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문제 정의
- 그 이유는 닭 도축시 피부 관련 도체 폐기율이 증가하고 수출 육계의 경우, 사육 기간이 길어짐에 따라 MDV 감염 가능성이 높아지고 그로 인한 피해가 예상되기 때문이었다. 또한, IBD 백신 접종에 사용되었던 In- Ovo 백신 접종 방법(18일령 계태아에 백신을 접종)이 편리성과 안전성을 확인됨에 따라 이 방법을 육계에 도입하여 MD 백신의 효용성을 평가하기 위해 본 실험을 수행하였다.
- 본 실험은 육계에서의 Marek's disease(MD) 백신에 대한안전성과 효용성을 국내에 기 도입된 18일령 계란에서의 백신 접종 방법(In-Ovo vaccination) 을 이용하여 평가하고자 실시하였다.
제안 방법
- In-Ovo 백신 접종에 대한 안전성을 확인하기 위하여 MD 감염 시 흔히 나타나는 면역 억제 여부를 백신 접종 후의 항체 역가 수준으로 비교하였다. 특히, MD 백신은 생독 백신이며 본 시험에 사용한 혼합 백신은 면역 억제를 유발하는 serotype 1이 포함되어 있기 때문에 면역 억제 여부에 대한판단이 필요하다.
- MD 백신의 효용성을 평가하기 위해서 폐사율, 사료 효율, 출하 시 평균 체중, 출하 일령을 측정하여 백신 접종 농가와 백신 비접종 농가로 구분하였다(Table 3, 4). 생산성 지수는(평균 체중×출하율) ×100 / (출하 일령×사료 효율)로 계산되는데, 백신 접종군과 백신 비접종군의 생산성 지수는 각각의 평균이 236±37.
- MDV의 DNA 중 Meq 유전자를 증폭시키기 위해 제작된 primer를 이용하여 Nested PCR을 실시하였다. MDV 양성율을 지역별로 조사한 결과 전체 46농가중 12농가가 양성이었다(26.
- 2차 항체에 효소가 붙어있는 conjugate를 각 well마다 100 µL씩 넣고 30분 반응 시킨 후 다시 한번 Plate에 들어있던 내용물을 버리고 증류수로 4회 세척하였다. 그 다음 각 well에 substrate를 100 µL 를 넣고 15분 반응시킨 후 stop solution을 100 µL를 넣어 반응을 정지시키고 ELISA reader(Merck, USA)를 이용하여 흡광도를 측정한 후 주어진 분석 프로그램( X check Ver. 3.0) 에 의하여 역가를 계산하였다.
- 막자 사발에 깃털과 적당한 양의 PBS buffer 용액을 넣어 유제한 후 원심 분리하여 획득한 상층액을 사용하여 Viral gene spin DNA/RNA extraction kit(iNtRon biotechnology, 성남, 경기도)로 DNA를 추출하였다. 그 후 MD viral DNA에 특이적인 primer를 사용하여 nested PCR을 실시하였다.
- 접종한 백신은비 병원성주인 serotype 1의 CVI988과 serotype 3인 FC 126 을 혼합한 제품(Merial Korea, Seoul Korea) 이었다(Sharma 등, 1984; Sharma 등, 2002). 대상 농가에 대해서는 육계 농가에서 일반적으로 실시하는 뉴캣슬병(Newcastle disease: ND) 과 전염성 F낭병(Infectious Bursal Disease: IBD 백신)에 대한 백신은 농장 자체의 프로그램에 따라 수행하였다.
- 그러나 육계 출하 시 닭 도죽장에서 피부 관련 도체 폐기율이 증가함에 따라 육계 농장에서의 MDV 오염 문제가 제기되었으며 자연히 백신 접종도 거론이 되고 있다. 따라서 본 실험은 국내에 기 도입된 18일령 계란에서의 백신 접종 방법(In-Ovo vaccination)을 육계에 적용하여 백신의 안전성과 효용성을 육계 농가에서 백신 접종군과 백신 비접종군으로 나누어 평가하였다.
- 같이 채취하였다. 막자 사발에 깃털과 적당한 양의 PBS buffer 용액을 넣어 유제한 후 원심 분리하여 획득한 상층액을 사용하여 Viral gene spin DNA/RNA extraction kit(iNtRon biotechnology, 성남, 경기도)로 DNA를 추출하였다. 그 후 MD viral DNA에 특이적인 primer를 사용하여 nested PCR을 실시하였다.
- 백신 접종 농가와 백신 비접종 농가 사이의 MD 감염률을 비교하여 백신의 야외 감염에 대한 방어능을 평가하였다. 두 그룹 간의 MDV에 대한 야외 감염률은 차이가 없었다 (Table?).
- 백신 접종 여부에 따른 면역 억제 정도를 출하 시의 IBD 역가, ND 역가, B/B ratio를 통하여 평가하였다. IBD와 ND 의 항체 역가를 살펴보면 IBD ELISA 항체 역가는 백신 비접 종군과 백신 접종군의 평균이 각각 4557±4032.
- 비교하였다. 백신에 의한 면역 억제 현상을 파악하기 위하여 접종 농장에서 채취한 혈청에서의 항체 역가 수준과 F낭의 무게 변화를 검사하였다.
- 백신의 접종이 생산성 향상에 기여를 하였는지를 확인하기 위하여 육계 농가의 생산성을 평가하는 생산 지수를 백신 접종군과 비접종군간에 비교를 하였다. 생산 지수는 출하 평균 체중, 출하율, 사료 효율, 출하 일령을 근거로 계산되어지며 두 집단간 비교하여 본 결과 백신 접종군이 비접종군에 비하여 다소 높게 나타났지만 통계학적으로는 유효한 차이가 인정되지 않았다.
- 검사 대상 시료는 닭, 모낭이 포함된 깃털, 혈청이었다.부검을 통하여 질병 유무를 파악하였고 F 낭(Bursa of Fabri- cius)을 채취하여 B/B ratio(F낭 무게/체중 x 1, 000)를 산출하였으며, 깃털은 Polymerase Chain Reaction(PCR)을 이 용하여MDV 유전자 검출에 사용하였다. 혈청에서는 Newcastle di- sease(ND) 와 Infectious Bursal disease(IBD) 에 대한 항체역가를 측정하였다.
- 시료로 제공된 생닭을 대상으로 각 개체 별로 체중과 F낭의 무게를 측정하여 B/B ratio를 산출하였으며 시료 채취 과정에서의 오차를 최소화하기 위하여 다음과 같은 방법을 이용하였다. 닭을 부검대 위에 등이 보이도록 눕혀 놓고, 항문근처의 미추가 절단되도록 피부와 근육을 제거하였다.
- 육계에서의 MD 오염율은 nested PCR을 이용하였으며 백신 접종군과 비접종군간의 생산성 차이를 출하 일령, 평균 출하 체중, 출하율, 사료 효율을 기본으로 하는 생산 지수를 측정하여 비교하였다. 백신에 의한 면역 억제 현상을 파악하기 위하여 접종 농장에서 채취한 혈청에서의 항체 역가 수준과 F낭의 무게 변화를 검사하였다.
- 부검을 통하여 질병 유무를 파악하였고 F 낭(Bursa of Fabri- cius)을 채취하여 B/B ratio(F낭 무게/체중 x 1, 000)를 산출하였으며, 깃털은 Polymerase Chain Reaction(PCR)을 이 용하여MDV 유전자 검출에 사용하였다. 혈청에서는 Newcastle di- sease(ND) 와 Infectious Bursal disease(IBD) 에 대한 항체역가를 측정하였다. 시료 채취는 농장별로 1일령, 3주령, 출하 시에 각각 10점 이상 채취하였다.
- 혈청이 분리되면 1, 500 rpm에서 10분간 원심분리를 한 후 상층 액을 이용하여 ND와 IBD에 대한 ELISA를 재조회사(IDE- XX Co. Maine, USA )에서 추천한 방법으로 다음과 같이 실시하였다. 혈청을 준비된 희석액으로 500배 희석하여 항원이 coating된 Plate에 100 µL 넣고 30분 동안 반응시킨 후 증류수를 이용하여 4회 세척하였다.
대상 데이터
- 검사 대상 시료는 닭, 모낭이 포함된 깃털, 혈청이었다.부검을 통하여 질병 유무를 파악하였고 F 낭(Bursa of Fabri- cius)을 채취하여 B/B ratio(F낭 무게/체중 x 1, 000)를 산출하였으며, 깃털은 Polymerase Chain Reaction(PCR)을 이 용하여MDV 유전자 검출에 사용하였다.
- 둔부 쪽과 경부 뒤쪽의 작은 크기의 솜털 모양 깃털을 모근과 같이 채취하였다. 막자 사발에 깃털과 적당한 양의 PBS buffer 용액을 넣어 유제한 후 원심 분리하여 획득한 상층액을 사용하여 Viral gene spin DNA/RNA extraction kit(iNtRon biotechnology, 성남, 경기도)로 DNA를 추출하였다.
- 혈청에서는 Newcastle di- sease(ND) 와 Infectious Bursal disease(IBD) 에 대한 항체역가를 측정하였다. 시료 채취는 농장별로 1일령, 3주령, 출하 시에 각각 10점 이상 채취하였다.
- 실험 대상은 (쥐 체리부로(충청북도 진천군 이월면) 계열 농가의 육계로서 백신 접종군과 비접종군으로 나누었으며, 이들 농가들은 다시 입추 시기, 입추 지역에 따라 구분을 하여 Table 1에 요약을 하였다. 전체 실험 대상 농가는 총 46 농가였으며, MD 백신 접종군이 22농가, 비접종군이 24 농가로 입추 시기는 8월부터 11월 사이였다.
- Table 1에 요약을 하였다. 전체 실험 대상 농가는 총 46 농가였으며, MD 백신 접종군이 22농가, 비접종군이 24 농가로 입추 시기는 8월부터 11월 사이였다. 농장 소재지는 경기도 충청남도, 충청북도, 경상북도였으며, 그 중 상주군과당진군이 각각 21농가와 12농가로 가장 많았다.
데이터처리
- SPSS(Statistical Package for the Social Sciences)의 비모수 적 검정인 Mann-Whitney test와 모수적 검정인 Student t-test를 이용하여 평균과 표준 편차를 계산한 후 각 요인 별로 95% 신뢰 구간 내에서의 유의성을 분석하였다^-value).
이론/모형
- 특히, MD 백신은 생독 백신이며 본 시험에 사용한 혼합 백신은 면역 억제를 유발하는 serotype 1이 포함되어 있기 때문에 면역 억제 여부에 대한판단이 필요하다. 국내 육계에서 일반적으로 접종하는 ND 와 IBD 백신을 접종한 후에 혈청 역가를 ELISA 방법을 이용하여 측정하였다. 면역 억제가 나타난 경우, 백신 접종시 정상적인 항체 형성이 되지 않기 때문에 백신 접종군과 비접종군간의 역가 비교는 간접적인 증거로 이용될 수 있다.
- 입식 대상 육계에 일반 용량의 1/4수준으로 MD 백신을 18 일령 계태아에 in-ovo 방법으로 접종하였다. 접종한 백신은비 병원성주인 serotype 1의 CVI988과 serotype 3인 FC 126 을 혼합한 제품(Merial Korea, Seoul Korea) 이었다(Sharma 등, 1984; Sharma 등, 2002).
성능/효과
- IBD, ND에 대한 항체 역가의 변화를 보면 IBD의 경우 3 주령까지 지속적으로 감소하다가 줄하시기에는 다시 증가하였으며, ND는 1일령을 기준으로 하여 출하 일령까지 지속적으로 감소하는 경향을 보였다<Table5). 또한 계군마다 약간의 차이가 있기는 하지만 B/B ratio의 변화는 3주령에 가장 높았지만 이 후 1일령보다 더 낮은 수치로 감소하는경향을 보였다(Table 5, 6).
- 이용하여 Nested PCR을 실시하였다. MDV 양성율을 지역별로 조사한 결과 전체 46농가중 12농가가 양성이었다(26.09%). 지역별로는 충남 지역이 5농가(35.
- 국내 육계에서의 MD 발생율을 파악하기 위하여 nested PCR을 실시한 결과 조사 대상 농장 중 26.09%가 오염되었으며, 백신 접종 농장과 비접종 농장간의 생산 지수의 차이는 통계학적으로 유의 한 차이가 없었다. 그러나 MDV 오염군에서의 MD 백신 접종 농장의 생산 지수가 비접종 농장보다 높아 간접적으로 효과가 있음이 인정되었다.
- 면역 억제가 나타난 경우, 백신 접종시 정상적인 항체 형성이 되지 않기 때문에 백신 접종군과 비접종군간의 역가 비교는 간접적인 증거로 이용될 수 있다. 그결과 백신 접종군과 비접종군 간에 ND와 IBD의 항체 역가수준이 통계학적으로 유효한 차이가 인정되지 않아 MS 백신접종에 따른 면역 억제 현상이 최소한 체액성 면역에서는없는 것으로 판단이 되었다. 이러한 결과는 MD 백신을 In- Ovo 방법으로 접종한 후 면역학적 및 병리학적 검사를 하였을 때 별다른 문제가 없었다는 보고와 일치하였다(Sharma 등, 1984).
- 그러나 백신 접종 여부에 관계없이 일령이 증가함에 따라 B/B ratio가 감소하는 현상과 출하 시 IBD 항체 역가를 볼 때 대부분의 농가가 IBD에 감염되었다는 것을 확인할 수 있었다. 이와 같이 국내의 육계 농가가 IBD 감염에 의한 피해가 광범위하다면 향후 MB에 의한 피해 혹은 백신 접종 후의 효용성을 평가하는데 많은 문제가 있을 것으로 추정된다.
- 05). 또한 각각의 요소별 유효성을 검토한 결과, 백신 접종이 두 계군의 생산성에 영향을미치지 않은 것으로 판단되었다.
- 감소하는 경향을 보였다<Table5). 또한 계군마다 약간의 차이가 있기는 하지만 B/B ratio의 변화는 3주령에 가장 높았지만 이 후 1일령보다 더 낮은 수치로 감소하는경향을 보였다(Table 5, 6).
- 05). 또한, B/B ratio는 MD외 감염군에서 MD 백신을 접종하였을 때 통계학적으로는 유효하지 않지만 높은 수준을 형성하였다(p=0.062, p>0.05)(Table 8).
- 두 그룹 간의 MDV에 대한 야외 감염률은 차이가 없었다 (Table?). 또한, MD 감염군과 MR 비감염군에 속하는 농가의사육지수를 비교하면 MDV 야외 감염군내에서는 백신 접종에 따른 사육지수에 차이가 인정 이 되지 않았지만, MDV 야외 비감염군에서는 백신 비접종 농가의 사육지수가 높은 것으로 나타났다(p=O.01, p<0.05). 또한, B/B ratio는 MD외 감염군에서 MD 백신을 접종하였을 때 통계학적으로는 유효하지 않지만 높은 수준을 형성하였다(p=0.
- 그러나 MDV 오염군에서의 MD 백신 접종 농장의 생산 지수가 비접종 농장보다 높아 간접적으로 효과가 있음이 인정되었다. 면역 억제여부를 파악하기 위한 검사에서는 두 그룹 간 B/B ratio 차이는 없었으나 두 계군 모두 출하 시 심한 위축을 보여주어혈청 검사 성적과 연계하여 볼 때 국내 육계 농장에서의 IBD 감염이 만연되어 있다는 것을 알 수 있었다.
- 백신 접종 농가와 백신 비접종 농가 사이의 MDV 감염률을 비교하여 본 결과, 백신의 방어 효과는 두 계군 사이에 뚜렷한 차이가 없었다. 이것은 MDV 감염률이 너무 낮고 원인체에 대한 방어율을 실험실내에서의 측정보다 야외농장에서 자연 노출 방법을 통하여 측정하는 것이 매우 어렵다는 사실을 말해준다 또한 이러한 결과는 실험실에서 병원성이 높은 MDV로 공격 접종을 실시한 후 백신의 효능을 평가할 수 있는 실험실 모델이 필요하며, MDV에 대한 백신을 하지 않고 선천적으로 저항성을 갖는 개체의 유전학적 특성과 IBD 감염에 의해 방어 능력이 감소된 개체가 있을 가능성도 고려해야 한다(Sharma 등, 2002).
- 접종군과 비접종군간에 비교를 하였다. 생산 지수는 출하 평균 체중, 출하율, 사료 효율, 출하 일령을 근거로 계산되어지며 두 집단간 비교하여 본 결과 백신 접종군이 비접종군에 비하여 다소 높게 나타났지만 통계학적으로는 유효한 차이가 인정되지 않았다. PCR 양성 농장에 국한하여 백신 접종군과 비접종군을 비교하였을 때도 백신 접종군이 다소 높았지만 마찬가지로 통계학적으로 유효한 차이가 없었다.
- 우선적으로 육계 농가에서 MD의 야외 감염 실태를 알아보고자 모낭을 채취하여 MD serotype 1에 대한 nested PCR 을 수행한 결과, 전체 46농가 중 12농가 즉 26.09%가 양성이었다. Sung 등(2000)에 의하면 국내 육계에서의 감염율이 30%라고 보고한 바 있어 본 논문의 결과와 비슷하였다.
후속연구
- 결론적으로 현재 국내 육계 농가에서 면역 억제 질병이 꾸준히 증가하고 있는 점을 감안하여 본 연구와 같이 육계에서의 MDV 감염에 대한 조사는 지속적으로 이루어져야 할 것으로 판단된다. 또한 잠복기가 다양하고 국내의 육계 사육 기간이 짧은 점을 감안할 때 농장에서의 사육 지수보다는 닭 도축장에서의 폐기율 비교가 앞으로 수행하여야 할 과제로 판단된다.
- 또한 잠복기가 다양하고 국내의 육계 사육 기간이 짧은 점을 감안할 때 농장에서의 사육 지수보다는 닭 도축장에서의 폐기율 비교가 앞으로 수행하여야 할 과제로 판단된다.
- 본 연구를 통해서 국내 육계에서의 MDV 오염율이 파악되었으며, In-Ovo 백신 접종에 의한 MD 백신 접종은 안전성에 있어서는 별다른 문제가 없었으나 효능면에 있어서는 MD 야외감염율이 낮고 IBD와 같은 면역 억제 질병의 감염이 만연되어 있어 정 확한 평가가 되지 않아 앞으로 후속 연구가 진행되어야 할 것으로 판단되었다.
- 그러나 백신 접종 여부에 관계없이 일령이 증가함에 따라 B/B ratio가 감소하는 현상과 출하 시 IBD 항체 역가를 볼 때 대부분의 농가가 IBD에 감염되었다는 것을 확인할 수 있었다. 이와 같이 국내의 육계 농가가 IBD 감염에 의한 피해가 광범위하다면 향후 MB에 의한 피해 혹은 백신 접종 후의 효용성을 평가하는데 많은 문제가 있을 것으로 추정된다.
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