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문제 정의
- 본 연구에서 NP의 독성평가를 위해 토양선 충의 일종인 Caenorhabditis elegans를 이용하여 토 양계 모니터링을 위한 마커로서의 가능성을 시험해 보았다. 우리나라 학명으로 예쁜꼬마선충인 C.
- , 2005; Reichert and Menzel, 2005). 본연구에서는 토양오염의 지표모델의 가능성을 가지고 있는 C. 에 내분비계 장애 의심 물질로서 실생활에서의 사용량을 점차 금지하고 있는 NP를 적용하여 스트레스관련 유전자의 발현과 생장, 생식, 발달의 수준에서 영향을 조사하였다. 스트레스 관련 유전자로는 heat shock protein (hsp 16-1, hsp 16-2, hsp 16-48, hsp 70), metallothionein (mt-1, mt- 2), vitellogenin (vit-2, vit-6), cytochrome p450 fami ly protein 35A2 (cyp35a2), glutathione-S-transferase (gst-4), superoxide dismutase-1 (sod-1), catalase-2 (ctl-2), C.
제안 방법
- 1, 1, 10 mg/L)와 무처리군 1개로 구성하여 24 well plate에 동조화한 어린 성충 10마리씩을 넣어 20℃에서 24시간을 배양했다. 24土 1 시간이 지난 후, 광학현미경으로 운동상태를 관찰하고 백금선으로 건드려 보았을 때 움직임이 없는 것을 죽은 것으로 계수하여 반 치사 농도 LC50 (median lethal concentration)을 결정 흐]였다.
- 5% agarose gel (Promega, Medisonm WI, USA)에 올려서 전기영동을 하고, 정량을 위해 TFX-20.M LTV transilluminator (Vilber Lourmat, Marne la Vallee, France)에 gel을 올려 Kodak EDAS 290 image analyzer (Kodak, Rochester, NY, USA) 로분석하였다.
- 15mg/L로 나타났다 (Table 2). 본 결과를 바탕으로 dimethly sulfoxide (DMSO)로 NP 를 1/1, 000, 1/100, 1/10로 희석하여 유전자 발현 및 생장, 생식, 발달 실험을 실시할 농도를 선정하였고, 이는 0.0001, 0.001, 0.이 mg/L로 결정 하였다.
- 생장 및 생식 독성 실험 농도와 동일한 농도의 NP을 agar에 직접 투여하여 OP50을 먹이로 포함한 NGM배지를 만든 뒤, 동조화하여 얻은 L4기의 C. elegans를 한 마리씩 각각 옮겼다. 옮긴 시점을 기준으로 96시간 동안 12시간마다 관찰하며 알, LI ~L3, L4, 성충의 갯수를 계수하고, 그 값을 각각의 단계별로 나타내었다.
- elegans p53-like protein (cep-1), apoptosis enhancer (ape-1)을 조사하였다. 생장과 생식에 미치는 영향을 조사하기 위해서는 C. 의 몸체 길이와 체내 알 수를 계수하였으며, 발달 생식에 미치는 영향을 조사하기 위해서는 노출 상태에 서의 알 수와 부화되는 수를 계수하였다.
- 에 내분비계 장애 의심 물질로서 실생활에서의 사용량을 점차 금지하고 있는 NP를 적용하여 스트레스관련 유전자의 발현과 생장, 생식, 발달의 수준에서 영향을 조사하였다. 스트레스 관련 유전자로는 heat shock protein (hsp 16-1, hsp 16-2, hsp 16-48, hsp 70), metallothionein (mt-1, mt- 2), vitellogenin (vit-2, vit-6), cytochrome p450 fami ly protein 35A2 (cyp35a2), glutathione-S-transferase (gst-4), superoxide dismutase-1 (sod-1), catalase-2 (ctl-2), C. elegans p53-like protein (cep-1), apoptosis enhancer (ape-1)을 조사하였다. 생장과 생식에 미치는 영향을 조사하기 위해서는 C.
- 앞서 실시한 급성독성실험결과로 얻은 NPLCso 의 1/1, 000, 1/100, 1/10로 희석하여 만든 NP을 K- media에 노출 시키고 동조화 과정을 거쳐 얻은 C. elegans 어린 성충을 넣은 후 24시간을 2(TC에서 배양하여 Phenol-chloroform법으로 mRNA를 추출하였다. 추출한 mRNA는 RT Premix kits (Bioneer, Seoul, Korea)를 사용하여 cDNA로 역 전사 (Reverse transcription) 시 킨 두] , PCR Premix kits (Bioneer)를이용하여 PCR (Polymerase chain reaction)을 실시하였다.
- elegans를 한 마리씩 각각 옮겼다. 옮긴 시점을 기준으로 96시간 동안 12시간마다 관찰하며 알, LI ~L3, L4, 성충의 갯수를 계수하고, 그 값을 각각의 단계별로 나타내었다.
- 현미경 아래에서 한 마리의 전체 몸체 길이를 재고 이어서 체내의 알 수를 계수하였다. 이때 한 농도 당 100마리씩 측정하였고 이 수치를 %로 분석하였다.
- elegans 어린 성충을 넣은 후 24시간을 2(TC에서 배양하여 Phenol-chloroform법으로 mRNA를 추출하였다. 추출한 mRNA는 RT Premix kits (Bioneer, Seoul, Korea)를 사용하여 cDNA로 역 전사 (Reverse transcription) 시 킨 두] , PCR Premix kits (Bioneer)를이용하여 PCR (Polymerase chain reaction)을 실시하였다. PCR을 위한 primer는 C.
- 현미경 아래에서 한 마리의 전체 몸체 길이를 재고 이어서 체내의 알 수를 계수하였다. 이때 한 농도 당 100마리씩 측정하였고 이 수치를 %로 분석하였다.
대상 데이터
- NP 노출시험에는 K-media (0.032 M KC1, 0.051 M NaCl)를 사용하였고, C. elegans는 10% sodium aldehyde용액을 이용하여 동조화시킨 알을 3일간 배양하여 얻은 어린 성충을 이용하였다. 노출 후 배양 조건은 20℃에서 24시간을 기준으로 OP50을 첨가하지 않고 두었다.
- 추출한 mRNA는 RT Premix kits (Bioneer, Seoul, Korea)를 사용하여 cDNA로 역 전사 (Reverse transcription) 시 킨 두] , PCR Premix kits (Bioneer)를이용하여 PCR (Polymerase chain reaction)을 실시하였다. PCR을 위한 primer는 C. elegans database (www.wormbase.org)에서 얻은 염기서열로부터 제작하였다(Table 1). 결과물은 ethidium bromide (Bio- neer)를 넣은 1.
- 본 연구에 사용한 토양선충은 wild-type C. ele gans Bristol strain N2로, 이 종은 Brenner (1974)°] 정립한 표준방법에 의하여 nematode growth medi um (NGM)ofl 대장균의 일종인 OP50을 먹이로 첨가하여 20℃ 배양기에서 배 양을 하였다.
데이터처리
- 급성독성실험 결과는 Probits을 이용하여 구하였고 유전자 발현실험의 대조군과 실험군의 통계적 차이는 모수적 방법 인 T 검정을 실행하였다.
성능/효과
- 96시간의 장기간 조사를 통해 한 마리의 성충으로부터 시작된 다음 세대에서의 알과 생식선이 보이지 않는 L1 〜L3기와, 생식선이 나타나기 직전 초기증상을 갖는 L4기와 성충기의 단계가 나타나는 과정을 시간에 따라 조사해 본 결과 발달단계가 무처리군에 비해 NP을 처리한 C. 에서 느리게 나타나는 것을 알 수 있었다. 초기에 나타난 알 수가 시간이 흐름에 따라 빠르게 다음 단계로 발달해 가는 무처리군에 비해, NP에 노출시킨 C.
- C. elegans^ NP에 노출시켜 스트레스관련 유전인자의 발현량을 살펴본 결과(Fig. 1)NP에 의해 스트레스 유전자의 발현량이 ape-1, cyp35a2, vit-2, vit-6을 제외하고는 크게 변화한 것은 없었다. 그러나, NP에 의해 vit-6는 무처리군과 비교했을 때 최고 1.
- NP의 급성독성실험 결과를 probit 분석한 결과, 24시 간 LC50은 0.15mg/L로 나타났다 (Table 2). 본 결과를 바탕으로 dimethly sulfoxide (DMSO)로 NP 를 1/1, 000, 1/100, 1/10로 희석하여 유전자 발현 및 생장, 생식, 발달 실험을 실시할 농도를 선정하였고, 이는 0.
- elegans에서는 각각의 .단계로의 발달도 늦고, 2 세대의 첫 성충이 나타나는 시점도 대조군에 비해 히 최고농도인 0.01 mg/L에 노출시킨 C. elegans게약 12시간가량 늦게 나타났음을 알 수 있었다. 특 서는 알에서 다음 단계인 L1 으로 진행 이 전혀 이루어지지 않는 결과를 나타내었다.
- elegans$\ 몸체 길이와 체내 알 수의 변화를 조사하였다. 동조화시킨 어린 성충에게 NP 를 반수치사량 농도로 노출시키고 몸통 길이를 조사해 본 결과는 (Fig. 2a) 무처리군에 비해 큰 변화없 이 평균 1.2 mm의 분포를 나타내 었다. 체내 알 수의 변화량 역시 눈에 띄게 변화가 조사되지는 않았으나, 최고농도 0.
- 특 서는 알에서 다음 단계인 L1 으로 진행 이 전혀 이루어지지 않는 결과를 나타내었다. 또한 1세대 성충이 계속해 알을 생식하였으나 그 증가율이 점차감소되어 실험이 종료되는 96시간의 시점에서의 알 수가 무처리군의 성충이 실험시작 후 약 60시간 안에 낳은 알 수에도 못 미치는 결과가 나타났다.
- 본 연구 결과 NP에 노출된 C. elegansS] 스트레스 관련 유전자중 vit-6, vit-2, ape-1, cyp35a2 등의 유전자는 발현이 증가되었고, 생리학적 수준에서의 독성영향으로는 NP에 의해 급격하게 발달이 저해되는 결과를 얻을 수 있었다. C.
- 특히 발달장애의 경우는 단기간 노출한 NP에서는 큰 영향을 나타내지 않으나, 만성으로노출시킨 경우에는 부화율이 눈에 띄게 떨어진다고 보고된 바가 있다(Ward and Boeri, 1990b). 본 연구에서는 LC50의 1/10 희석 농도에서 알 생성률이 무 처리 군에 비해 크게 떨어짐을 알 수 있었고, 발달시험에서는 처리군에서 발달이 늦어진 것을 볼 수 있었다. 과거에 보고된 바에 의하면 NP의 발달변수는 성장과 생식변수에 비해 그리 민감하지 않은 것으로 보고되었으나 (Brooke, 1993a; EPA, 2003), 본 연구에서 C.
- , 2002). 본 연구에서는 NP의 생리학적 영향 외에도 분자수준에서의 영향을 조사하여 바이오마커의 가능성을 살펴보았는데, 스트레스관련 유전자 14종을 이용하여 발현 정도를 조사해 본 결과로 vit-6, vit-2, cyp35a2, ape-1 의 유전자가 처리군에서 증가된 것을 알 수 있었다. 특히 vitellogenin류의 유전자인 vit-6가 그 중에서 두드러 지게 변화하는 경향을 나타내었다.
후속연구
- , 2002). 본 연구 결과는 다른 연구 결과들과 함께 C. elegans7\ NP 의 토양환경 독성평가를 위한 생물종으로서 가능성이 매우 높음을 확인할 수 있었으며 분자 수준에서의 내분비계 관련 유전자의 연구에 있어서 매우 흥미로운 토양 지표 생물종이 될 것으로 기대된다.
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