로 유의한 증가를 보이지 않았고 (P>0.05), 양성대조물질 MMC를 처리한 군은 50.0%로서 현저한 염색체이상이 관찰되었다 (P<0.001). (Table 2) 실험조건에 따른 염색체이상의 종류는 Table 4에 기록하였다.
따라서, 시험물질인 탈카페인녹차의 열수추출물은 본 시험 조건 하에서 CH工 세포에 대한 염색체이상을 일으키지 않는 물질로 평가된다.
본 연구진이 초임계 이산화탄소를 이용하여 제조한 탈카페인 녹차는 기존의 녹차에 비해서 카페인을 93%까지 제거할 수 있었다. 녹차 및 탈카페인녹차의 caffeine, EGCQ EGC, EC, ECG에 대한 성분분석을 decafifeine 정도에 따라 HPLCS- 수행하였다.
위의 결과에서 양성대 조물질인 cyclophosphamide와 mitomycin C는 각각의 조건에서 현저한 염색체이상을 유발하여 S9 혼합물의 유효성분과 본 시험 시스템의 민감성이 입증되었고, 음성대조군인 용매처리 군에서도 염색체 이상세포 수가시험 적합성 판정범위 내로 평가되어 본 시험의 타당성이 입증되었다. 따라서, 시험물질인 탈카페인녹차의 열수추출물은 본 시험 조건 하에서 CH工 세포에 대한 염색체이상을 일으키지 않는 물질로 평가된다.
참고문헌 (19)
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