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문제 정의
- 따라서 본 연구는 쌀겨 물 및 60% 에탄올 추출물의 in vitro cell line상에서 항암작용과 사람유래 비만세포주의 활성화 억제 및 복강 비만세포의 히스타민 분비 억제를 통한 항알레르기 효과에 대해 관찰하였다.
- 본 연구는 쌀겨의 사람유래 암세포 증식 억 제효과(讥 u(- m?)와 사람유래 비만세포주(HMC-1)의 활성 억제효과 및 흰쥐 복강 비만세포로부터 히스타민 분비에 미치는 영향을 관찰하였다. Hep3B와 HeLa 세포에 대한 형태변화는 쌀겨 의 물 추출물과 60% 에탄올 추출물 처리군 모두 농도에 비 례하여 암세포의 밀도가 감소하는 경향을 보였고, 시료를 고농도로 처리할수록 사멸세포 형태인 원형의 세포 수가 증 가하였다.
제안 방법
- 22 μm membrane filter를 사용하여 멸균하였다. HMCT을 시료와 함께 6시간 배양한 다음, 세포를 모아 원심분리하여 상층액을 제거하고, RNA zol을 이용하여 RNA를 추출하였다. Total RNA 1 μg을 75℃에서 5분간 변성시킨 후, dNTP(l mM), oligo(dT) 15(0.
- HMCT을 시료와 함께 6시간 배양한 다음, 세포를 모아 원심분리하여 상층액을 제거하고, RNA zol을 이용하여 RNA를 추출하였다. Total RNA 1 μg을 75℃에서 5분간 변성시킨 후, dNTP(l mM), oligo(dT) 15(0.5 μL), AMV reverse transcriptase(20 U), RNase inhibitor(0.5 U), RT buffer, MgCl2(5 mM)와 DEPC로 처리된 증류수로 최종 부피가 20 μL가 되도록 하여, 42℃에서 30분간 반응시켜 cDNA를 합성하여 효소중합연쇄반응에 사용하였다. 효소중합연쇄반응은 합성된 cDNA를 2μL를 주형으로 FcsRIa, tryptase, c-kit와 GAPDH의 sense primer와 antisense primer(15 pmol), Taq polymerase(0.
- 혈구 계산판으로 생세포수를 측정하였다. 먼저 비특이적인 염색을 막기 위해 세포 l×106개를 anti-FcλRⅡ/Ⅲ-specific mAb(2.4G2)로 30분간 blocking한 다음 FITC-con-jμgated c-kit(CD117), PE-conjμgated FceRIa로 30분간 냉 암소에서 염색한 후 washing 용액으로 세척하여 유세포 분석기(COULTER, Epics XL)로 분석하였다.
- , USA) 에서 24시간 배양한 후 시료를 농도별로 첨가하여 24시간 배양시켰다. 배양한 암세포는 광학현미경으로(NICON TMS, Japan) 100배율로 관찰하였고, 0.4% trypan blue assay로 염색한 후 세포 증식 억제율(%)을 계산하였다.
- 사람유래 간암세포주인 Hep3B 세포에 쌀겨 물 추출물과 60% 에탄올 추출물을 여러 농도로 처리하여 그 세포의 형태변화와 증식 억제율을 관찰하였다. Control군의 HeP3B 정상세포는 다각형 형태로 군집을 형성하며 자랐고, 쌀겨 물 추출물을 처리한 경우(Fig.
- 사람유래 자궁 경부암세포주인 HeLa 세포에 쌀겨의 물 추출물과 60% 에탄올 추출물을 여러 농도로 처리하여 그 세포 형태변화와 증식 억제율을 관찰하였다. 먼저 세포형태의 변화는 쌀겨 물 추출물의 경우(Fig.
- 세포표면 단백질 분석: HMC-1을 시료와 함께 배양한 다음 washing 용액으로 세척한 후 tryphan blue 시약을 이용하여 혈구 계산판으로 생세포수를 측정하였다. 먼저 비특이적인 염색을 막기 위해 세포 l×106개를 anti-FcλRⅡ/Ⅲ-specific mAb(2.
- 흰쥐를 ether로 마취시켜 희생시킨 다음 복강에 PBS를 넣어 약 1분간 마사지한 후 복강내의 세포를 수거하였다. 수거한 세포는 원심분리하여 상층액을 제거한 후 PBS로 washing 한 다음 tyrode buffer에 현탁하여 세포수를 측정하였다. 1×106개의 세포를 37℃에서 10분간 incubation하고 시료를 첨가한 후 37℃에서 20분간 incubation하였다.
- 추청벼의 것을 사용하였다. 쌀겨 물 추출물은 쌀겨에 10배량의 물로 98℃에서 4시간, 에탄올 추출물은 60% 에탄올로 60℃에서 4시간 2회 반복 추출한 후 농축·동결건조하여 사용하였다.
- 세포주은행에서 분양 받았다. 암세포주 배양에 사용한 배지는 DMEM(high glucose 13.5 g/pkg, Gibco, USA) 및 RPMI 1640 1 L당 sodium bicarbonate (Sigma, USA) 3.7 g을 첨가하여 pH 7.2~7.4로 맞춘 후 pore size가 0.2 μm인 filter(Corning, NY, USA)를 이용하여 제균시킨 후 10X antibicotic-antimycotic(Gibco, USA)을 1%, FBS (fetal bovine serum, Promega, USA)를 10% 되도록 첨가하여 사용하였다. 간암세포주 Hep3B와 HeLa celle 5×l05 cells를 cell culture plate(NUNC, 35 mm)에 분주하고 37℃, 5% CO2 incubator(3154 S/N 32504-1811, Forma Scientific Inc.
- 5 U), RT buffer, MgCl2(5 mM)와 DEPC로 처리된 증류수로 최종 부피가 20 μL가 되도록 하여, 42℃에서 30분간 반응시켜 cDNA를 합성하여 효소중합연쇄반응에 사용하였다. 효소중합연쇄반응은 합성된 cDNA를 2μL를 주형으로 FcsRIa, tryptase, c-kit와 GAPDH의 sense primer와 antisense primer(15 pmol), Taq polymerase(0.5 U), polymerase buffer를 DEPC로 처리된 증류수로 최종 부피가 20 μL되도록 하여 predenaturation, 95℃ 5분; denaturation, 95℃ 1분; annealing, 55℃ 1분; elongation, 72℃ 1분을 35 cycle한 다윽, postelongation을 72℃에서 5분하는 조건으로 수행하였다. 효소중합연쇄반응의 product는 20 μL씩 2% agarose gel에 loading하여 100 V에서 40분간 전기영동하여 ethidium bromide로 염색하여 UV(Gel Doc XR, BIO-RAD, USA) 하에서 관찰하였다.
- 5 U), polymerase buffer를 DEPC로 처리된 증류수로 최종 부피가 20 μL되도록 하여 predenaturation, 95℃ 5분; denaturation, 95℃ 1분; annealing, 55℃ 1분; elongation, 72℃ 1분을 35 cycle한 다윽, postelongation을 72℃에서 5분하는 조건으로 수행하였다. 효소중합연쇄반응의 product는 20 μL씩 2% agarose gel에 loading하여 100 V에서 40분간 전기영동하여 ethidium bromide로 염색하여 UV(Gel Doc XR, BIO-RAD, USA) 하에서 관찰하였다.
- 사육하였다. 흰쥐를 ether로 마취시켜 희생시킨 다음 복강에 PBS를 넣어 약 1분간 마사지한 후 복강내의 세포를 수거하였다. 수거한 세포는 원심분리하여 상층액을 제거한 후 PBS로 washing 한 다음 tyrode buffer에 현탁하여 세포수를 측정하였다.
대상 데이터
- 본 실험에 사용된 쌀겨는 고령 대흥농산에서 공급받은 일반미로서 추청벼의 것을 사용하였다. 쌀겨 물 추출물은 쌀겨에 10배량의 물로 98℃에서 4시간, 에탄올 추출물은 60% 에탄올로 60℃에서 4시간 2회 반복 추출한 후 농축·동결건조하여 사용하였다.
- 본 실험에 사용한 간암세포주인 Hep3B(KCLB 58064)와 자궁경부암세포주인 HeLa(KCLB 10002)는 서울대학교와 생명공학연구원 세포주은행에서 분양 받았다. 암세포주 배양에 사용한 배지는 DMEM(high glucose 13.
- 세포 배양 및 RT PCR: 실험에 사용한 HMC-l(human mast cell)은 37℃, 5% CO2 incubator에서 Iscove's modified Dulbecco's medium에 30% horse serum를 첨가하여 배양하였다. 탈 이온화된 3차 증류수로 배지를 제조하여 0.
- 실험에 사용한 흰쥐(SD)는 대한실험동물센터에서 생후 6주된 암컷을 구입하여 일정한 조건(온도: 22±2℃, 습도 55±5%, 명암: 12시간 light/dark cycle) 에서 물과 사료를 충분히 공급하고 가능한 스트레스를 받지 않도록 사육하였다. 흰쥐를 ether로 마취시켜 희생시킨 다음 복강에 PBS를 넣어 약 1분간 마사지한 후 복강내의 세포를 수거하였다.
- 쌀겨 추출물이 비만세포의 히스타민 분비에 미치는 영향을 알아보기 위하여 흰쥐의 복강 비만세포를 이용하였다 (Table 2). 히스타민은 혈관확장과 근육수축으로 알레르기 증상을 일으키는 물질로서(18) compound 48/80 처리시 비만세포에서의 히스타민 분비가 촉진된다.
데이터처리
- 모든 실험결과는 평균±표준편차로 나타내었고, 각 그룹 간의 통계적 유의성은 SPSS 프로그램을 이용하여 p<0.05, p<0.01 수준에서 Duncan's multiple-range test 및 Student's t-test에 의해 검정하였다.
이론/모형
- 세포 내 histamine의 총량 측정은 Shore 등(12)의 방법에 따라 시행하였다. 회수한 상층액 500 μL에 0.
성능/효과
- 60% 에탄올 추출물의 경우(Fig. 2) 100 μg/mL 농도로 처리했을 때부터 다각형의 HeP3B 정상세포가 줄어들었으며 세포말단에 돌기들이 뻗어 나와 있는 것을 관찰할 수 있었다. 1,000 μg/mL에서부터는 세포말단에서 돌기가 뻗어져 나오고 농도에 비례하여 원형화와 손실이 증가하였으며 세포의 밀도가 감소하였다.
- 또한 고농도로 처리할수록 세포의 크기가 작아지고 수촉된 모습을 보였다. 3,000 μg/mL로 처리한 것에서는 쌀겨 추출물과 Hep3B 세포가 엉겨서 떠있는 것이 많이 관찰되었고, 바닥에 존재하는 세포도 정상적으로 자라지 못하고 마치 분쇄된 것처럼 관찰되었다. 60% 에탄올 추출물의 경우(Fig.
- 0%의 억제율을 나타내었으며 쌀겨 60% 에탄올 추출물(Fig. 4) 1,000 μg/mL에서는 20.8%, 3,000 μg/mL 에서는 82.2%의 억제율을 나타내었다. 이상의 결과에서 전반적으로 물 추출물이 60% 에탄올 추출물보다 Hep3B 증식억제효과가 더 컸으며, 특히 고농도인 1,000 μg/mL을 처리하였을 때 물 추출물이 약 55% 더 높은 증식 억 제능을 보였다.
- 먼저 세포형태의 변화는 쌀겨 물 추출물의 경우(Fig. 5) 500 μg/mL으로 처리하였을 때부터 세포말단에서 돌기가 나오는 것을 관찰할 수가 있었고, 1,000 μg/mL에서부터는 정상적인 HeLa 세포의 수가 줄어든 것을 관찰할 수가 있었다. 쌀겨의 60% 에탄올 추출물의 경우(Fig.
- 쌀겨의 60% 에탄올 추출물의 경우(Fig. 6) 100 μg/mL에서 세포 수 자체는 큰 변화가 없었으나 세포말단의 돌기가 뻗어져 나오는 것을 관찰할 수 있었고, 500 μg/mL에서는 돌기가 뻗어 나오는 현상이 증가되었다. 고농인 1,000 μg/mL에서부터는 정상적인 HeLa 세포가 줄어들고 원형화된 손실 형태가 많이 관찰되었다.
- 쌀겨 추출물에 의한 HeLa 세포 증식 억제율은 쌀겨 물 추출물(Fig 7) 100 μg/mL에서 1.3%, 500 μg/mL에서 3.3%, 1,000 μg/mL에서 30.8%의 낮은 암세포 증식 억제율을 보였으며 3,000 μg/mL에서는 88.8%의 억제율을 나타내었다. 쌀겨 60% 에탄올 추출물(Fig.
- 쌀겨 60% 에탄올 추출물(Fig. 8) 처리군도 물 추출물군과 비슷한 경향을 나타내었으며 , 고농도인 3,000 μg/mL을 처리하였을 때 물 추출물이 약 19% 더 높은 암세포 증식 억제능을 보였다. HeLa 세포에 정향의 에탄올 추출물을 1,000 μg/mL 농도로 처리하였을 때 69.
- 9~12) 대조유전자인 GAPDH의 발현양은 대조군과 시료를 처리한 실험군에서 모두 비슷하게 나타났다 (Table 1). FceRI는 알레르기를 유발하는 IgE가 결합하는 비만세포 표면의 고친화성 Fc 수용체로서 (15) FceRI mRNA 의 발현양은 대조군에 비해 쌀겨 물 추출물과 60% 에탄올 추출물을 처리한 실험군에서 감소하는 것으로 나타났으며 (Fig. 10) 물 추출물군보다 쌀겨 60% 에탄올 추출물군에서 더 많이 억제되는 것으로 나타났다. 그러나 두 가지 시료 모두 tryptase mRNA 발현양은 억제하지 못하는 것으로 관찰되었다(Fig.
- Hep3B 세포에 대한 증식 억제능은 쌀겨 물 추출 물이 60% 에탄올 추출물보다 높았고, 100 ug/mL와 1,000 Ug/mL 농도에서 물 추출물이 60% 에탄올 추출물보다 각각 20%, 55% 더 높은 효과가 있었다. HeLa 세포에 대한 증식 억제능은 쌀겨 물 추출물과 60% 에탄올 추출물에서 비슷한 경향을 보였으나 1,000 ug/mL와 3,000 pg/mL 농도에서 물 추출물이 60% 에탄올 추출물보다 긱각 5%, 27% 더 높았다. 사람의 비만세포주(HMC-1)에서 FcsRI, tryptase, c-kit mRNA 발현양에 미치는 효과를 관찰한 결과 GAPDH의 발 현양은 대조군과 시료를 처리한 실험군에서 모두 비슷하게 나타났다.
- 8) 처리군도 물 추출물군과 비슷한 경향을 나타내었으며 , 고농도인 3,000 μg/mL을 처리하였을 때 물 추출물이 약 19% 더 높은 암세포 증식 억제능을 보였다. HeLa 세포에 정향의 에탄올 추출물을 1,000 μg/mL 농도로 처리하였을 때 69.60%, 지유의 에탄올 추출물을 1,000 μg/mL 농도로 처리하였을 때 55.03%의 세포독성을 나타내었다는 Do 등(13)의 결과와 비교해 볼 때 본 실험에서 쌀겨 추출물이 HeLa 세포에 대해 비교적 낮은 세포 증식 억제율을 나타내었다.
- Hep3B와 HeLa 세포에 대한 형태변화는 쌀겨 의 물 추출물과 60% 에탄올 추출물 처리군 모두 농도에 비 례하여 암세포의 밀도가 감소하는 경향을 보였고, 시료를 고농도로 처리할수록 사멸세포 형태인 원형의 세포 수가 증 가하였다. Hep3B 세포에 대한 증식 억제능은 쌀겨 물 추출 물이 60% 에탄올 추출물보다 높았고, 100 ug/mL와 1,000 Ug/mL 농도에서 물 추출물이 60% 에탄올 추출물보다 각각 20%, 55% 더 높은 효과가 있었다. HeLa 세포에 대한 증식 억제능은 쌀겨 물 추출물과 60% 에탄올 추출물에서 비슷한 경향을 보였으나 1,000 ug/mL와 3,000 pg/mL 농도에서 물 추출물이 60% 에탄올 추출물보다 긱각 5%, 27% 더 높았다.
- 본 연구는 쌀겨의 사람유래 암세포 증식 억 제효과(讥 u(- m?)와 사람유래 비만세포주(HMC-1)의 활성 억제효과 및 흰쥐 복강 비만세포로부터 히스타민 분비에 미치는 영향을 관찰하였다. Hep3B와 HeLa 세포에 대한 형태변화는 쌀겨 의 물 추출물과 60% 에탄올 추출물 처리군 모두 농도에 비 례하여 암세포의 밀도가 감소하는 경향을 보였고, 시료를 고농도로 처리할수록 사멸세포 형태인 원형의 세포 수가 증 가하였다. Hep3B 세포에 대한 증식 억제능은 쌀겨 물 추출 물이 60% 에탄올 추출물보다 높았고, 100 ug/mL와 1,000 Ug/mL 농도에서 물 추출물이 60% 에탄올 추출물보다 각각 20%, 55% 더 높은 효과가 있었다.
- Tryptase는 비만세포에서만 유리되는 protease의 일종으로 전신 알레르기 반응 후 유의하게 상승한다는 보고가 있다(16,17). c-kit의 mRNA 발현양은 쌀겨 물 추출물보다 60% 에탄올 추출물이 더 많이 억제하였다 (Fig. 12).
- 히스타민은 혈관확장과 근육수축으로 알레르기 증상을 일으키는 물질로서(18) compound 48/80 처리시 비만세포에서의 히스타민 분비가 촉진된다. 무처리 대조군 (5.244±1.700 ng/mL)에 비해 히스타민 분비를 유도하는 compound 48/80(5 μg/mL)을 처리 하였을 때 히스타민 분비량(113.748±5.237 ng/mL)이 유의하게 증가하였으며, 쌀겨 추출물을 농도별로 처리하였을 경우에는 추출물 종류와 농도에 따라 히스타민 분비량이 유의하게 억제되는 것으로 나타났다. 즉 쌀겨 물 추출물에서는 저농도(0.
- 사람의 비만세포주(HMC-1)에서 FcsRI, tryptase, c-kit mRNA 발현양에 미치는 효과를 관찰한 결과 GAPDH의 발 현양은 대조군과 시료를 처리한 실험군에서 모두 비슷하게 나타났다. 비 만세포의 FceRI mRNA와 c-kit의 mRNA 발현 양은 쌀겨 물 추출물군보다 60% 에탄올 추출물에서 더 많이 억제되는 것으로 나타났으나 tryptase mRNA 발현양은 억 제하지 못한 것으로 관찰되었다. 비만세포의 히스타민 분비 에 미치는 영향은 무처리 대조군에 비해 5 pg/mL compound 48/80을 처리하였을 때 히스타민 분비량이 유의하게 증가하 였으며 , 쌀겨 물 추출물 0.
- 비 만세포의 FceRI mRNA와 c-kit의 mRNA 발현 양은 쌀겨 물 추출물군보다 60% 에탄올 추출물에서 더 많이 억제되는 것으로 나타났으나 tryptase mRNA 발현양은 억 제하지 못한 것으로 관찰되었다. 비만세포의 히스타민 분비 에 미치는 영향은 무처리 대조군에 비해 5 pg/mL compound 48/80을 처리하였을 때 히스타민 분비량이 유의하게 증가하 였으며 , 쌀겨 물 추출물 0.01 Ug/mL에서 약 87%의 억제율을 나타내었고, 에탄올 추출물 100 Lig/mL에서 약 86%의 억제 율을 보였다.
- HeLa 세포에 대한 증식 억제능은 쌀겨 물 추출물과 60% 에탄올 추출물에서 비슷한 경향을 보였으나 1,000 ug/mL와 3,000 pg/mL 농도에서 물 추출물이 60% 에탄올 추출물보다 긱각 5%, 27% 더 높았다. 사람의 비만세포주(HMC-1)에서 FcsRI, tryptase, c-kit mRNA 발현양에 미치는 효과를 관찰한 결과 GAPDH의 발 현양은 대조군과 시료를 처리한 실험군에서 모두 비슷하게 나타났다. 비 만세포의 FceRI mRNA와 c-kit의 mRNA 발현 양은 쌀겨 물 추출물군보다 60% 에탄올 추출물에서 더 많이 억제되는 것으로 나타났으나 tryptase mRNA 발현양은 억 제하지 못한 것으로 관찰되었다.
- 다양한 알레르기 반응을 유발한다(14). 사람의 비만세포주(HMC-1)에서 쌀겨의 물 추출물과 60% 에탄올 추출물이 FcεRI, tryptase, c-kit mRNA 발현양에 미치는 효과를 관찰한 결과(Fig. 9~12) 대조유전자인 GAPDH의 발현양은 대조군과 시료를 처리한 실험군에서 모두 비슷하게 나타났다 (Table 1). FceRI는 알레르기를 유발하는 IgE가 결합하는 비만세포 표면의 고친화성 Fc 수용체로서 (15) FceRI mRNA 의 발현양은 대조군에 비해 쌀겨 물 추출물과 60% 에탄올 추출물을 처리한 실험군에서 감소하는 것으로 나타났으며 (Fig.
- 2%의 억제율을 나타내었다. 이상의 결과에서 전반적으로 물 추출물이 60% 에탄올 추출물보다 Hep3B 증식억제효과가 더 컸으며, 특히 고농도인 1,000 μg/mL을 처리하였을 때 물 추출물이 약 55% 더 높은 증식 억 제능을 보였다. 쌀겨 추출물의 항암활성 에 대한 보고로는 유색미 쌀겨 70% 에탄올 추출물과 클로로포름 추출물이 발암 promotion 의 억제활성을 가졌다는 Nam과 Kang의 보고(7)가 있으며 , 쌀겨 추출에 사용한 유기용매의 종류에 따라 암세포 증식억제능에 차이가 있을 것으로 사료된다.
- 01 μg/mL)에서 약 87%의 억제율을 나타내었고, 60% 에탄올 추출물의 경우에는 고농도(100 μg/mL)에서 약 86%의 억제율을 보였다. 즉 두 가지 시료 모두 농도에 따른 정도 차이는 있지만 비만세포의 히스타민 분비를 유의하게 억제하는 효과가 있는 것으로 나타났다.
- 237 ng/mL)이 유의하게 증가하였으며, 쌀겨 추출물을 농도별로 처리하였을 경우에는 추출물 종류와 농도에 따라 히스타민 분비량이 유의하게 억제되는 것으로 나타났다. 즉 쌀겨 물 추출물에서는 저농도(0.01 μg/mL)에서 약 87%의 억제율을 나타내었고, 60% 에탄올 추출물의 경우에는 고농도(100 μg/mL)에서 약 86%의 억제율을 보였다. 즉 두 가지 시료 모두 농도에 따른 정도 차이는 있지만 비만세포의 히스타민 분비를 유의하게 억제하는 효과가 있는 것으로 나타났다.
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