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문제 정의
- 본 실험의 목적은 3T3-L1 지방세포에서 분비되는 leptin, hormone sensitive lipase (HSL), resistin mRNA 유전자 발현에 인삼사포닌( Rc, Re )과 농도별 EGCG 처리에 따른 영향을 알아보기 위해 실험하였다. 지방조직은 다양한 기능을 가지는 여러 종류의 signaling molecular factors 인 leptin, HSL, resistin, tumor necrosis factor α (TNF-α)등을 분비하는 것으로 알려져있다.
가설 설정
- 23) Dulloo 등은 caffeine과 녹차의 poly- penols을 포함하는 녹차 추출물을 섭취한 젊은 남성에서 24 시간 에너지 소비와 지방 산화가 증가되었다고 보고하였다.24) 녹차 내의 polypenol 성분은 hydroxyl groups, aromatic rings의 숫자와 분자량 그리고 galloy group 존재의 유무에 따라 epicatechin (EC), epigallocatechin (EGC), epica techin gallate (ECG), epigallocatechin gallate (EGCG) 4가지로 분류되어진다. Kao 등은 녹차 카테킨류중 특히 EGCG가 역학적 그리고 임상적 연구조사에서 비만과 당뇨병에 효과가 있는 것으로 보고하였다.
제안 방법
- 15) 인삼 사포닌은 크게 protopanaxadiol계와 protopanaxatriol계로 분류 되어지는데 주요 인삼사포닌은 protopanaxadiol계에는 Rbl, Rb2, Rc, Rd 그리고 Rh2가 포함되어 있으며 protopanaxatriol 계에는 Re, Rf, Rgl, Rg2 그리고 Rhl이 각각 포함되어있다.16) 본 실험에서는 genseng root의 인삼사포닌으로 pro- topanaxadiol계의 Rc와 genseng berry의 인삼사포닌으로 protopanaxatriol계의 Re를 각각 지방세포에 처리하였다.
- 총RNA 용액과 RT primer, reverse-transcriptase, 10 mM dNTP를 첨가하여 42℃에서 1시간 반응시켜 cDNA를 얻었다. PCR은 PCR 자동화기계에서 template로 cDNA, Taq polymerase, dNTP, primer, 10×buffer 및 d—H2O를 첨가하여 총 반응액을 20μl로 하여 실험하였다. PCR 조건은 deneturation 94℃ 45초 (1 cycle), annealing 53℃ 45초, extension 72 ℃ 90초 (29 cycles)으로 사용하였다.
- 그리고 인삼 부위별 사포닌을 선택하여 실험에 이용하므로 in vtro 결과가 향후 in vivo 실험에 좋은 기초 자료가 될 것이라 생각한다. 따라서 본 실험에서는 지방세포 3T3-L1 을 분화 배양하여 2종류의 인삼 사포닌, 100μg/ml Rc, Re, 과 녹차 카테킨 EGCG를 0.01×10-7 0.1×10-7, 1×10-7, 1×10-6농도로 각각 처리하여 지방세포로부터 leptin, hormone sensitive lipase, resistin의 mRNA 수준을 확인하여 인삼 사포닌과 녹차카테킨의 비만 관련 인자에 대한 영향을 비교 확인하였다.
- 본 실험에 사용한지방세포 3T3-L1 배양액은 DMEM 에 1% penicillin—streptomycin, 10% fatal bovin serum 을 첨가하여 5% CO2 배양기에서 배양하여 confluent cells (미분화 지방세포, preadipocyte)이 되면, 지방세포로 분화시키기 위해서 배양액에 100 nM insulin (Sigma), 0.25μM dexametasone (Sigma) 그리고 500 μM isobutylme thylxanthine (Sigma)을 섞어서 이틀간 배양하여 분화를 유도 (분화 지방세포, differentiation adipocyte) 한 후 100 nM insulin만을 포함하는 DMEM 배양액으로 바꾸어 13 일간 배양 성숙 지방세포, mature adipocyte)하였으며 이틀마다 100μg/ml 인삼 사포닌 Re, Rc (sigma) 와 EGCG (epigallocatechin gallate, sigma) 를 0.01×10-7, 0.1×10-7, 1×10-7, 1×10-6M 농도로 각각 3T3-L1 비만세포에 처리하였다.
- 분리한 RNA에 reverse transcriptase를 넣어 cDNA를 합성하였고 Reverse-Transcription반응 과정에서 일차적으로 생성된 cDNA에 sens와 antisens primer를 사용하여 PCR을 시행하여 대량으로 증폭시켰다. 총RNA 용액과 RT primer, reverse-transcriptase, 10 mM dNTP를 첨가하여 42℃에서 1시간 반응시켜 cDNA를 얻었다.
- PCR 조건은 deneturation 94℃ 45초 (1 cycle), annealing 53℃ 45초, extension 72 ℃ 90초 (29 cycles)으로 사용하였다. 세포 내 표준물질로는 glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase (GA-PDH) cDNA를 PCR하여 leptin, hormone sensitive lipase, resistin 유전자 발현정도를 보정하였다. 각 유전자의 primer는 Genome Primercenter program을 이용하여 제작하였고 각 유전자의 염기서열은 Table 1에 나타내었다.
- 유전자의 발현을 확인하기 위해서 1% agrose gel에 증폭된 DNA 시료를 loading하여 50 mvolt로 전기영동한 후 Et-Br용액으로 10분간 염색하고 3차 증류수로 10분간 desfening하여 유전자의 발현을 확인하였다, 그리고 각각의 band intensity는 image analysis software (ImageMaste TotalLab; Pharmacia)가 있는 image documentation system (ImageMaster VDS; Pharmacia) 을 사용하여 정량하였다.
- 시행하여 대량으로 증폭시켰다. 총RNA 용액과 RT primer, reverse-transcriptase, 10 mM dNTP를 첨가하여 42℃에서 1시간 반응시켜 cDNA를 얻었다. PCR은 PCR 자동화기계에서 template로 cDNA, Taq polymerase, dNTP, primer, 10×buffer 및 d—H2O를 첨가하여 총 반응액을 20μl로 하여 실험하였다.
데이터처리
- of three inde pendent experiments expressed as a percentage of the control value. The data were evaluated for statistic significance with a one-way ANOVA followed by Duncanzs multiple range test. The means with * was statistically different compared with Mat-OB.
- of three inde pendent experiments expressed as a percentage of the control value. The data were evaluated for statistic significance with a one-way ANOVA followed by Duncanzs multiple range test. The means with * was statistically different compared with Mat-OB.
- of three independent experiments expressed as a percentage of the control velue. The data were evaluated for statistic significance with a one-way ANOVA hallowed by Duncan's multiple range test. The means with * was statistically different compared with Mat-OB.
- 본 실험에 표시된 결과는 3번 이상의 독립적인 실험 결과이며 이들의 평균(mean)과 표준편차 (standard deviation)를 산출하였으며 통계적 유의성이 p<0.05 내에서 검증된 결과를 표시하였다.
이론/모형
- 세포 내 표준물질로는 glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase (GA-PDH) cDNA를 PCR하여 leptin, hormone sensitive lipase, resistin 유전자 발현정도를 보정하였다. 각 유전자의 primer는 Genome Primercenter program을 이용하여 제작하였고 각 유전자의 염기서열은 Table 1에 나타내었다.
성능/효과
- 12) Wang 등은 인삼추출액 투여에 따른 지방분해를 보고13) 하였고 Liu과 Xiao의 인삼관련 연구보고에서도 인삼의 항비만 효과에 대해 보고하였다.14) 인삼의 주요한 약용인자는 인삼사포닌으로 기본 구조는 17개 탄소원자로 된 4개의 링 구조를 가지는 gonane steroid nucleus로 이루어져 있다. 각 인삼사포닌의 생물학적 특징은 C-3, C-6에 결합하는 sugar moieties의 형태, 위치 그리고 숫자에 따라 각각 달라진다.
- 각 인삼사포닌의 생물학적 특징은 C-3, C-6에 결합하는 sugar moieties의 형태, 위치 그리고 숫자에 따라 각각 달라진다.15) 인삼 사포닌은 크게 protopanaxadiol계와 protopanaxatriol계로 분류 되어지는데 주요 인삼사포닌은 protopanaxadiol계에는 Rbl, Rb2, Rc, Rd 그리고 Rh2가 포함되어 있으며 protopanaxatriol 계에는 Re, Rf, Rgl, Rg2 그리고 Rhl이 각각 포함되어있다.16) 본 실험에서는 genseng root의 인삼사포닌으로 pro- topanaxadiol계의 Rc와 genseng berry의 인삼사포닌으로 protopanaxatriol계의 Re를 각각 지방세포에 처리하였다.
- 95% 이상의 체지방이 tria- cylglycerol형태로 지방세포에 존재하며 소량은 간과 근육에 존재한다.32) 지방세포의 지질대사는 호르몬과 영양상태, 운동에 의해 조절되며 이런 일련의 과정은 지방세포 대사와 체중 항상성 유지에 필수적이다. 반면 이런 조절과정의 부조는 비만, 인슐린저항성, 제2형 당뇨병같은 병리적 상태유발에 중요한 역활을 한다.
- 45) 김 등은 5주간 고지방식이 유도 비만 흰쥐에 200 mg/kg 홍삼 조사포닌을 3주간 투여 하였을때의 효과를 연구한 실험에서 체중, 식이섭취량 감소와 식욕조절 관련 시상하부의 neu ropeptide Y 발현과 혈중 leptin 량의 감소를 보고하였다.45) 본 실험에서 미분화 지방세포에 비해 완전분화 지방세포에서 leptin mRNA 발현량의 현저한 증가를 보였을 뿐 아니라 완전분화 지방세포 비해 100μg/ml 인삼사포닌 처리 세포에서 90%, 폴리페놀릭 프라보노이드인 녹차 카테킨 처리 세포 (1×10-7) 에서는 거의 95%의 유의적 감소를 각각 보였다. 이러한 결과는 인삼사포닌과 녹차 카테킨이 호르몬 유도 분화로 완전 분화 지방세포에서 HSL 의 phosphorylation 를 유도하여 활성화하여 지방분해를 증가시키므로써 free fatty acid의 분비가 증가되고 저장 지방은 감소되어 지방세포의 크기의 감소 또는 세포의 proliferation을 억제하므로 leptin mRNA 발현을 감소 시키는 것으로 사료된다.
- 49) O'Rourke 등은 3T3- L1 지방세포에서 고농도의 포도당 상태에서 인슐린에 의해 HSL이 증가한다고 보고 하였다.50) 본 실험의 결과 완전분화 지방세포 비해 100 μg/ml 인삼사포닌을 처리한 완전분화 지방세포에서 50%의 HSL mRNA 증가를 그리고 농도별 EGCG를 처리한 완전 분화 지방세포에서는 37%, 53%, 73%, 60% 씩 각각 증가를 나타내었다. 따라서 인심 사포닌과 녹차 카테킨이 HSL mRNA를 조절하여 지방세포에서 signaling pathway에 영향을 미치거나 지방산화를 증가시켜 지방조직의 저장지방의 분해를 촉진하여 체지방량을 감소시키므로 체중조절에 영향을 미칠 것으로 사료된다.
- 1에 나타냈다. Preadipocyte상태의 3T3-L1 세포에서 완전한 성숙 비만세포로 분화되면서 leptin mRNA가 증가되어짐을 보여 3T3-L1 세포의 지방세포분화가 정상적으로 이루어짐을 알 수 있었다. 본 실험에서는 완전한 지방세포로 분화한 3T3-L1 세포에 인삼 사포닌류와 농도별 EGCG를 각각 처리한 세포에서 처리하지 않은 세포에 비해 leptin mRNA 발현이 90% 이상의 유의적 감소 (p<0.
- 3). Preadipocyte에서 resistin mRNA 발현은 매우 낮게 나타났으며 분화되어 완전히 성숙한 지방세포에서 현저한 증가를 나타내었으나 인삼 사포닌을 각각 처리한 세포에서는 resistin mRNA 발현이 29%, 38%씩 각각 감소되었다. 농도별 EGCG 처리한 세포에서는 34%, 71%, 81%, 77%씩 각각 감소하였다.
- 인삼 사포닌 종류에 따른 차이는 볼 수 없었고 100 μM EGCG 농도 처리가 각 지표들의 mRNA 발현에 유의적 차이를 나타내었다. 결론적으로 인삼사포닌과 폴리페놀릭 프라보노이드인 녹차 카테킨 EGCG가 지방세포에서 leptin, HSL, resistin mRNA 발현에 영향을 끼쳐 지방 대사 조절 즉 중성지방 분해 및 지방산화 촉진하여 체지방 분해를 증가시키므로써 체지방 감소로 비만개선 효과가 있을 것으로 사료된다.
- 55) 본 실험에서도 EGCG와 인삼사포닌을 각각 처리한 세포에서 위의 실험 결과들과 동일한 resistin mRNA 발현 감소를 나타내었다. 따라서 녹차 카테킨과 인삼사포닌이 지방세포에서의 ERK signaling pathway, CdK2 pathway 또는 지방 대사 관련 유전자 등의 발현에 영향을 미쳐 resistin mRNA 발현을 감소시키므로 비만 뿐만아니라 비만으로 인한 당뇨병의 인슐린 저항성 개선에도 영향을 줄 수 있을 것으로 사료된다.
- 05). 따라서 이러한 결과는 인삼 사포닌과 녹차의 카테킨 모두 성숙 지방세포에서의 leptin 농도에 영향을 미칠 수 있을 것으로 사료된다.
- Preadipocyte상태의 3T3-L1 세포에서 완전한 성숙 비만세포로 분화되면서 leptin mRNA가 증가되어짐을 보여 3T3-L1 세포의 지방세포분화가 정상적으로 이루어짐을 알 수 있었다. 본 실험에서는 완전한 지방세포로 분화한 3T3-L1 세포에 인삼 사포닌류와 농도별 EGCG를 각각 처리한 세포에서 처리하지 않은 세포에 비해 leptin mRNA 발현이 90% 이상의 유의적 감소 (p<0.05)를 나타내었고 인삼 사포닌 종류에 따른 유의적 차이는 보이지 않았다. 농도별 EGCG 처리 세포에서는 1×10-7 M농도 처리 세포에서 leptin mRNA의 발현이 95%의 감소로 가장 낮게 나타났다 (p<0.
- 2에 나타내었다. 완전 분화 세포에 비해 인삼 사포닌 처리 세포에서 HSL mRNA 발현이 52%, 49% 씩 각각 유의적 증가 (p<0.05) 하였고 EGCG를 농도별로 3T3-L1 지방세포에 처리한 결과 37%, 53%, 73%, 60% 씩 각각 증가하였으며 1 X 10-7 M을 처리했을때 73% HSL mRNA발현의 유의적 증가를 나타내었다(p<0.05). 이러한 결과는 각각의 인삼사포닌 처리와 EGCG 처리가 완전 분화세포의 성숙에 영향을 미치는 지방 축척을 저해하는 효과를 가지는 것으로 사료된다.
- 05). 이러한 결과는 각각의 인삼사포닌 처리와 EGCG 처리가 완전 분화세포의 성숙에 영향을 미치는 지방 축척을 저해하는 효과를 가지는 것으로 사료된다. 그리고 인삼 사포닌의 종류나 EGCG의 농도별 처리에 따른 농도 의존적인 차이는 보이지 않았다.
- 45) 본 실험에서 미분화 지방세포에 비해 완전분화 지방세포에서 leptin mRNA 발현량의 현저한 증가를 보였을 뿐 아니라 완전분화 지방세포 비해 100μg/ml 인삼사포닌 처리 세포에서 90%, 폴리페놀릭 프라보노이드인 녹차 카테킨 처리 세포 (1×10-7) 에서는 거의 95%의 유의적 감소를 각각 보였다. 이러한 결과는 인삼사포닌과 녹차 카테킨이 호르몬 유도 분화로 완전 분화 지방세포에서 HSL 의 phosphorylation 를 유도하여 활성화하여 지방분해를 증가시키므로써 free fatty acid의 분비가 증가되고 저장 지방은 감소되어 지방세포의 크기의 감소 또는 세포의 proliferation을 억제하므로 leptin mRNA 발현을 감소 시키는 것으로 사료된다. 따라서 인삼사포닌과 녹차 카테킨은 지방세포에 저장되어진 중성지방을 가수분해하여 체지방량 감소와 지방세포의 크기를 감소 시키므로 과도한 체지방양으로 초래되는 비만을 감소시킬 수 있다고 사료된다.
- 05). 이러한 결과는 정상인에 비해 비만인과 당뇨환자의 혈청과 adi pose tissues에서 더 많이 발현되는 resistin mRNA에 인삼 사포닌과 녹차카테킨인 EGCG가 영향을 미치는 것을 보여줌으로써 인삼사포닌과 EGCG가 비만뿐 아니라 비만과 관련한 제 2형 당뇨와 관련된 resistin발현을 조절할 수 있을 것으로 사료된다.
- 이상을 종합하면 3T3-L1 지방세포에 100μg/ml 인삼 사포닌과 농도별 녹차 카테킨(1~1,000 μM EGCG)을 각각 처리한 결과 HSL 발현이 증가하였고, leptin은 유의적으로 감소하였으며, resistin mRNA 발현은 유의적 감소를 나타내었다. 인삼 사포닌 종류에 따른 차이는 볼 수 없었고 100 μM EGCG 농도 처리가 각 지표들의 mRNA 발현에 유의적 차이를 나타내었다.
- 농도별 EGCG 처리한 세포에서는 34%, 71%, 81%, 77%씩 각각 감소하였다. 인삼사포닌 처리 세포에 비해 EGCG 처리세포에서 resistin 발현이 유의적인 감소를 보였다 (p<0.05). 이러한 결과는 정상인에 비해 비만인과 당뇨환자의 혈청과 adi pose tissues에서 더 많이 발현되는 resistin mRNA에 인삼 사포닌과 녹차카테킨인 EGCG가 영향을 미치는 것을 보여줌으로써 인삼사포닌과 EGCG가 비만뿐 아니라 비만과 관련한 제 2형 당뇨와 관련된 resistin발현을 조절할 수 있을 것으로 사료된다.
후속연구
- 비교한 실험은 최근까지 보고된 바 없다. 그리고 인삼 부위별 사포닌을 선택하여 실험에 이용하므로 in vtro 결과가 향후 in vivo 실험에 좋은 기초 자료가 될 것이라 생각한다. 따라서 본 실험에서는 지방세포 3T3-L1 을 분화 배양하여 2종류의 인삼 사포닌, 100μg/ml Rc, Re, 과 녹차 카테킨 EGCG를 0.
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