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문제 정의
- 또한 형질전환체의 작물학적 특성을 규명하는 방법으로 포장에서의 내병내충성 검정과 수량성 평가에 앞서 향기 측정, 엽색의 명도 차이, 천연 항산화물질 중 하나인 안토시아닌 색소 함량, 형태적인 특성 조사는 유전자 안정성 확보를 위한 형질전환체의 방향 제시에 대한 기초 자료로 검정하고자 하였다.
제안 방법
- 향기분석을 위한 시료는 40mL vial (Supelco, Bellefonte, PA, USA)에 담고 teflon 으로 코팅되어진 septa (PTFE/silicone septa, Supelco)로 밀봉하여 분석하였다. PHGC에 내장된 펌프 를 통한 휘발성 물질의 흡입시간은 10초 컬럼을 통과하는 시간 (Rt: retention time)은 35초였으며 한 개의 시료 분석 후 column의 세척시간은 20초로 하였다. SAW 센서로부터 얻은 frequency pattern과 이를 미분하여 얻은 derivative pattern의 크로마토그램을 Vapor Print™ 이미지 소프트웨어를 이용하여 360° 원형의 Vor print로 변환하였다.
- PHGC에 내장된 펌프 를 통한 휘발성 물질의 흡입시간은 10초 컬럼을 통과하는 시간 (Rt: retention time)은 35초였으며 한 개의 시료 분석 후 column의 세척시간은 20초로 하였다. SAW 센서로부터 얻은 frequency pattern과 이를 미분하여 얻은 derivative pattern의 크로마토그램을 Vapor Print™ 이미지 소프트웨어를 이용하여 360° 원형의 Vor print로 변환하였다.
- 포매된 시료는 Ultramicrotome (LKB)으로 초박절편을만들었고 lead citrate 및 uranyl acetate 에서 전자 염색 후 전자현미경에서 관찰하였다. SEM 시료제작은 TEM과 동일하게 2.5% glutaraldehyde로 고정한 후 알코올 시리즈로 탈수 한 다음 이온 코팅하여 전자현미경으로 관찰 하였다.
- 들깨 잎의 표면 색도는 광학원리에 의해 보다 객관적으로 측정되는 색차계 (Brightmeter Micro S-5, Technidyne corporation, USA)로 엽색을 L(Lightness; Black=0, White=100), a (Red-Green; Red=40, Green=-60), b(Yellow-Blue; Yellow=+60, Blue=-60)값으로 조사하였다. 측정에 사용된 시료는 온실에서 재배된 5번째의 잎을 5장씩 포개어 3반복으로 측정하였다.
- 들깨잎의 방향성 성분을 인간의 후각기능을 디지털화 하여 물리 화학적인 신호를 다중센서 배열의 전자신호로 바꾸어 분석시간별로 면적으로 나타내어 주는 PHGC 로 측정하였다. 분석시간별 추출된 양의 면적에서 차이를 보이지 않았다 (Fig.
- 형질전환체의 방향성 성분 측정을 위해서 온실에서 재배 한 형질전환체의 5 번째 출현 잎 1g 을 분석 직전 가위로 잘 라 vial bottle에 넣어 사용하였다. 방향성 성분은 SAW센서가 장착된 PHGC (Z-NOSE M 4100, Electronic Sensor Technology, Newbury Park, CA, USA)로 측정 하였으며 습도와 상온 의 온도가 일정하게 유지되는 밀폐된 공간에서 실시하였다. PHGC의 He (99.
- 잎의 세포조직학적인 관찰은 SEM (scanning electron microscope, S3000M, Hitachi)과 TEM (Transmission Electron Microscope, H7500, Hitachi)으로 하였으며, TEM 시료 제작은 잎을 약 1x3 mm 크기로 잘라 2.5% glutaraldehyde (2.5% GA in a 50 mM phosphate buffer, pH 7.0) 용액에서 2시간 동안 상온에서 고정하였다. 그 후 1% osmium tetroxide로 상온에서 2시간 처리 및 uranyl acetate 로 4℃에서 overnight 처리한 다음 30-100% 알코올 시리즈로 탈수하여 spun 수지에 포매시켰다.
- 들깨 잎의 표면 색도는 광학원리에 의해 보다 객관적으로 측정되는 색차계 (Brightmeter Micro S-5, Technidyne corporation, USA)로 엽색을 L(Lightness; Black=0, White=100), a (Red-Green; Red=40, Green=-60), b(Yellow-Blue; Yellow=+60, Blue=-60)값으로 조사하였다. 측정에 사용된 시료는 온실에서 재배된 5번째의 잎을 5장씩 포개어 3반복으로 측정하였다. 잎의 안토시아닌 함량은 잎 1g 을 액체질소를 이용 마쇄 한 다음, 1% HCl-MeTH를 20 mL에 현탁 후 filter paper (Toyo, Ltd No.
- 그 후 1% osmium tetroxide로 상온에서 2시간 처리 및 uranyl acetate 로 4℃에서 overnight 처리한 다음 30-100% 알코올 시리즈로 탈수하여 spun 수지에 포매시켰다. 포매된 시료는 Ultramicrotome (LKB)으로 초박절편을만들었고 lead citrate 및 uranyl acetate 에서 전자 염색 후 전자현미경에서 관찰하였다. SEM 시료제작은 TEM과 동일하게 2.
- 분석조건은 펌프에 의해 흡입되어진 휘발성 물질의 밸브 온도는 110℃, GC injection port의 온도는 130℃, column 온도는 30~ 120℃ 까지 3 ℃/sec 속도로 상승시켰으며, SAW 센서의 온도는 30℃ 이었 다. 향기분석을 위한 시료는 40mL vial (Supelco, Bellefonte, PA, USA)에 담고 teflon 으로 코팅되어진 septa (PTFE/silicone septa, Supelco)로 밀봉하여 분석하였다. PHGC에 내장된 펌프 를 통한 휘발성 물질의 흡입시간은 10초 컬럼을 통과하는 시간 (Rt: retention time)은 35초였으며 한 개의 시료 분석 후 column의 세척시간은 20초로 하였다.
- 형질전환체와 모식물간 향의 패턴을 인식하여 분별이 가능한 전자코를 이용하여 향기의 차이를 알아보았다. 들깨잎의 방향성 성분을 인간의 후각기능을 디지털화 하여 물리 화학적인 신호를 다중센서 배열의 전자신호로 바꾸어 분석시간별로 면적으로 나타내어 주는 PHGC 로 측정하였다.
- 형질전환체와 모식물체간의 잎 표면의 색도변화를 색차계로 측정한 바, 형질전환체의 CIE system에 따라 밝기 정E, 적색 정도 황색 정도로 나타내었다. 표준배색판의 L*, a*, b* 값은 각각 35~37, -14.
- 형질전환체의 잎 모양을 조사하기 위해서 T, 및 T2 식물과 모 식물을 온실에서 재배하여 5번째 출현한 잎의 폭과 길이를 vernier caliper (Mituto, Japan)로 개체당 10개씩 3반복으로측정한 후 길이와 폭의 비율로 엽지수 (leaf index)를 계산하였다.
대상 데이터
- 방향성 성분은 SAW센서가 장착된 PHGC (Z-NOSE M 4100, Electronic Sensor Technology, Newbury Park, CA, USA)로 측정 하였으며 습도와 상온 의 온도가 일정하게 유지되는 밀폐된 공간에서 실시하였다. PHGC의 He (99.999%)가스, columne DB-5 capillary (SupeIco, Bellefonte, PA, USA)를 사용하였다. 분석조건은 펌프에 의해 흡입되어진 휘발성 물질의 밸브 온도는 110℃, GC injection port의 온도는 130℃, column 온도는 30~ 120℃ 까지 3 ℃/sec 속도로 상승시켰으며, SAW 센서의 온도는 30℃ 이었 다.
- 본 실험의 재료는 Rot 3 유전자가 발현된 형질전환 개체들 과 이후 계속적으로 본 실험실에서 만들어진 형질 전환 개체 들을 이용하였다(Kim et al. 2006). 형질전환 들깨 (donor plant)는 만백들깨이고, 사용된 Agrobacterium tumefaciens 균주는 binary vector pBI121에 Rot 3 (Kim et al.
- 2006). 형질전환 들깨 (donor plant)는 만백들깨이고, 사용된 Agrobacterium tumefaciens 균주는 binary vector pBI121에 Rot 3 (Kim et al. 1998) 유전자를 가진 LBA4404를 사용하였다. 육성된 Ti과 식물체들은 leaf index로 모양의 차이를 보인 개체들로, Southern 분석이나 PCR에 의해 Rot 3 유전자를 보유한 것으로 확인되었다 (Kim et al.
성능/효과
- 2). 이러한 결과는 도입한 R" 3 유전자가 잎의 형태적 특성 외에방향성 성분에는 영향을 미치지 않는 예로 형질전환체와 모식물간 향의 패턴보다 잎의 저장기간, 저장온도 차이에 따른분석시간대별 추출된 양의 면적에 차이를 보였을 뿐이다(data not shown).
- 1), 엽형의 변화 (Table 1)와 농업적인 형질 (Fig. 1) 등을 조사 한바, 잎 모양에서 모식물은 심장형인데 비해 형질 전환에서는 둥근 것과 장타원형의 잎을 가진 개체가 1 및 T2 세대에서 관찰되었다. 형질전환체와 모식물간의 세포학적 특성은 pavement cell의 크기와 모양 그리고 세포벽을 따라 배열된 세포의 크기와 모양이 다른 것이 확인 되었는데, 이는 애기장대에서 Rot 3 유전자를 가진 형질전환 계통은 책상세포 (palisade cell)의 폭은 변하지 않았지만 길이는 늘어났다고 한 Kim et al.
- 수 있었다. 5번째 출현 잎에서의 엽지수는 모본인 '만백들깨, 는 1.30 이었으나 형질전환체는 평균이 1.01-1.66 사이에 분포하여 Rot 3 유전자 도입에 의하여 잎 모양이 변형된 것을 알 수 있었다. 잎의 크기는 가변성의 형질로서 모식물의 재배환경이나 생리적인 상태에 영향을 받는 것으로 알려져 있다.
- (2002)의 보고와 잎의 형태면에서 유사한 경향이었다. 일부 잎의 성분 분석 결과로 볼 때, 형질전환체에서 분석된 잎의 방향성 성분 (Fig. 2), 색도 (Table 2), 그리고 안토시아닌 함량 (Table 3)을 모식물체의 잎과 비교했을 때 유의성이 인정되지 않았다. 이 결과로부터 Rot 3 유전자가 잎의 형태적 특성 변화에는 관여를 하였지만 이들 성분의 변화에는 영향을 미치지 않은 것으로 판단되며 (Lee et al.
- 형질전환체 (, )의 잎 모양에 대한 형태적 특성을 육안으로 관찰한 바(Table 1), 정상형, 둥근형 그리고 장타원형으로분류할 수 있었다. 5번째 출현 잎에서의 엽지수는 모본인 '만백들깨, 는 1.
후속연구
- kr)에 이르고있을 정도의 고수익성 환금작물로 부각되고 있어서 향후 재배면적이 증가할 것으로 전망된다. 이러한 엽실용 들깨의 용도 다양화를 위해서는 리놀렌산(linolenic acid) 함량(Lee et al. 2002)과 항산화작용을 하는 안토시아닌 색소 (Jung et al. 1998)와 같은 유용 성분 증대도 중요 하지만 잎의 모양과 같은 형태적 특성도 다양한 소비자의 기호 향상에 크게 기여할 것으로 추정된다.
- 이상에서 실험결과를 보면 잎 들깨의 상업적 가치를 높이기 위하여 Rot 3 유전자의 도입으로 잎모양이 변형된 형질전환체와 모식물의 후대검정에서 방향성, 색도, 안토시아닌 함량 등은 모식물체와 같은 양상을 보였으나, 형질전환체의 엽지수와 SEM과 TEM에 의해 관찰된 세포조직학 특성은 모식기능성 잎들깨 품종을 개발하기 위해서는 Rot 3 유전자의 발현에 따른 후대의 작물학적인 특성을 계속 분석할 필요성이있으며, 일반적인 재배특징과 잎모양이 변형된 개체를 개발하기 위해서는 잡종 집단을 만들어 분자마커로서 screening하여 유용한 유전자를 조기에 고정하는 분자육종체계를 확립하는 한편 획득한 형질전환체의 포장재배시 다양한 환경조건에따른 도입유전자의 안정성 검토를 계속 연구되어야 할 것으로 사료된다.
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