대두 calmoduine유전자 SCaM-5를 발현하는 형질전환 토마토의 병 저항성 검정 CaM-5, a soybean calmodulin, is required for disease resistance against both a bacterial and fungal pathogen in tomato, Lycopersicum esculentum원문보기
농작물 생산에 있어서 병원균 침입에 의한 피해를 줄이는 것은 아주 중요한 과제이다. 식물은 스스로도 생체 방어 신호 전달 기작을 가지고 있지만 그 피해를 줄이는데 있어서 한계가 있다. 본 연구는 콩과 식물에서 분리한 식물생체방어 신호전달 유전자인 SCaM-5를 토마토에 형질전환하여 형질전환 식물체를 작성하고 병 저항성에 관한 실험을 수행한 것이다. SCaM-5 유전자가 형질전환 된 토마토에서는 pathogen-related(PR-5) 유전자를 항상 발현시킴으로서 계속적으로 식물 생체방어 신호기작을 활성 시킨다는 사실을 확인하였다. 또한, SCaM-5를 형질전환 시킨 토마토는 식물에 막대한 피해를 주는 중요한 곰팡이 (P. capsici와 F. oxysporm)와 bacteria (Pst DC3000)에 대하여 병 저항성을 가진다는 것을 검증하였다.
농작물 생산에 있어서 병원균 침입에 의한 피해를 줄이는 것은 아주 중요한 과제이다. 식물은 스스로도 생체 방어 신호 전달 기작을 가지고 있지만 그 피해를 줄이는데 있어서 한계가 있다. 본 연구는 콩과 식물에서 분리한 식물생체방어 신호전달 유전자인 SCaM-5를 토마토에 형질전환하여 형질전환 식물체를 작성하고 병 저항성에 관한 실험을 수행한 것이다. SCaM-5 유전자가 형질전환 된 토마토에서는 pathogen-related(PR-5) 유전자를 항상 발현시킴으로서 계속적으로 식물 생체방어 신호기작을 활성 시킨다는 사실을 확인하였다. 또한, SCaM-5를 형질전환 시킨 토마토는 식물에 막대한 피해를 주는 중요한 곰팡이 (P. capsici와 F. oxysporm)와 bacteria (Pst DC3000)에 대하여 병 저항성을 가진다는 것을 검증하였다.
The calmodulin as a Ca$^{2+}$-binding protein mediates cellular Ca$^{2+}$ signals in response to a wide array of stimuli in higher eukaryotes. Plants produce numerous calmodulin isoforms that exhibit differential gene expression patterns and sense different Ca$^{2+}$...
The calmodulin as a Ca$^{2+}$-binding protein mediates cellular Ca$^{2+}$ signals in response to a wide array of stimuli in higher eukaryotes. Plants produce numerous calmodulin isoforms that exhibit differential gene expression patterns and sense different Ca$^{2+}$ signals. SCaM-5 is a soybean calmodulin that is involved in plant defense signaling. Here, we constructed a SCaM-5 CDNA under control of CaMV 35S promoter and transformed it into tomato (Lycopersicon esculentum). The constitutive over-expression of SCaM-5 in tomato plants exhibited a high levels of pathogenesis-related (PR) gene expression, and conferred an enhanced resistance to two fungal pathogen (Phytophthora capsici, Fusarium oxysporum), and a bacterial pathogen, Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000. Thus, this results collectively suggest that SCaM-5 plays an important role in plant defense of tomato.
The calmodulin as a Ca$^{2+}$-binding protein mediates cellular Ca$^{2+}$ signals in response to a wide array of stimuli in higher eukaryotes. Plants produce numerous calmodulin isoforms that exhibit differential gene expression patterns and sense different Ca$^{2+}$ signals. SCaM-5 is a soybean calmodulin that is involved in plant defense signaling. Here, we constructed a SCaM-5 CDNA under control of CaMV 35S promoter and transformed it into tomato (Lycopersicon esculentum). The constitutive over-expression of SCaM-5 in tomato plants exhibited a high levels of pathogenesis-related (PR) gene expression, and conferred an enhanced resistance to two fungal pathogen (Phytophthora capsici, Fusarium oxysporum), and a bacterial pathogen, Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000. Thus, this results collectively suggest that SCaM-5 plays an important role in plant defense of tomato.
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문제 정의
식물체내에서 비 보존적인 SCaM 유전자는 생체내의 방어 신호 전달에 관여한다는 보고 (Heo et al. 1999; Park et al. 2004) 에 근거를 두고 본 연구에서는 SCaM-5 형질전환 토마토를 제작하여 곰팡이와 bacteria 등의 병원균이 침입하였을 때 내성을 가지는지를 연구하였다. 이상의 결과를 바탕으로 하여 SCaM-5의 생체방어 역할을 토마토 형질전환 체에서 검정하고자 본 연구를 수행하였다.
2004) 에 근거를 두고 본 연구에서는 SCaM-5 형질전환 토마토를 제작하여 곰팡이와 bacteria 등의 병원균이 침입하였을 때 내성을 가지는지를 연구하였다. 이상의 결과를 바탕으로 하여 SCaM-5의 생체방어 역할을 토마토 형질전환 체에서 검정하고자 본 연구를 수행하였다.
제안 방법
각각의 형질전환 토마토의 shoot 를 계대시키고 뿌리를 호르몬이 없는 배지에서 키웠다. 1/2 MS 배지에서 키운 형질전환된 토마토 위에 2개의 곰팡이 포자의 agar plugs (직경 0.5 cm정도의 크기)를 올려놓았다. 이렇게 감염시 킨 다음 3일, 5 일.
이렇게 감염시 킨 다음 3일, 5 일. 8일 후에 포자가 형성한 균사의 반지름 직경을 측정하였다. 병원균에 의해 나타나는 증상은 감염 후 7일째부터 조사하기 시작하였다.
In vivo 상에서의 SCaM-5 가 곰팡이 병원균에 대하여 저항성을 가지는지를 관찰하기 위하여 pGA643-SCaM-5 (SCaM-5) 가 도입된 형질전환 토마토와 pGA643 vector (Control)가 도입된 형질전환 토마토에 각각 곰팡이인 P. capsici와 F. oxysporm를 감염시켰다 (Figures 3, 4). MS 배지에 키운 각각의 형질전환 토마토에 P.
oxysporm를 감염시켰다 (Figures 3, 4). MS 배지에 키운 각각의 형질전환 토마토에 P. capsici와 F. axyspom의 포자가 자란 agar plugs 를 옮겨놓았다. 감염시킨 후, 7일째에 갈색의 줄기 고사 (stem rotting; necrosis)가 생기고 줄기의 생장이 보다 작아지는 현상과 같은 병원균에 의한 증상이 나타나기 시작하였다.
oxysporm을 감염시켰다. SCaM-5 가 가장 많이 발현 되어지는 2-4번 식물체와 가장 작게 발현되어지는 4-2번 식물체를 이용하였으며, 대조군으로 pGA643 vector (control) 로 형질전환한 식물체를 이용하였다. 각각의 형질전환 토마토의 shoot 를 계대시키고 뿌리를 호르몬이 없는 배지에서 키웠다.
2% form aldehyde agarose gel 에서 전기영동을 한 뒤, Gel 위에 Gene Screen membrane (NEN, Boston, MA)을 놓고, membrane 에 RNA 를 옮겨주었다. UV cross-linker 를 이용하여 RNA 를 고정을 시 킨 후, Random primer DNA labeling kit (TAKARA)를 사용해 a-[, P]dCTP로 probe 인 SCaM-5 유전자와 PR-5 유전자를 각각 표지하였다. 65°C 에서 hybridization buffer 에서 18 시간 동안 반응시 키고, a-[32P]dCTP 로 labeled priming 된 것을 씻어 주기 위해서 1차적으로 1% SDS, 2 X SSC washing buffer로 65°C에서 15분, 2차적으로 1% SDS, 0.
pGA643 vector의 CaMV 35S promoter 와 577' terminator 영 역사이를 Xgl과 Clal 의 제한효소로 절단한 후 이 미 절단되 어진 SCaM-5 유전자를 그 사이에 연결하였다. pGA643 vector (Control)와 pGA643-SCaM-5 (SCaM-5)를 Agrobacterium tume- faciens LBA4404 에 형질전환 시킨 후, 형질전환된 LBA4404 를 토마토의 자엽 절편체에 감염시켜 형질전환시켰다. 형질전환된 토마토는 shoot 유도배지 (MS 기본배지, IAA 0.
절단시켰다. pGA643 vector의 CaMV 35S promoter 와 577' terminator 영 역사이를 Xgl과 Clal 의 제한효소로 절단한 후 이 미 절단되 어진 SCaM-5 유전자를 그 사이에 연결하였다. pGA643 vector (Control)와 pGA643-SCaM-5 (SCaM-5)를 Agrobacterium tume- faciens LBA4404 에 형질전환 시킨 후, 형질전환된 LBA4404 를 토마토의 자엽 절편체에 감염시켜 형질전환시켰다.
Avirulent Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000 (Pst DC3000)< 감염시키기 위하여 먼저 Pst DC3000 strain 을 배지 (bacto tryptone 10 g/ l, protease peptone 10 g/l, dipo- fassium phosphate 1.5 g/l , Magnesium sulfate 1.5 g, pH 7.0) 에 OD6oo = 1 (2 x 107 cfii/nl)까지 키웠다. OD6oo = 0.
to mato DC3000 (Pst DC3000)를 감염시켰다 (Figure 5). 각각의 형질전환된 토마토의 뿌리를 약간 절단한 후, Pst DC3000 strain을 키운 배지에 담구고 다시 MS 배지에 키워 bacterial pathogen에 대해 나타나는 증상을 관찰하였다. 감염시킨 후 7 일째에 곰팡이에 의해 나타나는 증상과 같은 증상이 나타나기 시작하였다.
식물 형질전환용 vector 를 제작하기 위하여 먼저 SCaM-5 의 coding 된 염기를 Xbal과 CM의 제한효소로 절단시켰다. pGA643 vector의 CaMV 35S promoter 와 577' terminator 영 역사이를 Xgl과 Clal 의 제한효소로 절단한 후 이 미 절단되 어진 SCaM-5 유전자를 그 사이에 연결하였다.
pGA643 vector (control) 형질전환 토마토에서는 SCaM-5가 발현되어 지지 않는 반면에 pGA643-SCaM-5 (SCaM-5) 형질전환 토마토에서는 항상 발현되어져 있다는 사실을 확인하였다 (Figure IB). 이 중에서 SCaM-5 가 많이 발현되어지는 2-4번 토마토 식물체와 적게 발현되어지는 4-2번 토마토 식물체를 가지고 병원균 실험을 하였다.
재조합하였다 (Figure 1A). 이렇게 재조합 되어진 pGA643- SCaM-5 와 pGA643 vector 를 토마토에 형질전환시켰다. 형질 전환된 토마토에서 잎을 따서 RNA를 추출하고 northern blot 분석을 통하여 발현정도를 분석하였다.
토마토 종자를 멸균수로 세척하고 70% 에탄올로 1차 표면소독 후, 1% 왁스 (sodium hypochlorite) 용액으로 20분간 담가 2차 표면소독을 하였다. 그리고 왁스를 제거하기 위해 멸균수로 5 회 반복하여 세척을 하였다.
토마토에서 SCaM-5 에 의해 식물 생체방어 신호전달 기작을 활성화 시키는지를 조사하기 위하여 PR 유전자 (PR -5)가 발현 되어지는지를 northern blot 분석을 통하여 관찰하였다. 그 결과 SCaM-5 가 형질전환된 토마토에서 PR-5 유전자는 항상 발현되어지는 것을 확인하였고 (Figure 2), 따라서 SCaM -5 는 병원균이 침입했을 때와는 상관없이 항상 식물 생체방어 신호기작을 활성화 시킨다는 사실을 증명하였다.
이렇게 재조합 되어진 pGA643- SCaM-5 와 pGA643 vector 를 토마토에 형질전환시켰다. 형질 전환된 토마토에서 잎을 따서 RNA를 추출하고 northern blot 분석을 통하여 발현정도를 분석하였다. pGA643 vector (control) 형질전환 토마토에서는 SCaM-5가 발현되어 지지 않는 반면에 pGA643-SCaM-5 (SCaM-5) 형질전환 토마토에서는 항상 발현되어져 있다는 사실을 확인하였다 (Figure IB).
대상 데이터
SCaM-5 confers resistance against Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000 (Pst DC3000) in transgenic tomato plants. pGA643-SCaM-5 (SCaM-5) or pGA643 vector (Control) tomato plants dipped into solution containing Pst DC3000.
본 논문은 농촌진흥청 바이오그린21사업, 과학재단 특정 기초연구 사업 (#R01-2006-000-10123-0) 및 환경 생명과학 국가 핵심연구센터 (# R15-2003-012-01002-0)의 지원에 의한 결과로 수행되었다.
그리고 왁스를 제거하기 위해 멸균수로 5 회 반복하여 세척을 하였다. 소독한 종자는 MS (Murashige and Skoog 1962) 기본배지에서 심고 형광 빛에서 16시간 암 8시간의 광주기, 25°C의 조건으로 발아시키고 1주일 자란 유식 물체의 자엽 절편체를 식물체 재분화 및 형질전환 재료로 사용하였다.
콩과 식물에서 SCaM-5 유전자를 분리하여 식물의 binary vector 인 pGA643 vector 에 XbaVClal 의 제한 효소를 이용하여 재조합하였다 (Figure 1A). 이렇게 재조합 되어진 pGA643- SCaM-5 와 pGA643 vector 를 토마토에 형질전환시켰다.
토마토 (Lycopersicon esculentum) 형질전환에는 대과종인 서광 (Pink forcer, Seminis Korea) 품 중 을 시용하였다. 토마토 종자를 멸균수로 세척하고 70% 에탄올로 1차 표면소독 후, 1% 왁스 (sodium hypochlorite) 용액으로 20분간 담가 2차 표면소독을 하였다.
이론/모형
pGA643 vector (Control) 와 pGA643-SCaM-5 (SCaM-5) 가 형질 전환된 토마토에서 총 RNA 를 추출하기 위하여 Hong 등 (1987)의 방법으로 하였다. 총 RNA 10 μg을 1.
성능/효과
형질 전환된 토마토에서 잎을 따서 RNA를 추출하고 northern blot 분석을 통하여 발현정도를 분석하였다. pGA643 vector (control) 형질전환 토마토에서는 SCaM-5가 발현되어 지지 않는 반면에 pGA643-SCaM-5 (SCaM-5) 형질전환 토마토에서는 항상 발현되어져 있다는 사실을 확인하였다 (Figure IB). 이 중에서 SCaM-5 가 많이 발현되어지는 2-4번 토마토 식물체와 적게 발현되어지는 4-2번 토마토 식물체를 가지고 병원균 실험을 하였다.
관찰하였다. 그 결과 SCaM-5 가 형질전환된 토마토에서 PR-5 유전자는 항상 발현되어지는 것을 확인하였고 (Figure 2), 따라서 SCaM -5 는 병원균이 침입했을 때와는 상관없이 항상 식물 생체방어 신호기작을 활성화 시킨다는 사실을 증명하였다.
위의 결과와 마찬가지로 control 토마토에서는 잎이 마르고 줄기의 생장이 늦어지면서 고사되어가는 반면 SCaM-5 토마토에서는 이러한 현상이 나타나지 않았다 (Figure 5). 이와 같은 결과를 바탕으로 SCaM-5 유전자는 곰팡이 (P. capsici와 F. oxyspom)와 bacteria (Pst DC3000) 에 의한 병원균 침입에 대한 병저항성 강화에 관여되어진다는 사실을 확인하였다.
후속연구
이러한 제반문제의 해결을 위해서 최근에 식물의 질병을 조절할 수 있는 항 곰팡이성, 내충성 등 병 저항성 유전자를 확보하고자 하는 시도가 전 세계적으로 이루어지고 있다. 유용유전자가 확보 되어지면, DNA 재조합, 형질전환, 분자 육종 기술 등을 통하여 산업화가 가능한 식물체를 개발함으로서 농업생산성을 향상시킬 수 있을 것으로 기대된다 (Lee et al. 2003).
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