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문제 정의
- 본 연구는 녹두묵을 이용한 항비만 임상선행연구를 바탕으로 녹두에 풍부한 vitexin의 항비만 효과의 기작을 살펴보고자 하였다. 녹두 vitexin은 200 μM 농도까지 3T3-L1 지방전구세포의 독성효과는 없었으며 50, 100, 200 μM 농도에서 지방합성이 억제되었고 100 μM 농도에서 지방분해효과로 추측할 수 있는 결과가 나타났다.
제안 방법
- 3T3-L1 지방전구세포를 96 well plate에 1×104/well로접종하고 24시간 후 vitexin을 0, 25, 50, 100, 200 μM로 처리하여 48시간 동안 배양 후 각각 인산완충용액(PBS, pH 7.4)에 5 mg/mL의 농도로 녹인 MTT solution을 20 μL씩 처리하고 4시간 동안 37℃에서 배양하였다.
- DEPC water를 15～20 μL씩 가하고 pellet을 용해시켜얻어진 RNA 용액은 SmartSpec Plus를 이용하여 정량하였고 ReverTra AceⓇ qPCR RT kit로 cDNA를 합성하였다.
- DEPC water를 15～20 μL씩 가하고 pellet을 용해시켜얻어진 RNA 용액은 SmartSpec Plus를 이용하여 정량하였고 ReverTra AceⓇ qPCR RT kit로 cDNA를 합성하였다. Detector는 SYBR green을 사용하여 real time PCR(MJ Mini, Bio-Rad)을 수행하였고 Ct 값을 분석하였다. 본 연구에서는 지방세포 분화 관련 유전자(PPARγ, C/EBPα), 분화마커 유전자(aP2), 지방 합성 및 축적 관련 유전자(FAS, SREBP1α), 염증성 사이토카인 유전자(TNFα) 등과 관련된 primer를 사용하였다(Table 1).
- FBS-DMEM을 blank로 사용하였으며 glycerol standard solution을 각각의 농도로 희석한 것과 군별로 수거한 배지를 96 well plate에 20 μL씩 주입하고 free glycerol reagent를 각각 100 μL씩 처리하여 540nm에서 흡광도를 측정하였다(17).
- Post-confluence 상태에서 0.5 mM IBMX, 1 μM Dexa, 10 μg/mL insulin이 포함된 DMEM(10% FBS, 1% penicillin/streptomycin)으로 분화를 유도하였고 2일마다 10 μg/mL insulin이 포함된 DMEM(10% FBS, 1% penicillin/streptomycin)으로 교체하였다.
- TNF-α의 경우 본 연구결과의 150배 이상 분비되었다는 결과가 존재하였으나 1/5배 수준의 분비량을 나타낸 연구결과도 존재하므로 분화만을 유도한 3T3-L1 세포에서 측정된 값을 절대값으로 비교하였다(36,37).
- 05% 이하가 되도록 용해시킨 vitexin을 각각의 농도(25, 50, 100, 200 μM)로 Day 0부터 Day 14까지 이틀마다 처치하였다. 각 실험은 총 5회의 반복실험을 거쳤으며 각각 분석실험을 통하여 결과로 나타내었다.
- 배양된 세포에 TRI reagent(Molecular Research CenterInc, Cincinnati, OH, USA)를 500 μL/well을 가하여 총 RNA를 추출하였다(19).
- 본 실험에서는 vitexin 처리에 따른 3T3-L1 세포생존율을 MTT assay를 통해 측정하였다(Fig. 1A). 48시간 배양한 결과 대조군에 비하여 25 μM 처리농도에서 생존율이 유의적으로 높았고 기타 농도는 대조군과 유사하였다.
- 본 연구에 앞서 사전 실험으로 녹두에서 HPLC analysis를 실시하였다. 녹두는 국내 품종인 금성녹두의 종피를 사용하였다.
- 분화 세포의 상층 배지를 이틀마다 수거하여 아디포사이토카인인 IL-6, TNF-α, MCP-1의 분비량을 각각의 ELISA kit를 사용하여 측정하였다.
- 분화 중 이틀마다 배지를 수거하여 지방세포가 분비하는 TNF-α, IL-6, MCP-1의 양을 ELISA법으로 측정하였으며 최종분화일인 Day 14에서 Day 0의 차이를 결과로 나타냈다(Fig. 4).
- 분화만을 유도한 세포를 대조군으로 설정하고 실험군에는 DMSO의 최종 농도가 0.05% 이하가 되도록 용해시킨 vitexin을 각각의 농도(25, 50, 100, 200 μM)로 Day 0부터 Day 14까지 이틀마다 처치하였다.
- 염색된 지방에 동량의 100% isopropyl alcohol을 가하여 용해시킨 후 500 nm에서 흡광도를 측정하였다. 분화완료 세포(Day 14)에 배지 및 vitexin을 각각의 농도로 처리하고 24시간 배양 후 배지를 취하여 freeglycerol 분석에 이용하였다. FBS-DMEM을 blank로 사용하였으며 glycerol standard solution을 각각의 농도로 희석한 것과 군별로 수거한 배지를 96 well plate에 20 μL씩 주입하고 free glycerol reagent를 각각 100 μL씩 처리하여 540nm에서 흡광도를 측정하였다(17).
- 염증 반응 유도인자 및 염증성 아디포사이토카인 염증성 사이토카인 생산 및 지방세포 분화에 관여하는 신호전달 체계의 상위단계인 Mitogen Activated Protein Kinase(MAPK)의 작동 여부를 알아보기 위하여 p38과 Extracellular signal-Regulated Kinases(ERK)의 인산화 단백질의 발현을 측정하였다(Fig. 3-B, C). Vitexin 처리군을 대조군과 비교하였을 때 p38의 인산화가 유의적으로 감소하여 p-p38/p38 비율이 감소되는 것으로 나타났다(p<0.
- 1 mg/g이 검출되었으며 미확인 물질이 소량 검출되었으나 결과는 제시하지 않았다. 이러한 결과에 따라 vitexin을 세포에 처리하기로 결정하였으나 녹두 종피중의 함량이 20% 내외로 매우 소량으로 나타나 chemical형태의 vitexin(Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA)을 3T3-L1 세포에 처치하여 본 연구를 수행하였다.
- 이를 확인하기 위해 TNF-α의 mRNA량을 RT-PCR을 수행하였으며 결과는 위에서 설명한 내용과 같다.
- 1% SDS, 50 mM Tris 등으로 구성되었다. 흡광도는 Multiskan spectrum(Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)으로 측정하였으며 RNA 정량과 real-time RT-PCR은 각각 Bio-Rad사(Hercules, CA, USA)의 SmartSpec Plus와 MJ Mini를 이용하여 수행하였다.
대상 데이터
- 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide(MTT)는 Duchefa Biochemie BV(Haarlem, Netherlands)에서 구입하였으며, ReverTra AceⓇ qPCR RT kit와 THUNDERBIRD™ SYBRⓇ qPCRMix(SYBR green)는 Toyobo(Osaka, Japan)에서 구입하였고 ELISA MAX™ Deluxe Sets Mouse IL-6, TNF-α, MCP-1 kit는 Biolegend(San Diego, CA, USA)에서 구입하였다.
- 본 연구에 앞서 사전 실험으로 녹두에서 HPLC analysis를 실시하였다. 녹두는 국내 품종인 금성녹두의 종피를 사용하였다. 분석 결과 녹두 종피에서 vitexin이 190.
- 본 연구에서는 지방세포 분화 관련 유전자(PPARγ, C/EBPα), 분화마커 유전자(aP2), 지방 합성 및 축적 관련 유전자(FAS, SREBP1α), 염증성 사이토카인 유전자(TNFα) 등과 관련된 primer를 사용하였다(Table 1).
- 본 연구에서는 한국세포주은행(KCLB; Korean Cell Line Bank, 서울대학교 의과대학 암연구소, Seoul, Korea)에서 분양받은 3T3-L1 전구지방세포를 6 well plate에 5×104 cells/well로 DMEM(10% BCS, 1% penicillin/streptomycin)에 2일간 배양한 후 100% confluence 상태에서 2일간 더 배양하였다.
- 실험에 사용한 RIPA buffer(pH 8.0)는 150 mM NaCl, 1.0% IGEPAL® CA-630, 0.5% sodium deoxycholate, 0.1% SDS, 50 mM Tris 등으로 구성되었다.
데이터처리
-
통계분석
통계프로그램(SPSS ver18.0, SPSS Inc., Chicago, IL, USA)을 이용하여 각 집단 간 one way ANOVA와 각 집단간 independent t-test를 통하여 유의성을 확인하고 각 집단간의 상관관계를 확인하였다.
이론/모형
- Transcription factor(PPARγ, C/EBPα) 및 MAPK signaling 관련 인자(p38, ERK), AMPK를 단백질 수준에서 확인하기 위하여 배양된 세포에 RIPA buffer(pH 8.0)를 가하여 시료를 얻은 후 Bradford법으로 단백질을 정량하였다(18).
성능/효과
- 3T3-L1 세포의 24시간 배지에서 vitexin의 처리 농도별 glycerol의 정량을 확인한 결과, 대조군에 비하여 vitexin을 100 μM을 처리한 군에서 glycerol량이 유의적으로 높았으며 50, 200 μM을 처리한 군은 유의적으로 낮은 값을 나타냈다(Fig. 1C).
- 48시간 배양한 결과 대조군에 비하여 25 μM 처리농도에서 생존율이 유의적으로 높았고 기타 농도는 대조군과 유사하였다.
- AMPK(AMP-activated protein kinase)는 세포 내의 에너지 항상성 유지 센서 역할을 하는 단백질로서 포도당의 결핍, 혈중 산소 감소, ROS 등의 산화적 스트레스에 의해AMP:ATP 비율이 증가하게 되면 α-subunit의 threonine 172 잔기가 인산화 되어 활성화된다(26). AMPK의 활성화는 대사조절과 밀접하게 연관되어 여러 가지 대사성 질환의 치료제를 개발하기 위한 표적 단백질로 인식되고 있으나 본 연구에서 분화지방세포 내 vitexin 처리 농도에 따른 AMPK 인산화의 유의적인 차이는 관찰되지 않았다(Fig. 3A).
- IL-6 분비량은 vitexin을 25, 100 μM 처치한 군에서 대조군에 비하여 30%까지 유의적으로 감소하였으며 MCP-1은 vitexin을 50 μM 처치한 군에서 20%가 유의적으로 감소하였다(p=0.01).
- Vitexin 처리군을 대조군과 비교하였을 때 p38의 인산화가 유의적으로 감소하여 p-p38/p38 비율이 감소되는 것으로 나타났다(p<0.01).
- Vitexin 처리에 따른 3T3-L1 지방전구세포에서의 PPARγ 단백질 발현을 분석하여 각 실험군을 대조군과 비교한결과, vitexin 25, 50 μM 농도에서는 유의적인 차이가 없었으나 고농도인 200 μM 농도에서는 오히려 발현량이 증가하였다(Fig. 2A).
- Vitexin 처리에 따른 3T3-L1 지방전구세포에서의 TNFα mRNA 발현 정도는25, 200 μM에서 63.1%, 36.8%(p<0.05)로 유의적으로 증가하였다(Fig. 2C).
- Vitexin 처리에 따른 3T3-L1 지방전구세포에서의 aP2 mRNA 발현을 분석한 결과 대조군과 비교했을 때 vitexin을 25 μM 처리한 농도에서 발현이 유의적으로 63.2% 증가하였다가(p<0.05) 200 μM 처리 시 대조군에 비하여 36.0% 감소하였다(Fig. 2B).
- 그러나 본 연구 결과에서는 vitexin 처치에 따라 PPARγ의 발현량이 증가하는 경향을 나타내었고 농도 의존적으로 지방축적이 감소하는 것과는 반대의 결과로 나타났다.
- 녹두 vitexin은 200 μM 농도까지 3T3-L1 지방전구세포의 독성효과는 없었으며 50, 100, 200 μM 농도에서 지방합성이 억제되었고 100 μM 농도에서 지방분해효과로 추측할 수 있는 결과가 나타났다.
- 또한 200 μM에서 염증성 아디포사이토카인 유전자발현을 증폭시키는 상위신호체계(p38, ERK)가 억제된 반면 AMPK의 경우는 100 μM 농도까지 증가하였고 PPARγ 단백질 발현도 200 μM에서 증폭하였으며 TNF-α와 aP2 mRNA 발현은 25 μM에 증가하였다가 감소하였다.
- 본 연구 결과에 따르면 Day 14과 Day 0의 차이로 나타낸 결과에서 TNF-α의 경우 오히려 대조군보다 증가하였지만 Day 0부터 Day 14까지의 누적 분비량에서는 vitexin 처치에 따라 농도 의존적으로 감소되는 경향을 보였다.
- 지방세포 내에서는 지방합성 촉진 인자에 의해 지방을 합성하거나 분해 인자에 의해 지방을 분해하는 과정이 모두 일어난다. 본 연구 결과에 따르면 glycerol은 vitexin 처치에 농도 비의존적인 결과를 나타냈으며 이는 세포 내지방대사 활성의 차이로 생각할 수 있다. 그러나 단순히 glycerol만을 측정한 결과로 합성 또는 분해 과정 중 어느 과정이 활성화되었는가를 판단하기 어려우므로 추후 연구에서는 지방분해 효소인 HSL(hormone sensitive lipase) 및 지방분해산물인 free fatty acid의 정량을 수행하여 지방 합성 또는 분해 과정의 활성 정도를 알아보아야 할 것이다(20).
- 본 연구에서 염증성 사이토카인인 TNF-α가 vitexin 처리에 따라 유의하게 증가하였음에도 불구하고 지방전구세포 자체의 p38 활성이 감소된 것으로 보아 vitexin이 염증성 스트레스 자극과 관련되어 있을 것으로 생각된다.
- 분석 결과 녹두 종피에서 vitexin이 190.8±10.7 mg/g, isovitexin이 211.1 mg/g이 검출되었으며 미확인 물질이 소량 검출되었으나 결과는 제시하지 않았다.
- 이러한 결과를 바탕으로 결론을 내리면 vitexin 100～200 μM 사이의 농도가 항비만 기작을 규명하는 in vivo 실험을 위한 적절한 농도로 여겨진다.
- 지방세포에 염색된 Oil Red O를 용해시켜 상대적인 값을 측정한 결과 대조군에 비하여 vitexin을 50, 100, 200 μM 처리한 군에서 TG 축적량이 각각 0.9, 0.5, 1.1%(p<0.05)로 감소하였다(Fig. 1B).
후속연구
- 38 g/mol)은 플라본인 apigenin의 배당체 형태의 플라보노이드로서 3T3-L1 세포에서 지방세포 분화 촉진 인자인 C/EBPα(CCAAT/ enhancer-binding protein-α) 및 PPARγ(peroxisome profilator-activated receptors-γ)를 억제하였고 세포 내 지방 축적을 감소시켰다(14). 그러나 vitexin이 지방세포에서의 염증 반응에 미치는 영향을 연구한 결과는 아직까지 없었으며 따라서 지방세포의 분화 및 염증 반응에 미치는 총체적인 연구가 필요하다.
- 본 연구 결과에 따르면 glycerol은 vitexin 처치에 농도 비의존적인 결과를 나타냈으며 이는 세포 내지방대사 활성의 차이로 생각할 수 있다. 그러나 단순히 glycerol만을 측정한 결과로 합성 또는 분해 과정 중 어느 과정이 활성화되었는가를 판단하기 어려우므로 추후 연구에서는 지방분해 효소인 HSL(hormone sensitive lipase) 및 지방분해산물인 free fatty acid의 정량을 수행하여 지방 합성 또는 분해 과정의 활성 정도를 알아보아야 할 것이다(20).
- 이러한 결과를 바탕으로 결론을 내리면 vitexin 100～200 μM 사이의 농도가 항비만 기작을 규명하는 in vivo 실험을 위한 적절한 농도로 여겨진다. 그러나 본 연구에서는 vitexin 처리에 따른 C/EBP, SREBP1, PPARγ mRNA 농도의 변화는 관찰되지 않아 3T3-L1 세포자살(apoptosis) 신호체계 및 mTOR와의 연계성체계 혹은 기타 adipogenesis 억제 유전자로 SIRT1 등의 연구가 향후에 더 필요할 것으로 사료된다.
- 본 연구에서는 녹두에 풍부한 플라보노이드인 vitexin이 지방세포의 분화조절과 당대사능, 아디포사이토카인 분비능에 미치는 영향을 검토하여 1차적으로 비만 및 비만으로 유도된 인슐린저항성과 제2형 당뇨 치료제 연구의 기초자료로 활용할 수 있을 것으로 사료된다.
- 3T3-L1에서 천연물 유래 vitexin 100 μM이 대조군에 비하여 세포 내 지방축적을 37%까지 감소시켰다는 보고가 있으나 본 연구 결과에서는 대조군과의 차이가 크지 않았다(14). 이것은 천연물에서 유래한 형태와 합성형의 차이로 생각해 볼 수 있으나 정확한 규명을 위한 추후 연구가 필요하다.
- 이러한 결과는 vitexin이 지방세포의 분화 속도를 지연시켜 vitexin 처치군에서 PPARγ의 발현이 뒤늦게 증가하도록 자극하는 기전을 고려해볼 수 있으며 이를 규명하기 위해 분화 시점에 따른 PPARγ 발현에 대한 연구가 필요하다.
- 이처럼 대조군보다 감소하는 TNF-α, IL-6 및 MCP-1의 경향은 vitexin 농도에 따라 각기 다른 것으로 나타났으며 각각의 아디포사이토카인 조절을 위한 적절한 vitexin의 농도가 존재할 수 있으며 그것을 밝히기 위한 연구가 필요할 것으로사료된다.
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