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문제 정의
- 그 후 2004년 경상북도 구미시에서 생육이 불량한국화의 뿌리에서 뿌리혹병의 발생을 재확인하였으며 현재까지 국화재배지에서 산발적으로 뿌리혹병의 발생이 확인되고 있다. 본 연구는 화성시와 구미시에서 국화의 뿌리혹병을 일으킨 병원성 Agrobacterium종들의 분류학적 위치를 결정하고 세균학적 특성을 조사하여 방제의 기초자료로 활용코자 하였다. 현재 Agrobacterium속의 분류 .
제안 방법
- 탄소원 이용성 분석. Tryptic soy agar(TSA) 배지에 도말하여 28℃에서 24시간 배양 후 면봉을 이용하여 채취한 균을 0.85% 생리식염수 용액에 넣고 현탁하여 3X108 CFU/m/ 농도로 조절하였다. 세균 현탁액을 각각 GN2 MicroPlate™(Biolog, Inc.
- 명명에 다양한 논란이 있지만 본 연구에서는 병원성에 기초한 인위분류(Kersters와 De Ley, 1984)와 Young 등 (2001)에 의해 제안된 자연 . 계통분류 방식을 부분적으로 적용하였다.
- 기주범위. 국화에서 분리한 병원성 균주들을 6가지 식물의 줄기와 당근의 뿌리에 상처 접종하여 병원성 차이를 비교하였다. 균주별로 혹 형성 정도에 차이가 있었는데 type A에 속하는 균주들은 포도를 제외한 대부분 의식물체에서 강한 병원성을 나타낸 반면, type B에 속하는 균주들은 type A에 비해 국화, 장미, 호박에서 병원성이 약했다.
- 세균분리 및 병원성검정. 국화의 줄기와 뿌리에 발생한 10개의 신선한 혹을 채집하여 세균을 분리하였다. 채집한 혹은 수돗물로 표면을 깨끗이 씻어내고 70% 에틸알콜과 1% 차아염소산나트륨(NaOCl)으로 표면 소독 후 멸균증류수로 3회 씻고 건조시켰다.
- jangsootozwa')을 이용하였다. 담배, 당근, 토마토, 호박은 원예용 상토(바로커, 서울바이오(주))가 담긴 포트에 종자를 직접 파종하였고 국화, 장미, 포도나무는 삽목 하였으며 모든 식물체는 본엽이 4~5 매 전개되었을 때 접종용으로 이용하였다. 병원성 검정과 동일한 방법으로 접종 후 혹 형성 정도를 조사하였다.
- 5 cm)에 5 cm 정도의 삽수를 삽목하여 본엽이 4~5매 완전히 전개되었을 때 접종용으로 사용하였다. 병원균은 0.5% CaCQ가첨가된 PDA 배지에 도말하여 28℃에서 24시간 배양 후 멸균증류수에 현탁하여 농도(ODegaO.l)를 조절하였으며 유묘의 줄기하부에 상처를 내고 10 M씩 접종하였다. 접종부위를 비닐로 감싸고 25℃로 조절된 습실상(상대습도, 100%)에 24시간 둔 후 온실에 유지하면서 혹 형성 정도를 조사하였다.
- 담배, 당근, 토마토, 호박은 원예용 상토(바로커, 서울바이오(주))가 담긴 포트에 종자를 직접 파종하였고 국화, 장미, 포도나무는 삽목 하였으며 모든 식물체는 본엽이 4~5 매 전개되었을 때 접종용으로 이용하였다. 병원성 검정과 동일한 방법으로 접종 후 혹 형성 정도를 조사하였다.
- 지방산 조성. 병원성 균주간의 지방산 조성비교는 MIDI 시스템을 이용하여 비교하였다. Type A에 속하는 6개의 균주는 A.
- rubi KACC10739는 한국 농용미생물 보존센터 (KACC, Korean Agricultural Culture Collection) 에서 분양 받아 사용하였다. 병원성 균주의 형태는 0.1% uranyl acetate로 염색하여 투과전자현미경으로 관찰하였다. 배양적, 생리 .
- 85% 생리식염수 용액에 넣고 현탁하여 3X108 CFU/m/ 농도로 조절하였다. 세균 현탁액을 각각 GN2 MicroPlate™(Biolog, Inc., Hayward, Calif.)의 96 well에 150 μl씩 분주하였으며 2WC에서 24시간 배양 후 MicroLog™ 3-Automated Microstation system을 이용하여 탄소원 산화 여부를 조사하였으며 MicroLog Gram-negative database (ver. 4.02)와 연결하여 동정하였다.
- rubi를 제외한 3종은 종내 또는 종간에서로 다른 특성을 가진 계통이 존재하여 인위분류체계에대한 문제점이 지적되어왔다. 이후 병원성에 근거한 인위분류, 속수준의 계통분류 및 자연분류 방법을 병행하여 5종(4 tumefaciens, A. rhizogenese A. vitis, A. rubi, A. larrymoorei)으로 분류 . 명명하였으나 최근 분자생물학에 의한 분류학의 발달로 콩과식물에 근류혹을 형성하는 세균과 통합하여 Rhizobism속으로 재분류되고 있다(Kersters 와 De Ley, 1984; Sawada 등, 1993; Young 등, 2001).
- 5 ml의 멸균증류수가 들어있는 Eppendorf tube에 넣고 살균된 메스를 이용하여 마쇄한 후 실온에서 30분 정도 두었다. 전처리된 현탁액을 0.5% CaCQ가 첨가된 potato dextrose agar(PDA, Difco) 배지와 DIM agar 배지(Perry와 Kado, 1982)에 각각 도말하였으며 28℃에서 2~5일간 배양하면서 콜로니의 형태, 색상, 생육속도, 발생 빈도 등을 기준으로 Agrobacteriwn과 유사한 콜로니를 선별하여 순수분리 과정을 거쳤다. 분리된 세균은 10% 글리세롤에 현탁하여 -70℃ 초저온 냉동고에 장기 보존하였으며, 실험에 사용한 균주들은 0.
- l)를 조절하였으며 유묘의 줄기하부에 상처를 내고 10 M씩 접종하였다. 접종부위를 비닐로 감싸고 25℃로 조절된 습실상(상대습도, 100%)에 24시간 둔 후 온실에 유지하면서 혹 형성 정도를 조사하였다.
대상 데이터
- tRedsandra, ), 토마토.(Lycopersicon esculentum cv. 'Seogwang'), 포도나무(vitis vinifera cv. 'Kyoho'), 호박 (Cucurbita moschata cv. jangsootozwa')을 이용하였다. 담배, 당근, 토마토, 호박은 원예용 상토(바로커, 서울바이오(주))가 담긴 포트에 종자를 직접 파종하였고 국화, 장미, 포도나무는 삽목 하였으며 모든 식물체는 본엽이 4~5 매 전개되었을 때 접종용으로 이용하였다.
- 생화학적 특성을 조사한 결과, 모든 균주는 2% NaCl에서 생장하였고 litmus milk에서 알칼리활성을 나타냈으며 oxidase 반응이 양성인 반면, CaCO3 와 erythritol이 첨가된 배지에서는 산을 생성하지 않았으며, tartaric acid와 mucic acid가 첨가된 배지에서는 알칼리를 생성하지 않았다. Type A와 type B에 속하는 8개 균주는 3-ketolactose 생산, pH 7.0에서 운동성, 35℃ 생장, melezitose로부터 산 생성, ferric ammonium citrate 반응이 양성으로 대조균주로 사용한 A. tumefaciens KACC10736 과 동일한 반응을 보였으며 type A에 속하는 4개 균주 (YK3505, YK3510, YK3524, YK3536)는 citrate를 이용하였다. Type C에 속하는 1개의 균주는 malonic acid가 첨가된 배지에서 알칼리를 생성하였으나 3-ketolactose 생산과 35℃ 생장, melezitose로부터 산생성, ferric ammonium citrate 반응이 음성으로서 대조균주로 사용한 A.
- 분리세균의 병원성은 국화(Dendranthema grandiflorum cv. Lerbin) 유묘를 이용하였다. 원예용상토(바로커, 서울바이오(주))가 담긴 포트(직경 10.
- 병원세균의 동정. 분리한 20개 균주 중에서 국화의 줄기에 접종하여 병원성이 확인된 9개의 병원성 균주를 실험에 사용하였다. Type A(YK3505, YK3508, YK3510, YK3512, YK3524, YK3536)와 type C(YK3529)에 속하는 7개의 균주는 국화의 줄기혹에서 분리한 균주이며, type B(YK6136, YK6138)에 속하는 2개의 균주는 국화의 뿌리에서 분리한 것이다.
- Lerbin) 유묘를 이용하였다. 원예용상토(바로커, 서울바이오(주))가 담긴 포트(직경 10.5 cm, 높이 8.5 cm)에 5 cm 정도의 삽수를 삽목하여 본엽이 4~5매 완전히 전개되었을 때 접종용으로 사용하였다. 병원균은 0.
- Type A(YK3505, YK3508, YK3510, YK3512, YK3524, YK3536)와 type C(YK3529)에 속하는 7개의 균주는 국화의 줄기혹에서 분리한 균주이며, type B(YK6136, YK6138)에 속하는 2개의 균주는 국화의 뿌리에서 분리한 것이다. 표준균주로 사용한 A. tumefaciens KACC10736과 A. rubi KACC10739는 한국 농용미생물 보존센터 (KACC, Korean Agricultural Culture Collection) 에서 분양 받아 사용하였다. 병원성 균주의 형태는 0.
데이터처리
- 각 균주의 지방산 조성은 midi Library ver. TSBA 3.90과 Library Generation system software(ver.3.90)를 이용하여 분석하였다.
- 세균분리 및 병원성검정. 국화의 줄기와 뿌리에 발생한 10개의 신선한 혹을 채집하여 세균을 분리하였다.
이론/모형
- 현재 Agrobacterium속의 분류 . 명명에 다양한 논란이 있지만 본 연구에서는 병원성에 기초한 인위분류(Kersters와 De Ley, 1984)와 Young 등 (2001)에 의해 제안된 자연 . 계통분류 방식을 부분적으로 적용하였다.
- 지방산함량 분석. 병원성이 확인된 세균을 TSA 배지에 도말 후 28℃에서 24시간 배양한 다음 4 루프 정도의량을 시험관(직경 1.3 cm, 높이 10 cm)에 옮긴 후 Miller (1982)의 방법에 따라 지방산을 추출하였으며 MIDI (Microbial ID, Inc., Newark, DE) GC system을 이용하여 분석하였다. 각 균주의 지방산 조성은 midi Library ver.
- 배양적, 생리 .생화학적 특성은 Schaad 등(2001)의 방법에 따라 조사하였으며 부가적으로 PDA-CaCO3(Bouzar 와 Jones, 1992)오+ mannitol-CaCO3 배지 (Bouzar 등, 1995)상에서 산 생산 유무를 조사하였다.
성능/효과
- (Bouzar 등, 1993). 본 실험에서도 국화에서 분리된 병원성 Agrobacterium 세균들은 전체 지방산 함량의 약 72%가 cw-vaccenic 로 타 지방산에 비해 월등히 높았으며 3-hydroxypalmitic acid(16:0 3OH)와 palmitic acid(16:0) 함량은 종이나 type별로 차이가 있었지만 type A와 B는 A. tumefaciens, type C는 A. mZ"와 유사한 지방산 조성을 가지고 있었다.
- 동정. 16시간 정도 배양된 병원성 세균들을 투과전자현미경으로 관찰하였을 때, 모든 세균은 다수의 편모를 가진 간균이었으며 type A와 B에 속하는 균들은 type C 균주보다 편모가 많았다(Fig. IE, 1H). 모든 세균들은 그람 음성이면서 호기적으로 생장하였으며 DIM agar에서도 생장하였다.
- 탄소원 이용 양상. Biolog 동정 시스템에서 type A에 속하는 6개 균주는 배양 24시간 후 A. tumefaciens와 74- 100%의 확률로 51.3~78.4%의 유사도를 나타냈으며, type B에 속하는 2개 균주는 A. tumefaciens와 87~100%의 확률로 63.1 ~82.0%의 유사도를 나타낸 반면 type C에 속하는 1개 균주는 A. tumejAciens와 32.3%의 낮은 유사도를 나타냈다. Type A와 B는 대조균주로 사용한 A.
- 병원성 균주간의 지방산 조성비교는 MIDI 시스템을 이용하여 비교하였다. Type A에 속하는 6개의 균주는 A. tumefaciens와 54.0~90.9%의 유사도를 type B 에 속하는 2개의 균주는 A. tumefaciens와 84.7~89.0%의유사도를 나타낸 반면 type C에 속하는 1개 균주는 A.tumefaciens와 71.3%의 유사도를 나타냈으며 A. rubi와도 64.1%의 유사도를 나타냈다. Type A와 B는 대조 균으로 사용한 A.
- rubi와 지방산 조성이 유사하였다. Type A와 B 사이에는 아주 유사한 지방산 조성 비율을 가지고 있었으며, 대조균주로 사용한 A. tumefacien에 비해 hydroxy acid 계통의 3- hydroxypalmitic acid(16:0 3OH) 함량비율이 상대적으로 높은 반면, unsaturated acid 계통의 cw-vaccenic acid (18:1e7cis) 함량이 낮았으며 cyclopropane 계통의 lactobacillic (19:0 cycloe8cis) 함량이 절대적으로 낮았다. Type C에 속하는 균주는 타 균주들에 비해 saturated acid 계통의 palmitic acid(16:0)의 조성비율이 높았으며 A.
- 국화에서 분리한 병원성 균주들을 6가지 식물의 줄기와 당근의 뿌리에 상처 접종하여 병원성 차이를 비교하였다. 균주별로 혹 형성 정도에 차이가 있었는데 type A에 속하는 균주들은 포도를 제외한 대부분 의식물체에서 강한 병원성을 나타낸 반면, type B에 속하는 균주들은 type A에 비해 국화, 장미, 호박에서 병원성이 약했다. Type C에 속하는 균주는 당근, 담배, 토마토에 병원성이 강한 반면, 호박에서는 병원성이 약했으며, 장미와 포도나무에서는 병원성이 없었다.
- Type C에 속하는 균주는 당근, 담배, 토마토에 병원성이 강한 반면, 호박에서는 병원성이 약했으며, 장미와 포도나무에서는 병원성이 없었다. 대조균주로 사용한 A. tumefacSs와 A. rubi는 모든 식물에 병원성이 있었으며 식물종류에 따라 혹 형성정도에 차이가 있었다 (Table 4). 본 연구에서 type C 균주의 병원성은 일부 식물에 제한되어 있었지만 기주식물에 대한 병원성으로 계통이나 종을 구별할 수는 없었다.
- rubi KACC10739와 표현 형적 특성이 유사하였다. 또한 추가적으로 실시한 16S rDNA 유전자 염기서열분석에서 YK3529 균주는 표준균주인 A. rubi IFO1326f(D01259)와 99.4%의 염기서열 상동성으로 유연관계가 높았다. 동일 속내 다른 종들과는 94.
- IE, 1H). 모든 세균들은 그람 음성이면서 호기적으로 생장하였으며 DIM agar에서도 생장하였다. King's medium B(KB)에서 형광색소를 생성하지 않았으며 yeast extract-dextrose-CaCO3 (YDC) 또는 nutrient-broth yeast extract agar(NBY)에서 노란색이나 오렌지색의 콜로니도 생성하지 않았다.
- rubi는 모든 식물에 병원성이 있었으며 식물종류에 따라 혹 형성정도에 차이가 있었다 (Table 4). 본 연구에서 type C 균주의 병원성은 일부 식물에 제한되어 있었지만 기주식물에 대한 병원성으로 계통이나 종을 구별할 수는 없었다.
- ebi는。싱니curonic acid, glucose-1 -phosphate, glucose-6-phosphate< 이용하지 않는다(Bouzar 등, 1993). 본 연구에서도 type A, B, A. tumefaciens KACC10736은 A. tumefaciens와 type C, A. rubi KACC10739는 A. rubi와 유사한 반응을 나타냈으므로 종을 분류함에 특별한 문제는 없다고 본다.
- 1G). 분리된 20개의 균주를 국화의 줄기에 상처 접종하였을 때 9개 균주는 2~4주내에 접종 부위에서 유백색의 전형적인 혹을 형성하였으며 시간이 지남에 따라 혹의 표면이 갈변되었으며 형성된 혹은 균주계통이나 종류에 관계없이 유사하였다(Fig. 1C, IF).
- 뿌리혹병균의 종명을 결정하기위하여 3-ketolactose 생산 등 15가지의 생리 . 생화학적 특성을 조사한 결과, 모든 균주는 2% NaCl에서 생장하였고 litmus milk에서 알칼리활성을 나타냈으며 oxidase 반응이 양성인 반면, CaCO3 와 erythritol이 첨가된 배지에서는 산을 생성하지 않았으며, tartaric acid와 mucic acid가 첨가된 배지에서는 알칼리를 생성하지 않았다. Type A와 type B에 속하는 8개 균주는 3-ketolactose 생산, pH 7.
- 뿌리와 줄기에 형성된 혹의 모양과 색은 상이하였으나 표면이 거칠고 갈변된 타원형이었다. 이들 혹으로부터 분리된 세균들 중에서 A. twnefaciens에 속하는 균들은 CaCQ가 첨가된 PDA 배지에서 생장이 양호하였으며 등글면서 볼록하고 반짝이면서 다소 묽고 진한 크림색이었다(Fig. ID). 반면 A.
- rubi로 동정되어야 한다. 이상의 결과로 국화에서 분리된 3가지 계통의 병원균은 A. rubi와 A. 로 동정 되었다., Agmbacteriumn속에 의한 국화뿌리혹병은 국내에서 처음 보고되는 것이며, A.
- 이상의 결과로 국화의 혹에서 분리된 병원성 Agrobacterium 세균들 중 type A와 B에 속하는 8개 균주는 A. twmejaciens로 동정되었다. Type C에 속하는 YK3529 균주는 대조균주로 사용한 A.
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