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문제 정의
- elegans를 대상으로 내분비계 장애물질로 추정되는 phen이류 독성을 연구한 보고는 없다. 따라서 본 연구에서는 phenol류가 5의 생식기능과 운동능력에 미치는 영향을 연구하고자 하였다.
- 본 연구에서는 내분비계 장애물질로 선정된 페놀류 9종이 C. eleganse 미치는 영향을 통해 페놀 류의 독성 시험 모델로서 사용 가능한지를 확인하고자 하였다.
제안 방법
- 2-propylphenol, 4-propylphenol, 2-tert-butylphe- nol, 3-tert-butylphenol, 4-tert butylphenol, 2- phenylphenol, 4-phenylphenol, nonylphenol, 4- dodecylphenoL의 C. e/egans에 대한 사망률을 측정하기 위해, 최종 농도 0.1, 1.0, 10, 100, 1,000μM에서 30마리 중 C. elegans의 살아남은 개체 수를 측정하였다. 이를 토대로 LC5치를 Table 1에 나타냈 다.
- 0, 10, 100, 1,000 되게 K-medium으로 희석하여 500 [1L씩 24-well 넣고 3일 동안 보관한 egg plate에서 동조화된 젊은 성충을 30±1마리씩 취해 각 well에 옮겼다. 20℃ BOD incubator에서 24시간 배양하면서 대조군과 비교하여 관찰하였다. 대조군은 K- medium에 0.
- 0, 10, 100, 1,000μM 되게 K-medium으로 희석 하여 500 piL씩 24-well 넣고 3일 동안 보관한 egg plate에서 동조화된 젊은 성충을 5마리씩 취해 각 well에 옮겼다. 20℃ BOD incubator에서 보관하면서 24시간 후 현미경을 통해 대조군의 움직임 속도와 비교하여 같거나 1초일 경우를 거의 정상적인 움직임, 4±1초일 경우를 움직임이 다소 느림, 6±1초일 경우를 활발한 운동을 하지 않음, 10±1초일 경우를 약간의 움직임만 보임, 10±1초 이상일 경우를 거의 움직이지 않음으로 하여 총 5단계로 나누어 관찰하였다 (Dhawen et al., 1999).
- C. elegans의 생식기능에 미치는 영향을 알아보기 위해, 페놀류를 가한 후 C. eZegg가 낳은 알의 개수를 세어 대조군에 대한 비율로 비교하였다 (Table 2). 그 결과 모든 phenol류는 contr이과 비교하여 알의 개수가 유의성(PV0.
- C.gd의 운동 속도에 미치는 영향을 알아보기 위해, 최종 농도 o.l, 1.0, 10, 100, 1,000|1M에서 C. elegans의 운동 속도를 포함한 움직임을 보았으며, 거의 정상적인 움직임, 움직임이 다소 느림, 활발한 운동을 하지 않음, 약간의 움직임만 보임, 거의 움직이지 않음으로 5단계로 나누어 대조군과 비교하여 Table 3에 나타냈다. 최저농도인 0.
- Phenol류가 생식독성에 미치는 영향을 알아보기 위해 72시간동안 C, elegans가 낳은 알의 개수를 측정하였다. 최저농도인 0.
- 20℃ BOD incubator에서 24시간 배양하면서 대조군과 비교하여 관찰하였다. 대조군은 K- medium에 0.5% DMSO를 가하였다. 현미경으로 관찰되지 않거나, 움직이지 않는 개체는 모두 죽은 것으로 간주하였으며 살아서 움직이는 개체의 수를 측정하였다.
- 20℃ BOD incubator에서 보관하면서 72±1시간 후 알의 수를 측정하였다. 실험은 3회 반복 실시하였다 (Dhawen et al., 1999).
- C.에 대한 페놀류의 급성독성을 알아보기 위해 페놀류의 최종농도가 0.1, 1.0, 10, 100, 1,000 되게 K-medium으로 희석하여 500 [1L씩 24-well 넣고 3일 동안 보관한 egg plate에서 동조화된 젊은 성충을 30±1마리씩 취해 각 well에 옮겼다. 20℃ BOD incubator에서 24시간 배양하면서 대조군과 비교하여 관찰하였다.
- 페놀류를 최종농도가 0.1, 1.0, 10, 100, 1,000μM 되게 K-medium으로 희석하여 500 |L씩 24-well 넣고 3일 동안 보관한 egg plate에서 동조화된 젊은 성충을 5마리씩 취해 각 well에 옮겼다. 20℃ BOD incubator에서 보관하면서 72±1시간 후 알의 수를 측정하였다.
- 페놀류의 최종농도가 0.1, 1.0, 10, 100, 1,000μM 되게 K-medium으로 희석 하여 500 piL씩 24-well 넣고 3일 동안 보관한 egg plate에서 동조화된 젊은 성충을 5마리씩 취해 각 well에 옮겼다. 20℃ BOD incubator에서 보관하면서 24시간 후 현미경을 통해 대조군의 움직임 속도와 비교하여 같거나 1초일 경우를 거의 정상적인 움직임, 4±1초일 경우를 움직임이 다소 느림, 6±1초일 경우를 활발한 운동을 하지 않음, 10±1초일 경우를 약간의 움직임만 보임, 10±1초 이상일 경우를 거의 움직이지 않음으로 하여 총 5단계로 나누어 관찰하였다 (Dhawen et al.
- 5% DMSO를 가하였다. 현미경으로 관찰되지 않거나, 움직이지 않는 개체는 모두 죽은 것으로 간주하였으며 살아서 움직이는 개체의 수를 측정하였다. 실험은 3회 반복 실시하였다.
대상 데이터
- 2-propylphenol, 4-propylphenol, 2-tert-butylphe- nol, 3-tert-butylphenol, 4-tert-butylphenol, 2-phenyl- phenol, 4-phenylphenol, nonylphenol, 4-dodecylphe- nole Sigma제품을 사용하였다.
- 본 실험에 사용한 C. 이egans는 미국 Minnesota 주립대학에 있는 Caenorhabiditis Genetics Centere.부터 분양 받았다.
데이터처리
- SAS program을 이용했으며, p value가 0.05 미만일 때 유의성이 있는 것으로 판정하였다.
성능/효과
- 알의 개수에 있어서는 농도 의존적인 독성을 나타냈으며 1 mM에서 2-tert-butylphenol, 4-phenyl- phenol, nonylphenole 모두 사망하여 알이 발견되지 않았다. 2-propylphenol, 4-tert-butylphenol, 4- phenylphenol, 4-dodecylphenole 100 [M, 2-tert- butylphenol, nonylphcn이은 10 pM 이상에서는 알의 개수가 대조군에 비해 50% 이상 줄어들었다. 특히 4-propylphenol, 3-tert-butylphenol, 2-phenylphenol의 경우, 1.
- 5배 낮았으며, tert-butylphenol의 경우 2번 위치가 가장 낮았으며 4번 위치의 tert-butylphenol°1 가장 높은 LD50치를 나타냈다. 2번 위치의 tert- butylphenole 3번 위치에 비해 2.2배, 4번 위치에 비해 4.2배 낮아 가장 강한 독성을 나타냈다. Pheny- Iphenol의 경우 2-phenylphenole 4-phenylphenol에 비해 31.
- 같은 위치에 있는 2-propylphenol, 2-tert-butylphe- nol, 2-phenylphenol는 탄소수가 적을수록 생식독성이 강하게 나타났다. 4-propylphenol, 4-tert-butylphe- nol, 4-phenylphenol, 4-dodecylphenole] 경우도 탄소수가 적을수록 독성이 강하게 나타났다. 이상의 결과로 phenol류는 C.
- C. eZegais 에 대한 사망률을 측정한 결과, 대조군은 30마리 모두 살아있는 반면에 phenol류를 처리함으로써 급격하게 사망하였다. LD50치는 4번 위치의 propylphenol] 2번 위치의 propylphenol보다 4.
- LD50치로 비교해본 결과, 4-propylphenol이 가장 독성이 강한 반면 4-phenylphenol 이 가장 약한 독성을 나타냈다. Propyl기의 위치에 따라 4-propy- Iphenol] 2-propylphenol보다 독성이 강하였으며, tert-butyl기의 위치에 따라 2, 3, 4-tert-butylphenol 순으로 독성이 강하게 나타났다.
- LD50치로 비교해본 결과, 4-propylphenol이 가장 독성이 강한 반면 4-phenylphenol 이 가장 약한 독성을 나타냈다. Propyl기의 위치에 따라 4-propy- Iphenol] 2-propylphenol보다 독성이 강하였으며, tert-butyl기의 위치에 따라 2, 3, 4-tert-butylphenol 순으로 독성이 강하게 나타났다. Phenyl 기의 위치에 있어서는 2-phenylphenol이 4-phenylphen이보다 강했다.
- 같은 위치에 있는 2-propylphenol, 2-tert-butylphe- nol, 2-phenylphenol는 탄소수가 적을수록 생식독성이 강하게 나타났다. 4-propylphenol, 4-tert-butylphe- nol, 4-phenylphenol, 4-dodecylphenole] 경우도 탄소수가 적을수록 독성이 강하게 나타났다.
- 같은 위치에 있는 2-propylphenol, 2-tert-butylphe- nol, 2-phenylphenol는 탄소수가 증가할수록 독성이 강하게 나타났으며 반면에 4-dodecylphenol을 제외한 4-propylphenol, 4-tert-butylphenol, 4-phenylphe- nol의 경우 탄소수가 적을수록 독성이 강하게 나타났다. 이상의 결과를 종합해 볼 때, phenol에 반응 기가 붙어 있는 위치에 따라, 탄소수에 따라 독성이 다름을 확인할 수 있었다.
- eZegg가 낳은 알의 개수를 세어 대조군에 대한 비율로 비교하였다 (Table 2). 그 결과 모든 phenol류는 contr이과 비교하여 알의 개수가 유의성(PV0.05) 있게 감소했다. 알의 개수에 있어서는 농도 의존적인 독성을 나타냈으며 1 mM에서 2-tert-butylphenol, 4-phenyl- phenol, nonylphenole 모두 사망하여 알이 발견되지 않았다.
- 독성발현에 따른 움직임의 변화를 관찰한 결과 0.1 |1M에서는 대조군에 비해 움직임이 다소 느렸 으며 LOpM의 경우 움직임이 다소 느리거나 활발한 운동을 하지 않았다. 10, 100 MM의 경우 활발한 운동을 하지 않거나 약간의 움직임만 보이는 것도 있었다.
- 05) 있게 감소했다. 알의 개수에 있어서는 농도 의존적인 독성을 나타냈으며 1 mM에서 2-tert-butylphenol, 4-phenyl- phenol, nonylphenole 모두 사망하여 알이 발견되지 않았다. 2-propylphenol, 4-tert-butylphenol, 4- phenylphenol, 4-dodecylphenole 100 [M, 2-tert- butylphenol, nonylphcn이은 10 pM 이상에서는 알의 개수가 대조군에 비해 50% 이상 줄어들었다.
- 4-propylphenol, 4-tert-butylphe- nol, 4-phenylphenol, 4-dodecylphenole] 경우도 탄소수가 적을수록 독성이 강하게 나타났다. 이상의 결과로 phenol류는 C. eleganse 생식에 매우 강한 영향을 줌을 알 수 있었다.
- 같은 위치에 있는 2-propylphenol, 2-tert-butylphe- nol, 2-phenylphenol는 탄소수가 증가할수록 독성이 강하게 나타났으며 반면에 4-dodecylphenol을 제외한 4-propylphenol, 4-tert-butylphenol, 4-phenylphe- nol의 경우 탄소수가 적을수록 독성이 강하게 나타났다. 이상의 결과를 종합해 볼 때, phenol에 반응 기가 붙어 있는 위치에 따라, 탄소수에 따라 독성이 다름을 확인할 수 있었다.
- 3배 낮았다. 탄소수 9개인 nonylphenole 탄수수 10개인 4-dodecylphenol보다 1.2배 낮았다.
후속연구
- 현재 내분비계의 요소들을 조절하거나 이들과 반응하는 물질들의 영향을 평가하기 위해 수많은 iw7roassay가 사용되고 있으며 이들 방법의 대부분은 작용기전을 규 명하거나, 대상물질의 잠재적 위해성을 평가하는데 이용되어왔다. 그러나 이 방법은 in vivo assay 결과 와의 상관관계 확보 등 그 이용에 한계가 있고, 현재로는 in vitro assay는 생체내 시험을 대체하기보 다는 보완적 측면에서 이용될 수 있다고 결론을 내리고 있다. In vivo assay는 시험믈질을 시험동물 에 직접 투여하여 실시하는 시험으로서 물질의 영향을 직접적으로 확인할 수 있는 장점이 있다.
- 페놀은 유독물로 피부암과 생식이상을 일으키고 태아에도 영향을 끼치는 유해물질이다. 따라서 본 연구에 사용한 페놀류는 내분비계 장애물질로 추정되고 있을 뿐, nonylphenol을 제외하고는 아직 그 독성연구가 시작단계에 있으므로 이에 대한 연구가 시급하다고 사료된다. Kwack 등은 4-propylphenol, 4-butylphe- nol, 4-t-butylphenol, 4-pentylphenol, 4-nonylphenol, 4-octylphenol, 4-t-octylphenol, and 4-phenylphenol 등의 페놀류에 대해 MCF-7cell 증식 효과와 estrogen receptoi와의 결합능을 in vitro test를 통해 연구했으며 난소 절제술을 실시한 SD rat에서 utero- trophic assay와 Calbindin-D9K mRNA expression을 통해 estrogen 유사작용을 확인하였다(Kwack M .
- 본 연구를 통해 앞으로 내분비계 장애추정물질 검색 동물모델로서 C. $의 가능성을 확인했으며, 독성기전 및 세포나 조직 내의 수천 개 유전자의 발현 양상 (gene expression pattern)을 한번에 볼 수 있게 하는 도구이며 여러 세포나 조직의 수 천 개 유전자의 발현도(expression level)를 한번의 측정을 통한 유전자 발현 관련 연구를 가능케 하는 microarray기법을 이용한 toxicogenomics, 체내 biomarker에 관한 추가연구를 통해 내분비계 장애 추정물질 검색 표준 시험법을 개발할 수 있을 것으로 기대한다.
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