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문제 정의
- 2003년 저자들은 대전광역시 유성 구에 소재 하는 화훼판매 점 의 벤자민고무나무에서 뿌리혹병의 발생을 확인하였다. 따라서 본 연구는 벤자민고무나무에서 분리된 병원성종들의 분류학적 위치를 결정하고 균학적 특성을 조사하여 방제의 기초자료로 활용하고자 하였다. 현재 Agrobactefinn의 분류 .
제안 방법
- 기주범위. 2계통의 병원성 균주를 6가지 식물의 줄기와 당근의 뿌리에 상처접종하여 병원성 차이를 비교하였다. 2개 균주의 병원성 반응은 유사하였으며 포도나무에서는 혹이 형성되지 않았다.
- 병원세균의 동정. 3가지 계통의 병원균 중 현재까지 보고된 Agrobacferium종과 일치하지 않는 YK6109 균주를 제외한 2가지 계통(YK6110, YK6112)의 병원균에 대하여 분류학적 특성을 조사하였다. 병원균의 형태를 투과전자현미경으로 조사한 결과, 2종류의 세균은 다수의 편모를 가진 간균이었으나 형태적으로 차이가 있었다(Fig.
- 탄소원 이용성 분석. Tryptic soy agar(TSA) 배지에 도말하여 28℃에서 24시간 배양한 세균을 채취하여 0.85% 생리식염수 용액에 넣고 현탁하여 3X108 CFU/m/ 농도로 조절하였다. 세균 현탁액을 각각 GN2 MicroPlate (Biolog, Inc.
- 명명에 다양한 논란이 있지만 본 연구에서는 병원성에 기초한 인위분류(Kersters와 De Ley, 1984)와 Young 등 (2001)에 의해 사용된 자연 . 계통분류 방식을 부분적으로 적용하였다.
- 세균의 속명을 결정하기 위하여 그람반응, 호 기적 생장, DIM agar 배지와 4(TC에서 생장유무를 조사하였다. 또한 종명을 결정하기 위하여 ketolactose 생산, pH 7.0에서 운동성, 2% NaCl과 35℃ 생장, litmus milk 반응, 산과 알칼리 생성, ferric ammonium citrate 반응, oxidase 반응, citrate 이용유무를 조사하였다. 부가적으로 PDA-CaCO3 (Bouzar와 Jones, 1992)와 mannitol-CaCO3 배지 (Bouzar등, 1995) 상에서 산 생산 유무를 조사하였다.
- 세균분리 및 병원성검정. 벤자민고무나무의 줄기에 발생한 2개의 혹을 채집하여 세균을 분리하였다. 채집한 혹은 수돗물로 표면을 깨끗이 씻어내고 70% 에틸알콜과 1% 차아염소산나트륨(NaOCl)으로 표면 소독 후 멸균증류수로 3회 씻고 건조시켰다.
- tumefaciens KACC10736은 한국농용미생물보존센터 (KACC, Korean Agricultural Culture Collection)에서 분양 받아 사용하였다. 병원균의 형태는 0.1% uranyl acetate로 염색하여 투과전자현미경으로 관찰하였으며 배양적, 생리.생화학적 특성은 Schaad 등(2001)의 방법에 따라 조사하였다.
- 지방산 조성. 병원성 균주간의 지방산 조성비교는 MIDI 시스템의 분석 결과를 이용하여 비교하였다. YK6110 균주는 A.
- 탄소원 이용 양상. 병원성 균주의 탄소원 이용 양상은 GN2 MicroPlate을 이용하여 조사하였으며 95가지 기질 중에서 41가지 기질에 대한 반응을 비교하였다. Biolog 동정 시스템에서 YK6110 균주는 배양 24시간 후 4 tumefaciense 100%의 확률로 61.
- 0에서 운동성, 2% NaCl과 35℃ 생장, litmus milk 반응, 산과 알칼리 생성, ferric ammonium citrate 반응, oxidase 반응, citrate 이용유무를 조사하였다. 부가적으로 PDA-CaCO3 (Bouzar와 Jones, 1992)와 mannitol-CaCO3 배지 (Bouzar등, 1995) 상에서 산 생산 유무를 조사하였다.
- 5 cm)에 이식하여 본엽이 4~5매 완전히 전개되었을 때 접종용으로 사용하였다. 분리 균은 0.5% CaCQ가 첨가된 PDA 배지에 도말하여 28℃(2에서 24시간 배양 후 멸균증류수에 현탁하여 농도(ODeg r0.1)를 조절하였으며 유묘의 줄기하부에 상처를 내고 10 씩 접종하였다. 접종부위를 비닐로 감싸고 25℃(2로 조절된 습실상(상대습도, 100%)에 24시간 둔 후 온실에 유지하면서 혹 형성 정도를 조사하였다.
- 85% 생리식염수 용액에 넣고 현탁하여 3X108 CFU/m/ 농도로 조절하였다. 세균 현탁액을 각각 GN2 MicroPlate (Biolog, Inc., Hayward, Calif.)의 96 well에 150 씩 분주하였으며 28℃0에서 24시간 배양 후 MicroLog 3-Automated Microstation system을 이용하여 탄소원 산화여부를 조사하였으며 MicroLog Gram-negative database(ver. 4.02)와 연결하여 동정하였다.
- 생화학적 특성은 Schaad 등(2001)의 방법에 따라 조사하였다. 세균의 속명을 결정하기 위하여 그람반응, 호 기적 생장, DIM agar 배지와 4(TC에서 생장유무를 조사하였다. 또한 종명을 결정하기 위하여 ketolactose 생산, pH 7.
- 5 mA의 멸균증류수가 들어있는 Eppendorf tube에 넣고 살균된 메스를 이용하여 마쇄 후 실온에서 30분 정도 두었다. 전처리된 현탁액은 0.5% CaCQ가 첨가된 potato dextrose agar(PDA, Difco) 배지와 DIM agar 배지(Peny와 Kado, 1982)에 각각 도말하였으며 28℃(2에서 2~5일간 배양하면서 콜로니의 형태, 색상, 생육속도, 발생 빈도 등을 고려하여 4grobacterium과 유사한 콜로니를 선별하여 순수분리 과정을 거쳤다. 분리된 세균은 10% 글리세롤에 현탁하여 -70℃초저온 냉동고에 장기 보존하였으며, 실험에 사용된 균주들은 0.
- 1)를 조절하였으며 유묘의 줄기하부에 상처를 내고 10 씩 접종하였다. 접종부위를 비닐로 감싸고 25℃(2로 조절된 습실상(상대습도, 100%)에 24시간 둔 후 온실에 유지하면서 혹 형성 정도를 조사하였다.
- 혹은 15 cm 정도의 크기로 표면이 거 칠고 갈변된 타원형 이었다. 혹 조직 으로부터 Agrobacterinm과 유사한 세균을 분리하였으며 벤자민고무나무의 유묘에 접종하여 혹을 형성한 5개 균주 중에서 2 가지 계통에 대하여 분류학적 특성을 조사하였다. 0.
대상 데이터
- 병원균의 기주범위는 Agmbacterium속의 병원성검정에 흔히 이용되거나 국내 발생이 많은 기주식물인 국화 grandiflorum cv. 'Lerbin'), (Nicotiana tabacum cv. 'Samson'), 당근(Daitcus carota cv. 'Sunhongbom 5 chon'), 장미 (Raw hybrida cv. "Red Sandra5), eP\^(Lycopersicon esculentum cv. <Seogwang, ), 포도나무(Vs vinifera cv. 'Kyoho'), 호박(Cuebita moschata cv. 'Jangsootozwa')을 이용하여 조사하였다. 담배, 당근, 토마토, 호박은 원예용 상토(바로커, 서울바이오(주))가 담긴 포트(직경 10.
- 세균분리 및 병원성검정. 2003년 9월 대전광역시 유성구에 소재하는 화훼판매점의 화분에 심겨진 벤자민고무나무의 줄기에서 뿌리혹병의 발생을 확인하였다. 혹은 크기가 15 cm 정도로 크고 균열되어 있었으며 표면이 거칠고 갈변된 타원형이었다(Fig.
- 'Jangsootozwa')을 이용하여 조사하였다. 담배, 당근, 토마토, 호박은 원예용 상토(바로커, 서울바이오(주))가 담긴 포트(직경 10.5 cm, 높이 8.5 cm)에 종자를 직접 파종하였고 국화, 장미, 포도나무는 삽목하였으며 모든 식물체는 본엽이 4~5매 완전히 전개된 유묘를 사용하였다. 접종은 병원성 검정방법에 준하여 실시하였다.
- 분리한 세균의 병원성은 벤자민고무나무(Ficz/s benjamina) 유묘를 이용하여 확인하였다. 모레에 삽목하여 뿌리가 발생한 유묘를 원예용상토(바로커, 서울바이오(주))가 담긴포트(직경 10.5 cm, 높이 8.5 cm)에 이식하여 본엽이 4~5매 완전히 전개되었을 때 접종용으로 사용하였다. 분리 균은 0.
- 병원세균의 동정. 분리한 10개 균주 중 벤자민고무나무의 줄기에 접종하여 병원성이 확인된 3계통(YK6109, YK6110, YK6112)의 균주 중에서 2계통(YK6110, YK6112), 의 균주를 실험에 사용하였다. 표준균주로 사용한 A.
- 5% CaCQ가 첨가된 PDA 사면배지에 배양 후 4℃ 냉장고에 유지하였다. 분리한 세균의 병원성은 벤자민고무나무(Ficz/s benjamina) 유묘를 이용하여 확인하였다. 모레에 삽목하여 뿌리가 발생한 유묘를 원예용상토(바로커, 서울바이오(주))가 담긴포트(직경 10.
- 분리한 10개 균주 중 벤자민고무나무의 줄기에 접종하여 병원성이 확인된 3계통(YK6109, YK6110, YK6112)의 균주 중에서 2계통(YK6110, YK6112), 의 균주를 실험에 사용하였다. 표준균주로 사용한 A. tumefaciens KACC10736은 한국농용미생물보존센터 (KACC, Korean Agricultural Culture Collection)에서 분양 받아 사용하였다. 병원균의 형태는 0.
데이터처리
- 각 균주의 동정과 지방산 조성은 midi Library ver. TSBA 3.90과 Library Generation system software(ver. 3.90)을 이용하여 분석하였다.
- 세균분리 및 병원성검정. 벤자민고무나무의 줄기에 발생한 2개의 혹을 채집하여 세균을 분리하였다.
이론/모형
- 현재 Agrobactefinn의 분류 . 명명에 다양한 논란이 있지만 본 연구에서는 병원성에 기초한 인위분류(Kersters와 De Ley, 1984)와 Young 등 (2001)에 의해 사용된 자연 . 계통분류 방식을 부분적으로 적용하였다.
- 지방산함량 분석. 병원성이 확인된 세균을 TSA 배지에 도말하여 28℃에서 24시간 배양된 균을 4 루프 정도취하여 시험관(직경 1.3 cm, 높이 10 cm)에 옮긴 후 Miller (1982)의 방법에 따라 지방산을 추출하였으며 MIDI (Microbial ID, Inc., Newark, DE) GC system을 이용하여 분석하였다. 각 균주의 동정과 지방산 조성은 midi Library ver.
- 1% uranyl acetate로 염색하여 투과전자현미경으로 관찰하였으며 배양적, 생리.생화학적 특성은 Schaad 등(2001)의 방법에 따라 조사하였다. 세균의 속명을 결정하기 위하여 그람반응, 호 기적 생장, DIM agar 배지와 4(TC에서 생장유무를 조사하였다.
- 5 cm)에 종자를 직접 파종하였고 국화, 장미, 포도나무는 삽목하였으며 모든 식물체는 본엽이 4~5매 완전히 전개된 유묘를 사용하였다. 접종은 병원성 검정방법에 준하여 실시하였다.
성능/효과
- 혹 조직 으로부터 Agrobacterinm과 유사한 세균을 분리하였으며 벤자민고무나무의 유묘에 접종하여 혹을 형성한 5개 균주 중에서 2 가지 계통에 대하여 분류학적 특성을 조사하였다. 0.5% CaCQ가 첨가된 PDA 배지에서 생장된 병원성 세균들은 등글고 볼록하면서 광택이 나는 크림색 계통이었다. 모든 균주는 다수의 편모를 가진 간상의 세균으로 그람음성이었으며 호기적으로 생장하면서 DIM agar에서도 생장하였다.
- 2계통의 병원성 균주를 6가지 식물의 줄기와 당근의 뿌리에 상처접종하여 병원성 차이를 비교하였다. 2개 균주의 병원성 반응은 유사하였으며 포도나무에서는 혹이 형성되지 않았다. YK6110 균주는 대체로 병원성이 약했으나 호박에는 병원성이 강했다.
- 병원성 균주의 탄소원 이용 양상은 GN2 MicroPlate을 이용하여 조사하였으며 95가지 기질 중에서 41가지 기질에 대한 반응을 비교하였다. Biolog 동정 시스템에서 YK6110 균주는 배양 24시간 후 4 tumefaciense 100%의 확률로 61.6%의 유사도를 나타낸 반면 YK6112 균주는 38.8%의 낮은 유사도를 나타냈다. 모든 균주는 glycogen, Ae-acetyl-D-glucosamine, lactulose, D-melibiose, xylitol, L-threonine, glycerol, a-D-glucose- 1 -phosphate, D-glucose-6-phosphate'B- 이용하였으나 glucosaminic acid와 malonic acid는 이용하지 못했다.
- larrymoorei(Bouzar 등, 1995)와 유사하였다. YK6110은 YK6112 균주에 비해 cyclopropane 계통의 lactobacillic(19:0 cycloffl8ciy), hydroxy acid 계통의 3-hydroxypalmitic acid(16:0 3OH)와 unsaturated acid 계통의 palmitoleic acid(16:lM7cz5)함량비율이 상대적으로 높았다. YK6112 균주는 타 균주들에 비해 saturated acid 계통의 palmitic acid(16:0)와 unsaturated acid 계통의 s-vaccenic acid(18:1 함량이 높았으며 cyclopropane 계통의 lactobacillic(19:0 cyclone)과 hydroxy acid 계통의 3-hydroxypalmitic acid(16:0 3OH) 함량 비율이 상대적으로 낮았다(Table 3).
- mmejhciem로 분류함에 무리가 없었다. YK6112 균주는 기존에 보고된 전형적인 A. larrymoorei(Bouzar 등, 1995; Bouzai와 Jones, 2001)와 몇 가지 반응에서 차이가 있었지만 3-ketolactose를 생산하지 못한다는 점, melezitose로부터 산이 생성되지 않는다는 점과 ferric ammonium citrate 반응이 음성이었다는 점에서 A. larrymoorei 로 동정하는 것이 타당할 것으로 생각되었다.
- YK6110 균주는 대체로 병원성이 약했으나 호박에는 병원성이 강했다. YK6112 균주는 당근과 토마토에 병원성이 강했으며 대조균주로 사용한 A. tumejAciens는 모든 식물에 병원성이 있었으며 식물 종류에 따라 혹 형성정도에 차이가 있었다(Table 4). 병원성 Agrobacterium속 세균은 90과 이상의 쌍자엽식물을 가해 (DeCleene과 De Ley, 1976) 하여 식물체에 혹이나 털뿌리를 형성할 수 있다.
- tumejdciis로 동정하는것이 타당하다. YK6112 균주는 비록 c/5-aconitic acid, glucose-1 -phosphate, glucose-6-phosphate, glycyl-L-aspartic acid, acetic acid를 이용하였지만 hydroxy-L-proline, propionic acid, D-glucuronic acid를 이용하지 못하였으므로 동정하는 것이 타당할 것으로 사료되었다.
- 동정되어야 한다. YK6112 균주는 표현형적 특성에서 전형적인 A. larrymoorei(Bouzar 등, 1995; Bouzar와 Jones, 2001)와 차이가 있었으며 A.tamejhcieRS와도 유사한 특성이 많아 정확한 종명을 결정 할 수는 없었다. 그러나 추가적으로 실시한 16S rDNA 유전자 염기서열분석 결과를 표준균주들과 비교하였을 때 YK6112 균주는 A.
- 결론적으로 벤자민고무나무의 혹에서 분리된 YK6110 균주는 배양적, 생리 .생화학적특성, 탄소원 이용양상, 지방산 조성 및 함량비율, 기주범위 등의 표현형적 특성에 근거하였을 때 A.
- tumefaciens KACC10736와 탄소원 이용양상이 유사하였다. 그러나 YK6110 균주는 YK6112 균주에 비해 대조 균주로 사용한 A. tumefaciens KACC10736과 탄소원 이용양상이 아주 유사하였으며 A. Iwrymoorei와는 차이가 많았다, YK6112 균주는 비록 YK6110 및 A. tumefaciens KACC10736과 탄소원 이용양상이 유사하였지만 A.oom와도 유사한 점이 많았다(Table 2).
- tamejhcieRS와도 유사한 특성이 많아 정확한 종명을 결정 할 수는 없었다. 그러나 추가적으로 실시한 16S rDNA 유전자 염기서열분석 결과를 표준균주들과 비교하였을 때 YK6112 균주는 A. larrymoorei 3-10T(Z30542)^ 99.8%의 염기서열 상동성으로 유연관계가 높았다. 동일 속내 다른 종들과는 94.
- IE, H). 모든 세균은 그람 음성이면서 호기적으로 생장하였으며 DIM agar에서도 생장하였다. King's medium B(KB)에서 형광색소나 yeast extract-dextrose-CaCO3(YDC) 또는 nutrient-broth yeast extract agar(NBY)에서 노란색이나 오렌지색의 콜로니도 생성하지 않았으며, 401에서 생장하지 않았다(Table 1).
- 3가지 계통의 병원균 중 현재까지 보고된 Agrobacferium종과 일치하지 않는 YK6109 균주를 제외한 2가지 계통(YK6110, YK6112)의 병원균에 대하여 분류학적 특성을 조사하였다. 병원균의 형태를 투과전자현미경으로 조사한 결과, 2종류의 세균은 다수의 편모를 가진 간균이었으나 형태적으로 차이가 있었다(Fig. IE, H). 모든 세균은 그람 음성이면서 호기적으로 생장하였으며 DIM agar에서도 생장하였다.
- 1C, F). 병원성이 확인된 5개 균주는 3가지 계통(YK6109, YK6110, YK6112)이었으며 비병원성으로 확인된 균주는 A. tumejHcie>is로 확인되었다. 본 연구에서 확인된 벤자민고무나무의 혹은 3가지 계통의 병원균에 의하여 발생된 것으로 확인하였으며 비병원성균이 공존하고 있는 것으로 생각되었다.
- larrymooreiyz: 타 Agrobacterium 계통에 비해 palmitoleic acid(16:lo7cz\) 함량이 상대적으로 높다. 본 실험에서도 벤자민고무나무에서 분리된 병원성 Agrobacterium 세균들은 전체 지방산 함량의 약 70-74% 가 &s-vaccenic acidH&L**)로 타 지방산에 비해 월등히 높았으며 3-hydroxypalmitic acid(16:0 3OH)나 palmitic acid(16:0) 함량은 종이나 계통별로 차이가 있었지만 Agrobacterium 속으로 분류함에 문제가 없었다. 그러나 YK6112 균주는 표준 A.
- larrymooreve: 타 Agrobacterium 종이 이용하는 탄소 원도 산화시키지만 d5-aconitic acid를 산화시키지 못한다는 점이 가장 큰 특징이며 다른 몇 가지 탄소원 이용' 양상도 다른 점이 있다(Bouzar 등, 1993, 1995). 본 연구에서 YK6110 균주는 hydroxy-L-prolinee7 이용하였을 뿐 만아니라 propionic acid, D-glucuronic acid, glucose-1- phosphate, glucose-6-phosphate, glycyI-L-aspartic acid, acetic acid를 이용하였다는 점에서 A. tumejdciis로 동정하는것이 타당하다. YK6112 균주는 비록 c/5-aconitic acid, glucose-1 -phosphate, glucose-6-phosphate, glycyl-L-aspartic acid, acetic acid를 이용하였지만 hydroxy-L-proline, propionic acid, D-glucuronic acid를 이용하지 못하였으므로 동정하는 것이 타당할 것으로 사료되었다.
- 생화학적 반응과 같은 표현형적 특성들은 세균의 속이나 종을 분류하는 중요한 특성이다. 본 연구에서 동정된 병원성 세균들은 Schaad 등(2001)이 분류한 병원성 Agrobacterium속과 모든 특성이 일치하였다. 주요 생리 - 생화학적 특성에 있어서 YK6110 균주는 Schaad 등(2001)이 분류한 A.
- tumejHcie>is로 확인되었다. 본 연구에서 확인된 벤자민고무나무의 혹은 3가지 계통의 병원균에 의하여 발생된 것으로 확인하였으며 비병원성균이 공존하고 있는 것으로 생각되었다.
- rhizogenes를 제외한 나머지 Agrobacterium 종들은 분리된 기주뿐만 아니라 다른 식물에서도 동일한 병징을 일으킬 수 있음으로 병원성에 근거하여 종을 분류하기는 어렵다. 본 연구에서도 2개 균주 모두 포도나무에는 병원성이 없었지만 다양한 식물에서 혹을 형성하였음으로 기주식물에 대한 병원성반응으로는 종을 구별할 수 없었다.
- 1G). 분리된 10개의 균주를 벤자민고무나무의 줄기에 상처접종하였을 때 5개 균주(YK6109, YK6110, YK6111, YK6112, YK6114)는 2~4주 내에 접종부위에서 유백색의 혹을 형성하였으며 시간이 지남에 따라 혹의 표면이 갈변되었으며 종이나 계통에 따른 형태적 차이는 없었다(Fig. 1C, F). 병원성이 확인된 5개 균주는 3가지 계통(YK6109, YK6110, YK6112)이었으며 비병원성으로 확인된 균주는 A.
- Bouzar 등(1995)은 1991년 미국의 Florida지역의 육묘장에서 재배된 벤자민고무나무의 가지와 전정한 상처부위에서 생장한 혹으로부터 Agrobacterium 세균을 분리하여 분류학적 근거를 처음 제시하였다. 비병원성 균주는 A로 확인되었으나 병원성 균주는 기존에 보고된 종과 전혀 다른 새로운 계통임을 확인하였다. 이후 다양한 분류학적 검토를 거쳐 기존에 보고된 종과 다른 새로운 A.
- 뿌리혹병균의 계통간 특성을 비교하기 위하여 3-ketolactose 생산 등 15가지의 생리 .생화학적 반응을 조사한 결과, 2 균주 모두 운동성이 있었으며, 2% NaCl과 35℃에서 생장이 가능하였고, litmus milk 에서 알칼리 활성을 나타냈으며, oxidase 반응이 양성인 반면, CaCQ가 첨가된 배지에서 산을 생성하지 않았으며, erythritol 첨가배지에서 산생성, malonic acid, tartaric acid와 mucic acid 첨가배지에서 알칼리 생성은 음성이었으며 citrate를 이용하지 못하였다. YK6110과 YK6112 균주의 가장 큰 차이는 3가지 반응에서 나타났다.
- 병원성 세균들은 대조균주와 상이한 특성을 가지고 있었으나 주요 생리 . 생화학적특성, 탄소원 이용양상, 지방산 조성 분석 결과에 근거하여 A. larrymoorei와 A. timgfdcien료 동정되었다. A.
- larrymoorei 로 동정되어야 한다. 이상의 결과로 벤자민고무나무의 혹 조직에서 분리된 2가지 계통의 병원균은 A. larrymoorei와 A. tumefaciens로 동정되었다. 속에 의한 벤자민고무나무 뿌리혹병은 국내에서 처음 보고되는 것이며, A.
- 본 연구에서 동정된 병원성 세균들은 Schaad 등(2001)이 분류한 병원성 Agrobacterium속과 모든 특성이 일치하였다. 주요 생리 - 생화학적 특성에 있어서 YK6110 균주는 Schaad 등(2001)이 분류한 A. tumefaciens 및 대조균주로 사용한 A. tumefaciens KACC10736와 동일한 반응을 나타내었음으로 A. mmejhciem로 분류함에 무리가 없었다. YK6112 균주는 기존에 보고된 전형적인 A.
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