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문제 정의
- 본 연구는 음식물 쓰레기의 효율적인 처리를 목적으로 완전 소멸 방식의 음식물 쓰레기 처리 장치에서 분해된 산물로부터 세균을 분리하여 온도 테스트를 거쳐 고온성 균주를 선별하였다. 그리고 분리균주들을 대상으로 4가지 분해효소 (amylase, cellulase, protease, lipase)에 대한 활성 능력을 점성적인 방법과 정량적인 방법2로 알아보았다.
가설 설정
- In the case of microbe addition, temperature was about 6℃ higher than that of the control. (B) Weight decrement of food wastes. In the case of microbe addition, degradation of food wastes was almost about two times higher than that of the control.
제안 방법
- 2% CMC가 기질로 첨가된 평판배지를 이용하였다. 0.2% CMC 평판배지에 분리 균주를 접종하여 배양한 후, 1 mg/mL 농도의 C32H22N6O6S2Na2 (Congo red)로 염색하였다. 섬유소를 분해흐)는 활성 능력이 있으면 colony 주변에 주황색 환이 생성된다.
- 분리균주를 5 ml 액체배지에 접종하여 그 상등액을 조효소액으로 사용하였다. Amylase 활성 능력 테스트에서는 50 mM Tris-HCl(pH 8.0)를 완충용액으로 사용하여 1% 전분을 기질로 준비하였고 cellulase 활성 능력 테스트에서는 0.1 M sodium acetate buffer(pH 4.8)를 완충용액으로 사용하여 1% carboxymethyl cellulose를 기질로 준비하여 사용하였다. 이렇게 준비된 기질을 조효소액과 섞어 반응시킨 후 3, 5-dinitrosalicylic acid(DNS) 반응시약을 첨가하고 100℃에서 10분간 처리하여 발색시킨 후 540 nm에서 흡광도를 측정하였다.
- 분리균주가 amylase, cellulase, protease, lipase를 생성하는지 여부를 정성적인 방법丄로 알아보기 위해서 각각 전분 (starch), carboxymethyl cellulose(CMC), 아dm milk, glyceiyl trioctanoate[6] 등을 기질로 포함하는 평판배지를 이용하여 그 생성 유무를 판별하였다. Amylase 활성 조사는 0.2% 전분이 기질로 첨가된 평판배지에 분 균을 접종하여 48시간 배양한 후 요오드용액으로 염색하여 그 분해능을 알아보았다. 요오드용액으로 염색을 하면 미생물에 의해 전분이 분해된 곳은 노란빛의 환으로 나타나며 그 활성이 높을수록 환의 크기도 크다[11-13].
- LB 또는 GPY 액체배지 5 mL에 균을 접종하여 16시간 배양한 후에 원심분리하여 균체를 모았다. TE bufFer(pH 8.
- LB 또는 GPY 액체배지 5 mL에 균을 접종하여 16시간 배양한 후에 원심분리하여 균체를 모았다. TE bufFer(pH 8.0)를 첨가하여 균체를 현탁하고 각 균체에 0.5 M EDTA(pH 8)와 20 mg/mL proteinase K, 40 mg/mL lysozyme을 차례로 넣어 조심스레 섞어주고 20 mg/mL proteinase K를 한번 더 첨가하였다. 10% sodium dodecylsulfate, 5 M NaCl, CTAB/NaCl solution을 더 첨가한 후에 24:1 chloroform/iso/amyl alcohol을 넣고 섞어준 후 원심분리하여 상층액을 추출하고 다시 25:24:1 phenol/ chloroform/iso-amyl alcohol을 첨가, 원심분리흐]여 상증액을모았다.
- 따라서 분리균주들을 대상으로 음식물 쓰레기의 주 구성성분인 탄수화물, 지방, 단백질, 섬유소들을 각각 분해하는 분해효소인 amylase, lipase, protease 혹은 cellulase의 생성 유무와 그 활성의 정도에 대해 조사하였다. 각각의 기질이 첨가된 평판배지를 이용하여 정성적으로 분해 활성이 있는 균주들을 1차적으로 선별하였고, DNS 환원당 측정을 통해 분해 효소 활성을 정량적으로 분석하였다. 분리균주가 amylase, cellulase, protease, lipase를 생성하는지 여부를 정성적인 방법丄로 알아보기 위해서 각각 전분 (starch), carboxymethyl cellulose(CMC), 아dm milk, glyceiyl trioctanoate[6] 등을 기질로 포함하는 평판배지를 이용하여 그 생성 유무를 판별하였다.
- 완전소멸방식의 음식물 쓰레기 처리 장치를 설계하여 음식물 쓰레기 처리 과정 중 pH와 함수유 염분, 온도 등의 변화에 대한 조사와 장치에 첨가되는 bio-chip 의 물리적인 특징에 대한 조사가 이루어졌고 음식물 쓰레기의 종류에 따라 잔류되는 양도 조사되었다[1, 19, 20], 한편 음식물 쓰레기 소멸에 직접 작용하는 미생물에 대한 연구는 여전히 미흡한 실정이다. 그래서 본 실험에서는 완전 소멸방식으로 음식물 쓰레기를 처리하기 위하여 고안된 장치 머 그리(이성 엔지니어링)를 이용하였다(Fig. 1). 이 장치는 삼나무 톱밥과 음식물 쓰레기를 20:1의 비율로 섞어서 음식물쓰레기를 완전소멸방식으로 처리하는 것이다.
- 10% sodium dodecylsulfate, 5 M NaCl, CTAB/NaCl solution을 더 첨가한 후에 24:1 chloroform/iso/amyl alcohol을 넣고 섞어준 후 원심분리하여 상층액을 추출하고 다시 25:24:1 phenol/ chloroform/iso-amyl alcohol을 첨가, 원심분리흐]여 상증액을모았다. 그리고 isopropyl alcohol을 첨가하고, 원심분리하여 chromosomal DNA를 침전시켰고 absolute ethanol을 첨가하여 씻어준 후 말려 완충액에 녹여 chromosomal DNA를 확보하였다.
- 섬유소를 분해흐)는 활성 능력이 있으면 colony 주변에 주황색 환이 생성된다. 그리고 protease와 lipase는 평판배지가 불투명한 흰색이므로 접종시킨 균주의 colony 주변으로 투명 환이 생성되는 것을 보고 활성 유무를 판별하였다. 그 결과 전체 100여 종의 분리 균주들 중에서 약 33%가 amylase 활성을 보였고, 약 20%가 cellulase, 약 21%가 protease, 약 23%가 lipase 활성을 각각 보여주었다.
- 이 음식물 쓰레기 처리 장치에서 미생물을 분리하여 어떤 미생물들이 관여하는지 16S rDNA 분석에 근거하여 그 종류를 알아보았다. 그리고 그 균주들을 대상으로 온도 테스트를 거쳐 50℃ 이상에서 생존 가능한 고온성 미생물을 분리하여 각각의 분해효소 활성 능력에 대해 조사 하였고 직접 음식물 쓰레기 처리 장치에 해당 미생물 부가를 적용하여 그 효과에 대해서 알아보았다[14-18].
- 그리고 분리균주들을 대상으로 4가지 분해효소 (amylase, cellulase, protease, lipase)에 대한 활성 능력을 점성적인 방법과 정량적인 방법2로 알아보았다. 이렇게 확보된 고온성의 분해 활성 능력이 상대적으로 높은 균주들 30 여종을 선별하여 직접 음식물 쓰레기 처리 장치에 적용하여 그 분해 능률을 비교해본 결과 분리균주들을 첨가한 경우가 온도 면에서나 무게 감량 면에서 긍정적인 결괴를 보여주었다.
- 음식물 쓰레기와 삼나무 톱밥을 고루 섞어 두 개의 동일한 음식물 쓰레기 처리 장치에 동량을 나눠 담았다. 그리고 한쪽에는 30 여종의 분리균주의 균체를 추가로 첨가하여 하루 동안 전체 무게와 온도 변화를 관찰 하였다. 첨가된 균체로는 단계적인 온도 테스트를 통해 고온에서 생장가능하며 효소 활성 능력이 있는 30여종의 분리균주(KNUC 207, KNUC 211, KNUC212, KNUC 214-229, KNUC 235-238 and KNUC 240~242)를 사용하였다.
- 노란빛의 반응액은 기질이 많이 분해되어 당의 양이 많을수록 점점 짙은 갈색으로 그 색이 변하게 된다. 기준곡선으로 glucose를 1, 10, 50, 100, 150, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, or 1000 mg/tnL의 농도로 희석한 용액의 흡광도를 측정하여 사용하였다. 1 unit은 조 효소액 1 ml가 1분 동안 당 1 mg을 생성하는 양으로 정하였다.
- 미생물이다. 따라서 그 분해 활동에 긍정적인 효과가 기대되는 균을 선별하여 직접 음식물 쓰레기 처리 장치에 적용하여 분리 균주들을 첨가했을 때 실제 분해에 어떤 긍정적인 효과가 있었는지에 대하여 알아보는 비교실험을 수행하였다. 음식물 쓰레기와 삼나무 톱밥을 고루 섞어 두 개의 동일한 음식물 쓰레기 처리 장치에 동량을 나눠 담았다.
- 음식물 쓰레기 처리 장치 이용 공정에서 음식물 쓰레기가 분해되어 소멸된다는 것은 해당 장치 처리 과정 중에서 선발되는 미생물이 음식물쓰레기를 분해할 수 있는 분해효소를 가지고 있지 않을까 추정해 볼 수 있다. 따라서 분리균주들을 대상으로 음식물 쓰레기의 주 구성성분인 탄수화물, 지방, 단백질, 섬유소들을 각각 분해하는 분해효소인 amylase, lipase, protease 혹은 cellulase의 생성 유무와 그 활성의 정도에 대해 조사하였다. 각각의 기질이 첨가된 평판배지를 이용하여 정성적으로 분해 활성이 있는 균주들을 1차적으로 선별하였고, DNS 환원당 측정을 통해 분해 효소 활성을 정량적으로 분석하였다.
- 각각의 기질이 첨가된 평판배지를 이용하여 정성적으로 분해 활성이 있는 균주들을 1차적으로 선별하였고, DNS 환원당 측정을 통해 분해 효소 활성을 정량적으로 분석하였다. 분리균주가 amylase, cellulase, protease, lipase를 생성하는지 여부를 정성적인 방법丄로 알아보기 위해서 각각 전분 (starch), carboxymethyl cellulose(CMC), 아dm milk, glyceiyl trioctanoate[6] 등을 기질로 포함하는 평판배지를 이용하여 그 생성 유무를 판별하였다. Amylase 활성 조사는 0.
- 음식물 쓰레기 처리 장치에서 시료를 채취하여 0.9% NaCl 용액으로 희석하여 bactotryptone 1%, yeast extract 0.5%, NaCl 0.5%, glucose 0.1% 조성의 Luria-Bertani(LB) 배지 [2]와 glucose 2%, polypeptone 1%, yeast extract 0.5% 조성의 glucose-peptone-yeast extract(GPY) 배지 [3]에 균을 도말하여 colony의 형태적인 차이에 따라 100여종의 미생물을 분리하였다. 이 분리균주들을 대상으로 45℃, 50℃, 55℃, 60℃ 의 순서로 단계적으로 온도를 올리면서 균을 배양하여 적정 온도 테스트를 실행하였다[4].
- 따라서 그 분해 활동에 긍정적인 효과가 기대되는 균을 선별하여 직접 음식물 쓰레기 처리 장치에 적용하여 분리 균주들을 첨가했을 때 실제 분해에 어떤 긍정적인 효과가 있었는지에 대하여 알아보는 비교실험을 수행하였다. 음식물 쓰레기와 삼나무 톱밥을 고루 섞어 두 개의 동일한 음식물 쓰레기 처리 장치에 동량을 나눠 담았다. 그리고 한쪽에는 30 여종의 분리균주의 균체를 추가로 첨가하여 하루 동안 전체 무게와 온도 변화를 관찰 하였다.
- 5% 조성의 glucose-peptone-yeast extract(GPY) 배지 [3]에 균을 도말하여 colony의 형태적인 차이에 따라 100여종의 미생물을 분리하였다. 이 분리균주들을 대상으로 45℃, 50℃, 55℃, 60℃ 의 순서로 단계적으로 온도를 올리면서 균을 배양하여 적정 온도 테스트를 실행하였다[4]. 이를 통해 55℃ 이상의 고온에서 정상적으로 잘 생육하며 집락형태가 특징적인 고온성 균주 32종이 선발되었다.
- 이와 같은 음식물 쓰레기 처리 과정을 통해 고온 발효 시 음식물 쓰레기의 분해도 단시간에 활발히 일어남을 알 수 있었다[9]. 이 음식물 쓰레기 처리 장치에서 미생물을 분리하여 어떤 미생물들이 관여하는지 16S rDNA 분석에 근거하여 그 종류를 알아보았다. 그리고 그 균주들을 대상으로 온도 테스트를 거쳐 50℃ 이상에서 생존 가능한 고온성 미생물을 분리하여 각각의 분해효소 활성 능력에 대해 조사 하였고 직접 음식물 쓰레기 처리 장치에 해당 미생물 부가를 적용하여 그 효과에 대해서 알아보았다[14-18].
- 이렇게 확보된 chromosomal DNA를 대상으로 보존성이 높은 16S ribosomal RNA 부분을 PCR로써 증폭하였다. Primer로 GFl(5'-TAACACATGCAAGTCGAACG-3')과 GR1 (5'-GGTGTGACGGGCGGTGTGTACAAG-3‘)을.
- KNUC206, 207, 208, 209, 211, 212, 213, 215, 216, 224, 234, 236, 237, 239, 242, 243 등과 같은 경우에는 2 종류 이상의 분해효소 활성 능력을 보여주었다. 정량적인 방법으로 효소 활성 분석도 수행하였다. Amylase 와 cellulase 활성 능력 분석은 DNS 환원당 측정법 [7, 8]을 사용하였다.
- ) 장치에서 94℃에서 30초(denaturation), 60℃에서 30초 (annealing), 72。(2에서 45초(extension)로 반응 시키는 과정을 총 35 회 반복한 후 72P에서 15분 동안 저장하였다[»|. 증폭된 16S rDNA절편을 회수하여 염기서열을 분석하였고 NCBI의 Basic Local Alignment Search Tool(BLAST)을 이용하여 염기서열을 비교하여, 상동성이 높은 균주를 찾았다. 이 분리균주들의 해당 염기서열 정보는 GenBank에 등록하여 각각의 accession number를 얻었다.
대상 데이터
- 선발된 고온성 균주들을 대상으로 chromosomal DNA를 추출하였다. LB 또는 GPY 액체배지 5 mL에 균을 접종하여 16시간 배양한 후에 원심분리하여 균체를 모았다.
- 그리고 한쪽에는 30 여종의 분리균주의 균체를 추가로 첨가하여 하루 동안 전체 무게와 온도 변화를 관찰 하였다. 첨가된 균체로는 단계적인 온도 테스트를 통해 고온에서 생장가능하며 효소 활성 능력이 있는 30여종의 분리균주(KNUC 207, KNUC 211, KNUC212, KNUC 214-229, KNUC 235-238 and KNUC 240~242)를 사용하였다. 전 배양과 본 배양 과정을 거쳐 500 mL 액체배지에서 600 nm에서 흡광도가 1~1.
이론/모형
- 정량적인 방법으로 효소 활성 분석도 수행하였다. Amylase 와 cellulase 활성 능력 분석은 DNS 환원당 측정법 [7, 8]을 사용하였다. 분리균주를 5 ml 액체배지에 접종하여 그 상등액을 조효소액으로 사용하였다.
성능/효과
- 1 unit은 조 효소액 1 ml가 1분 동안 당 1 mg을 생성하는 양으로 정하였다. 그 결과 KNUC 206, 209, 211, 216, 231, 232, 235: 237이 다른 균주에 비해 높은 amylase 활성을 각각 보여주었고 KNUC 207, 209, 211, 231, 237은 cellulase 활성을 각각 보여주었다(data not shown). 음식물 쓰레기 처리 과정에서 이런 분해효소 활성 능력이 있는 균주들에 의해서 음식물 쓰레기의 분해가 활발히 이루어졌으리라 추측되었다.
- 그리고 protease와 lipase는 평판배지가 불투명한 흰색이므로 접종시킨 균주의 colony 주변으로 투명 환이 생성되는 것을 보고 활성 유무를 판별하였다. 그 결과 전체 100여 종의 분리 균주들 중에서 약 33%가 amylase 활성을 보였고, 약 20%가 cellulase, 약 21%가 protease, 약 23%가 lipase 활성을 각각 보여주었다. KNUC206, 207, 208, 209, 211, 212, 213, 215, 216, 224, 234, 236, 237, 239, 242, 243 등과 같은 경우에는 2 종류 이상의 분해효소 활성 능력을 보여주었다.
- 8℃에 비해 4℃ 정도 높았다. 그리고 무게 변화를 관찰한 결과 분리균주들을 투입한 경우 30 kg이 감소하였고 대조군은 16 kg 감소로 분리균주들을 첨가한 경우가 대조군에 비해 무게 감소량이 2배나 많았다. 대조군에 비해서 분리균주들을 첨가한 경우가 온도에 있어서도 좀 더 고온이 유지 되면서 분해가 잘 되었고 실제 무게 변화에 있어서도 긍정적인 효과를 보여주었다.
- 삼나무 톱밥에서 분리되었던 균주들은 음식물 분해 처리가 이루어진 혼합물에서는 발견되지 않은 것으로 보아 해당 미생물이 음식물 쓰레기 분해 과정에는 결정적 역할을 하지 않는 것으로 여겨졌다. 따라서 본 실험에서 사용된 음식물 쓰레기 처리 과정에서 일종의 bio-chip으>로 첨가되는 삼나무 톱밥은 그 다공성 이 호기적인 조건을 유지시키는데 긍정적 인영 향을 주어서 음식물 쓰레기 분해에 긍정적인 도움을 주리라 예상되었다.
- 해당 장치에서 분해 처리가 이루어진 음식물 쓰레기와 삼나무 톱밥의 혼합물에서 분리한 50여종에 달하는 균주들은 포자를 형성하여 고온에서도 잘 자라는 Bacillus 종류들이 많았다. 삼나무 톱밥에서 분리되었던 균주들은 음식물 분해 처리가 이루어진 혼합물에서는 발견되지 않은 것으로 보아 해당 미생물이 음식물 쓰레기 분해 과정에는 결정적 역할을 하지 않는 것으로 여겨졌다. 따라서 본 실험에서 사용된 음식물 쓰레기 처리 과정에서 일종의 bio-chip으>로 첨가되는 삼나무 톱밥은 그 다공성 이 호기적인 조건을 유지시키는데 긍정적 인영 향을 주어서 음식물 쓰레기 분해에 긍정적인 도움을 주리라 예상되었다.
- 그리고 분리균주들을 대상으로 4가지 분해효소 (amylase, cellulase, protease, lipase)에 대한 활성 능력을 점성적인 방법과 정량적인 방법2로 알아보았다. 이렇게 확보된 고온성의 분해 활성 능력이 상대적으로 높은 균주들 30 여종을 선별하여 직접 음식물 쓰레기 처리 장치에 적용하여 그 분해 능률을 비교해본 결과 분리균주들을 첨가한 경우가 온도 면에서나 무게 감량 면에서 긍정적인 결괴를 보여주었다. 앞으로 이런 연구가 심도있게 진행되어 고염, 고온 등 다양한 환경에서 미생물을 분리하여 유기물에 대한 분해 능력이 뛰어난 미생물을 선별하여 음식물 쓰레기의 종류와 상황에 따라서 적절한 미생물 혼합물을 첨가한다면 음식물 쓰레기의 처리에 많은 효과를 기대할 수 있을 것이다.
- KNUC202와 Erwinia cypripedii KNUC203 등과 같은 균들을 분리할 수 있었다. 해당 장치에서 분해 처리가 이루어진 음식물 쓰레기와 삼나무 톱밥의 혼합물에서 분리한 50여종에 달하는 균주들은 포자를 형성하여 고온에서도 잘 자라는 Bacillus 종류들이 많았다. 삼나무 톱밥에서 분리되었던 균주들은 음식물 분해 처리가 이루어진 혼합물에서는 발견되지 않은 것으로 보아 해당 미생물이 음식물 쓰레기 분해 과정에는 결정적 역할을 하지 않는 것으로 여겨졌다.
후속연구
- 음식물 쓰레기 처리 과정에서 이런 분해효소 활성 능력이 있는 균주들에 의해서 음식물 쓰레기의 분해가 활발히 이루어졌으리라 추측되었다. 나아가 이런 분해 활성능력이 있는 균주들의 특성에 대해 파악하여 활성 능력을 높일 수 있는 조건을 조사하여 적용한다면 좀 더 높은 분해 능력을 기대할 수도 있을 것이다. 추후 다양한 조건에서 더 많은 분리균들을 대상으로 높은 분해 능력을 가지는 균주들을 선별하는 작업이 의미를 가질 것이다.
- 이렇게 확보된 고온성의 분해 활성 능력이 상대적으로 높은 균주들 30 여종을 선별하여 직접 음식물 쓰레기 처리 장치에 적용하여 그 분해 능률을 비교해본 결과 분리균주들을 첨가한 경우가 온도 면에서나 무게 감량 면에서 긍정적인 결괴를 보여주었다. 앞으로 이런 연구가 심도있게 진행되어 고염, 고온 등 다양한 환경에서 미생물을 분리하여 유기물에 대한 분해 능력이 뛰어난 미생물을 선별하여 음식물 쓰레기의 종류와 상황에 따라서 적절한 미생물 혼합물을 첨가한다면 음식물 쓰레기의 처리에 많은 효과를 기대할 수 있을 것이다.
- 나아가 이런 분해 활성능력이 있는 균주들의 특성에 대해 파악하여 활성 능력을 높일 수 있는 조건을 조사하여 적용한다면 좀 더 높은 분해 능력을 기대할 수도 있을 것이다. 추후 다양한 조건에서 더 많은 분리균들을 대상으로 높은 분해 능력을 가지는 균주들을 선별하는 작업이 의미를 가질 것이다.
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