[논문]녹두 줄기 조직배양에서 캘러스와 부정아 형성에 관한 세포조직학적 연구

박종범

doi:10.5352/jls.2006.16.7.1141

녹두 줄기 조직배양에서 캘러스와 부정아 형성에 관한 세포조직학적 연구
Cytohistological Study of Development of Callus and Adventitious Shoots from Cultured Stem of Vigna radiata 원문보기

생명과학회지 = Journal of life science, v.16 no.7 = no.80, 2006년, pp.1141 - 1147

초록
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녹두 유식물체 줄기를 조직배양하여 캘러스조직을 형성하였고 이로부터 부정아 형성을 유도한 다음, 캘러스 조직과 부정아 분화에 대한 기원을 조직해부학적으로 연구하였다. 녹두 줄기절편으로부터 캘러스조직의 유도는 0.5 mg/L 2,4-D와 1.0 mg/L kinetin이 첨가된 MS배지가 효과적이었고, 캘러스로부터의 부정아 분화에는 0.75 mg/L NAA와 1.5 mg/L kinetin이 첨가된 MS배지가 매우 효과적이어서 약 21%의 기관형성율을 나타내었다. 캘러스 조직을 조직 학적으로 관찰한 결과, 캘러스조직은 유관속 형성층 외측에 새롭게 형성된 분열능력이 있는 캘러스 형성층환인_바깥쪽으로 생장을 함으로써 유도되었다. 부정아는 캘러스 조직의 외부 표면부위에서 기원된 부정아 정단분열조직으로부터 발생되었다. 부정아 정단분열조직은 엽원기를 형성하여 나중에 잎이 발생되었다.

Abstract ▼ AI-Helper

This study was carried out to establish a reproducible culture system for callus formation and adventitious shoot development from young stem segments of Vigna radinta, and histological work for orgin of callus tissue and adventitious shoot. Induction of callus from young stem explants of Vigna radiata was very effective on MS inorganic salts supplemented with 0.5 mg/L 2,4-D and 1.0 mg/L kinetin. For the adventitious shoot regeneration from the callus tissues, the hormone combination of 0.75 mg/L NAA, 1.5 mg/L kinetin and MS salts resulted in about 21% efficiency. Histological examination showed that callus tissues originated from out-growths by callus cambium rings with do novo meristematic activities, which were localized at the outside of the vascular cambium. Adventitious shoots were developed from shoot apical meristem originated from the surface of callus masses. The shoot apical meristem produced leaf primordium, which then became leaf.

주제어

AI 본문요약
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문제 정의

따라서 본 연구는 녹두 유식물체의 줄기를 조직 배양하여 캘러스조직을 형성하고 이 캘러스조직으로부터 부정아의 분화를 유도한 다음, 이러한 과정에서 나타나는 캘러스 형성과 부정아의 분화에 대한 기원을 세포조직학적으로 연구할 목적으로 실시하였다.

가설 설정

Transverse and longitudinal sections of adventitious shoots in various developmental stages. A: Adventitious shoot initial cells (arrow) initiated from meristematic nodule. B: Shoot apical meristem (SAM) and leaf primordium (LP) formed after 2 weeks of culture.
A: Internal structure of control stem. B: Callus cambium ring (arrow) formed after 36 h of culture C: Meristemoid formed after 48 h of culture. D: Callus tissue initiated from meristemoid after 60 h of culture.
C: Young leaf (YL) initiated from leaf primordia. D: Adventitious shoots produced from callus after 6-weeks of culture. Scale bar = 100 ㎛
B: Callus cambium ring (arrow) formed after 36 h of culture C: Meristemoid formed after 48 h of culture. D: Callus tissue initiated from meristemoid after 60 h of culture. E: Callus tissue formed after 72 h of culture.
E: Callus tissue formed after 72 h of culture. F: meristematic nodules formed after 5 days of culture. Arrow is tracheid.

제안 방법

유도된 캘러스조직은 약 4-5주 간격으로 새로운 MS배지에 계대배양하여 캘러스를 유지하였다. MS 고형배지는 Murashige와 Skoog[28] 기본배지에 sucrose 30 g/L 와 식물호르몬을 첨가하여 pH를 5.6~5.8로 조절한 다음 agar 10 g/L를 첨가하여 121°C 에서 15분간 고압멸균하여 사용하였다. MS배지에 첨가한 식물호르몬은 auxin으로는 2, 4-D, IAA, NAA를, cytokinin으로는 kinetin과 BAP를 여러 가지 농도로 조합하여 첨가하였다.
2). MS 배지에 첨가된 여러 가지 식물호르몬 중 가관분화에 효과적인 것으로 나타난 NAA와 kinetin을 여 러 가지 농도로 세분하여 MS배지에 첨가하였다. MS배지에 L0 mg/L kinetin을 기본농도로 첨가 한 후 여러 가지 농도의 NAA를 첨가한 결과, 0.
8로 조절한 다음 agar 10 g/L를 첨가하여 121°C 에서 15분간 고압멸균하여 사용하였다. MS배지에 첨가한 식물호르몬은 auxin으로는 2, 4-D, IAA, NAA를, cytokinin으로는 kinetin과 BAP를 여러 가지 농도로 조합하여 첨가하였다. 캘러스로부터 기관분화는 여러 가지 종류의 식물호르몬이 여러가지 농도로 조합한 기관분화용 MS고형배지에서 부정아의 분화를 유도하였다.
5:5, v/v/v)고정액으로 12시간 실온에서고정시킨 후 alcohol 상승농도 순서로 탈수하고 xylen으로치환한다. Xylen치환된 조직을 순수 paraffin으로 침투, 매몰시켜서 rotary microtom으로 10 ㎛ 두께로 절단하여 he- malum과 safranin 염색액으로 이중염색하여 광학현미경으로 관찰하였다.
녹두 유식물체 줄기 조직편을 배양한 후 12시간, 24시간, 36시간, 48시간, 60시간, 72시간, 5일, 7일동안 배양된 캘러스조직과 배양 1주 후, 2주 후, 3주 후, 4주 후 캘러스로부터 분화된 부정아을 각각 FAA (formalin: acetic acid: ethyl alcohol; l:0.5:5, v/v/v)고정액으로 12시간 실온에서고정시킨 후 alcohol 상승농도 순서로 탈수하고 xylen으로치환한다. Xylen치환된 조직을 순수 paraffin으로 침투, 매몰시켜서 rotary microtom으로 10 ㎛ 두께로 절단하여 he- malum과 safranin 염색액으로 이중염색하여 광학현미경으로 관찰하였다.
녹두 유식물체 줄기를 조직배양하여 캘러스조직을 형성하였고 이로부터 부정아 형성을 유도한 다음, 캘러스 조직과 부정아 분화에 대한 기원을 조직해부학적으로 연구하였다. 녹두 줄기절편으로부터 캘러스조직의 유도는 0.
9 pM BA가 첨가된 MS 배지에서 배양하여 부정아를 재생한 연구보고도 있다[26]. 한편 발아 3일된 녹두 종자의 자엽과 배축을 NAA(1.07 μM), BA(8.88 μM), 10% 코코넛액 및 BA(6.66 pM), thidiazuron (TDZ, 2.5 μM), 10% 코코넛액이 첨가된 MS배지에서 각각 배양하여 캘러스를 유도한 후 이 캘러스로부터 부정아를 재생하였다[1]. 최근에는 녹두 자엽절을 비 퓨린계로 cytokinin 과 같은 활성을 가진 물질인 TDZ를 저농도(1.

대상 데이터

시중에서 구입한 녹두(Vigna radiata W.)의 종자를 실험실 내에서 발아시킨 유식물체의 줄기를 실험재료로 사용하였다.

데이터처리

캘러스로부터 기관분화는 여러 가지 종류의 식물호르몬이 여러가지 농도로 조합한 기관분화용 MS고형배지에서 부정아의 분화를 유도하였다. 실험에 사용한 각 배지마다 40개의 sample을 사용하였고 2번 반복 실험하여 평균치와 표준편차를 구하였다.

성능/효과

MS 배지에 첨가된 여러 가지 식물호르몬 중 가관분화에 효과적인 것으로 나타난 NAA와 kinetin을 여 러 가지 농도로 세분하여 MS배지에 첨가하였다. MS배지에 L0 mg/L kinetin을 기본농도로 첨가 한 후 여러 가지 농도의 NAA를 첨가한 결과, 0.75 mg/L 농도의 NAA를 첨가한 배지가 가장 효과적이어서 약 17%의 기관형성율을 나타내었다(Fig. 3). 이러한 결과를 바탕으로 MS배지에 0.
0 mg/L kinetino] 첨가된 MS배지에서 배양하였을 때 배양 4-5일 후부터 캘러스 조직이 유도되어 약 4주 후에는 캘러스조직 형성이 왕성하였다. 녹두 유식물체 줄기 조직편과 캘러스조직을 배양 후 12시간 간격으로 조직을 절단하여 현미경 관찰한 결과, 배양 12시간 후 정상 줄기의 내부구조(Fig. 5A) 에 비해 주로 유관속의 사부 위쪽 부위에 위치한 피층 유조직 세포가 신장, 확대되었으며, 배양 24시간 후에는 이렇게 신장된 피층 유조직세포 일부가 평측 또는 수측분열하여 분열세포화되면서 점차 서로 연결되기 시작하였다. 배양 36시간 후에는 유관속 바깥부위에서 이들 분열세포들끼리 서로 연결되어 새로운 전형성층을 만들어 캘러스 형성층환을 형성하였다(Fig.
녹두 유식물체 줄기 조직편을 0.75 mg/L NAA와 1.5mg/L kinetin 이 첨가된 MS배지에서 배양하였을 때 배양약 2주 후부터 캘러스조직 표면으로부터 하얀색의 작은 돌기들이 관찰되었으며, 약 4주 후에는 이러한 돌기가 부정아로 분화하여 약 6주 후에는 정상적인 shoot가 관찰되었다(Fig. 6A). 캘러스조직으로터 분화된 부정아 형성과정을 배양 후 1 주일 간격으로 조직을 절단하여 관찰한 결과, 배양 2주 후 캘러스 조직 외부에서 형성된 meristematic nodule로부터 부정아 시원세포가 발생한 후 이들 세포가 부정아 정단분열조직으로 분화되었으며, 이로부터 엽원기가 발생되어 줄기와 잎이 형성되었다 (Fig.
Kinetin은 세포분열을 촉진시켜 주는데 여기에 적정농도의 auxin이 첨가되면 세포분열뿐만 아니라 세포분화도 촉진시켜 준다고 알려져 있다[6], 그러나 cowpea같은 콩류 작물은 배지에 다양한 aux in-cytokinin 비율을 첨가하여도 부정아 분화가 잘 일어나지 않은 것으로 보고되었다[14]. 녹두 유식물체 줄기의 조직배양에서 얻어진 캘러스로부터의 기관분화에는 21%의 기관형성율을 나타낸 0.75 mg/L NAA와 1.5 mg/L kinetin를 첨 가한 MS배지가 효과적인 기관분화배지였다. 강낭콩 조직배양에서 2, 4-D는 캘러스의 생장에는 매우 효과적이었으나 캘러스로부터 기관분화에는 별로 효과적이지 못한 반면에[8], NAA(10 mg/L)와 kinetin(10 mg/L)이 첨가된 배지가 부정근의 형성에 효과적이었다[9].
연구하였다. 녹두 줄기절편으로부터 캘러스조직의 유도는 0.5 mg/L 2, 4-D와 1.0 mg/L kinetin이 첨가된 MS배지가 효과적이었고, 캘 러 스로부터 의 부정 아 분화에는 0.75 mg/L NAA와 1.5 mg/L kinetin이 첨가된 MS배지가 매우 효과적이어서 약 21%의 기관형성율을 나타내었다. 캘러스 조직을 조직학적으로 관찰한 결과, 캘러스조직은 유관속 형성층 외측에 새롭게 형성된 분열능력이 있는 캘러스 형성층환이 바깥쪽으로 생장을 함으로써 유도되었다.
5 mg/L농도의 kinetin을 첨가한 배지가 가장 효과적이었다. 따라서 캘러스로부터 의 기관분화에는 0.75 mg/L NAA와 1.5 mg/L kinetin이 첨가된, 배지가 약 21%의 높은 기관형성율을 나타내어 이 배지가'가장 효과적인 기관분화 배지임을 알 수 있었다(Fig. 4).
0 mg/L kinetin이 첨가된 MS배지에서 배양하였을 때 배양 2-3일 후부터 줄기 절편이 부풀기 시작하여 배양 4-5일 후부터 캘러스 조직이 유도되었다. 반면에 캘러스로부터의 기관분화를 유도하기 위하여 배지에 첨가한 식물호르몬 중 auxin으로는 NAA (0.5 mg/L)가 IAA나 2, 4-D보다 훨씬 더 효과적 이 었고, cytokinin으로는 ki netin (1.0 mg/L)이 BAP 보다 효과적 이었다(Fig. 2). MS 배지에 첨가된 여러 가지 식물호르몬 중 가관분화에 효과적인 것으로 나타난 NAA와 kinetin을 여 러 가지 농도로 세분하여 MS배지에 첨가하였다.
3). 이러한 결과를 바탕으로 MS배지에 0.75 mg/L NAA를 기본농도로 첨가한 후 여러 가지 농도의 kinetin을 첨가한 결과, 1.5 mg/L농도의 kinetin을 첨가한 배지가 가장 효과적이었다. 따라서 캘러스로부터 의 기관분화에는 0.
잎은 부정아 정단분열조직으로부터 발생된 엽원기로부터 형성되었다. 이상의 결과를 간단히 요약하면, 녹두 유식물체 줄기로부터의 캘러스 형성과 부정아 발생은 탈분화 과정(분열조직화 과정), 부정아 정단분열조직 형성과정, 엽원기 형성과정으로 구분지을 수 있다. 이러한 결과는 Vitis 와 Muscadinia 의 잡종 잎을 조직배양하였을때 형성된 부정아를 조직학적으로 연구한 결과, 절단된 엽병의 피층 바깥의 유 조직 세포가 신장, 분열하여 캘러스를 형성하고 이 캘러스로부터 전 분열조직과 meristematic nodule이 형성된 후 나중에 부정아 분열조직과 엽원기가 발생되었다는 연구보고와 거의 일치한 결과이다[36].
조직배양 결과 형성된 캘러스조직에서 기관형성 과정에 관련되는 세포는 극히 일부에 지나지 않기 때문에 이러한 조직만을 캘러스에서 용이하게 분리해 낼 수 없는 문제점이 있고, 또 기관 분화시 shoot와 뿌리가 동시에 발생하지 않으므로 캘러스의 유용도가 낮아진다는 문제점이 있기, 때문이다. 정확하게 어떠한 요인이 작용하여 meristematic nodule을 특정 기관으로 분화시키는지 아직 밝혀지지 않았으나 본 실험 결과 캘러스에서 무작위적으로 형성된 meristematic nodule 중 캘러스의 외부부위 에 존재하는 meristematic nodule에서 부정아 정단분열조직이 형성되어 부정아로 발생함을 알 수 있었다.
5 mg/L kinetin이 첨가된 MS배지가 매우 효과적이어서 약 21%의 기관형성율을 나타내었다. 캘러스 조직을 조직학적으로 관찰한 결과, 캘러스조직은 유관속 형성층 외측에 새롭게 형성된 분열능력이 있는 캘러스 형성층환이 바깥쪽으로 생장을 함으로써 유도되었다. 부정아는 캘러스 조직의 외부 표면 부위에서 기원 된 부정아 정단분열조직으로부터 발생되었다.
6A). 캘러스조직으로터 분화된 부정아 형성과정을 배양 후 1 주일 간격으로 조직을 절단하여 관찰한 결과, 배양 2주 후 캘러스 조직 외부에서 형성된 meristematic nodule로부터 부정아 시원세포가 발생한 후 이들 세포가 부정아 정단분열조직으로 분화되었으며, 이로부터 엽원기가 발생되어 줄기와 잎이 형성되었다 (Fig. 6B-D).

후속연구

경제적으로 매우 유용한 작물 중의 하나인 녹두(Vigng ra diata W.)의 품종개량 및 생산성 향상을 위하여 조직배양을 이용한 유전학적, 세포학적, 생리학적인 연구가 필요하다. 녹두의 조직배양에 관한 연구는 식물체내에 이미 존재하고 있는 분열조직을 실험재료로 사용하여 이들 분열조직으로부터 직접 식물체 재생을 유도한 연구보고가 대부분이었는데, 이들 연구는 주로 발아된 녹두 종자의 shoot tip, 자엽, 자엽절, 배축 등을 재료로 사용하여 식물체 재생을 보고하였다[2, 4, 18, 24, 26, 32, 35].

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저자의 다른 논문 :

표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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