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문제 정의
- 본 연구는 현재까지 명확한 원인이 밝혀져 있지 않고 이에 따라 근원적인 치료법 역시 부재함으로 인하여 어린이들에게 심각한 건강 장애를 가져오는 것으로 알려진 아토피성 피부염에 대한 실험동물 모형을 개발하기 위하여 수행되었다. 국내외적으로 본 질환 발생에 대한 면역학적 배경 기전을 이해하고 이에 근거한 치료 약제 개발에 많은 관심을 가지고 있으나 적합한 실험동물 모형이 없어 어려움을 겪고 있는 현실이다.
- 반면 근교계 혹은 폐쇄군과 같이 연구자들이 쉽게 확보할 수 있는 품종을 이용한 아토피성 피부염 유발 실험동물 모형은 현재까지 보고된 바 없다. 이에 본 연구는 접촉성 알레르기성 피부염을 유도하는 화학물질 중 일부는 피부 도포 횟수나 농도에 따라 type-2 response의 우세와 연관된 cytokine의 발현이 유도될 가능성에 대해 토의된 보고에근거하여(Kitagaki et al., 1997; Cumberbatch et al., 2005), 접촉성 피부염 유발 물질인 2, 4-dinitrochloro- benzene(DNCB)와 마우스를 사용하여 사람의 아토피성피부염과 유사한 면역학적 특성이 유도되는 실험 모형을 개발하였기에 일차적인 결과를 보고하는 바이다.
제안 방법
- 다음으로 동일 배양액내 생성된 L4의 수준을 IFNy 수준으로 나눈 생성비(생성 IL-4 수준XIO"생성 IFNy 수준)를 계산하였다(Fig. 3). DNCB 도포군에서 생성비는 BALB/c 마우스는 2.
- 이때 대조군 마우스에는 동량의 용매물질을 같은 방법으로 도포하였다. DNCB 도포 농도 및 주기는 서론에서 언급하였듯이 화학물질의 피부 도포 횟수나 농도에 따라 type-2 response의 발현이 유도될 가능성에 대해 토의된 선행 연구에서설정한 농도를 참조하여 결정하였다(Kitagaki et a!..1997; Plitnick et al., 2002; Cumberbatch et al.,2005). 매 실험시 DNCB 도포군으로 NC/Nga 마우스 및 BALB/c 마우스 각각 5마리, 용매물질은 각각 3마리를 사용하였고 2회 이상 반복실험하였다.
- 관찰하였다. DNCB 또는 용매물질의 두 번째 challenge가 끝난 다음날과 2주후 마우스가 앞다리를 이용해 안면 혹은 등부위 피부를 긁는 횟수를 30분간 측정하였다. DNCB 혹은 용매물질을 최초 감작하기 5일전과 DNCB 또는 용매물질의 두 번째 challenge가 끝난 4일후에 안와정맥총에서 채혈을 하였고 희생부검시 심장채혈을 시행하였다.
- DNCB 또는 용매물질의 두 번째 challenge가 끝난 다음날과 2주후 마우스가 앞다리를 이용해 안면 혹은 등부위 피부를 긁는 횟수를 30분간 측정하였다. DNCB 혹은 용매물질을 최초 감작하기 5일전과 DNCB 또는 용매물질의 두 번째 challenge가 끝난 4일후에 안와정맥총에서 채혈을 하였고 희생부검시 심장채혈을 시행하였다. 희생 부검시 비장을 세포 배양을 위해 무균적으로 적출하였다.
- 1. Hyperregulation of plasma IgE level in the NC/Nga mice (A) and BALB/c mice (B) challenged with 0.2% DNCB following 1% DNCB sensitization. Mice were sensitized twice with 100 ㎕ of 1% DNCB or vehicle (acetone : olive oil = 4 : 1 mixture) in a week and challenged twice with 100 ㎕ of 0.
- 2% DNCB following 1% DNCB sensitization. Mice were sensitized twice with 100 ㎕ of 1% DNCB or vehicle (acetone : olive oil = 4 : 1 mixture) in a week and challenged twice with 100 ㎕ of 0.2% DNCB or the vehicle at the following week. Mice were sacrificed at 19 days following the second DNCB or vehicle challenge for NC/Nga mice and at 28 days Allowing the second DNCB or vehicle challenge for BALB/c mice.
- 결론적으로 본 연구는 마우스에 DNCB를 피부도 포함으로써 전반적인 면역반응을 type-2 response로 유도하는모형을 제시하였다. 이러한 면역반응 편향성에 대한 기전규명 등 추가적으로 필요한 연구가 있지만 본 실험 모형은 아토피성 피부염 관련 여러 형태의 연구에 적절한 in vivo 모형으로 이용될 수 있음에 그 가치를 찾을 수 있겠다.
- 우선 1% DNCB 100 ㎕를 일주일에 3일 간격으로 2회 등 부위에 도포하여 감작시켰다(sensitization). 다음 1주일 동안에는 0.2% DNCB 100 ㎕를 3일 간격으로 2회 등 부위에 도포하였다(challenge). 이때 대조군 마우스에는 동량의 용매물질을 같은 방법으로 도포하였다.
- 다음으로 동일 개체내 lgG1과 lgG2a 수준의 상대적 변화를 분석하기 위하여 동일 혈장내 lgG1 수준을 lgG2a 수준으로 나눈 비를 계산하였다. BALB/c 마우스에서는 DNCB 도포군에서 6.
- 매 실험시 DNCB 도포군으로 NC/Nga 마우스 및 BALB/c 마우스 각각 5마리, 용매물질은 각각 3마리를 사용하였고 2회 이상 반복실험하였다. 마우스는 DNCB 혹은 용매물질의 2번째 challenge가 끝난 19일 후(NC/Nga 마우스) 또는 4주 후(BALB/c 마우스) 희생부검하였다.
- 관리하면서(사육실 온도: 25℃, 습도: 55%, 멸균 1차 증류수 공급) 실험하였다. 시험물질 도포 하루 전 실험동물의 등을 목에서부터 골반쪽으로 2X4 cm 되도록 제모하였고 이후 일주일 간격으로 제모하였다.
- 2% DNCB를 용매물질(acetone : olive oil = 4:1 혼합)에 녹여 제조하였다. 우선 1% DNCB 100 ㎕를 일주일에 3일 간격으로 2회 등 부위에 도포하여 감작시켰다(sensitization). 다음 1주일 동안에는 0.
- , 1996). 이를 위해 각 마우스에서 비장을 채취한 뒤 이 비장세포들을 24 well-culture plate에 분주한뒤 CO2 배양기에서 48시간 배양하였다. 이때 T 임파구의 in vitro 활성화를 위해 polyclonal stimulator로 immobilized anti-CD3 mAb(5 pig/5X 105 cells, BDPharmingen, San Jose, CA)을 사용하였고, 세포배양액 내 cytokine 수준 정량은 sandwich ELLSA 방법에 의하였다(김영옥 등, 2005).
- 아토피성 피부염의 대표적인 임상증상이다. 이에 본 연구에서는 BALB/c 마우스에서 DNCB 또는 용매물질의 두 번째 challenge가 끝난 다음날과 2주후 안면 혹은 등 부위 피부를 긁는 횟수를 30분간 측정하였다(Fig. 4). challenge가 끝난 다음날의 경우 DNCB challenge 마우스의 긁는 빈도가 용매물질 도포 대조군에 비해 약 25배정도로 유의하게 높았다.
- 일주일에 2회씩 피부에 나타나는 농양성 염증, 출혈, 습진, 홍반, 미란, 가피탈피 등의 아토피성 피부염 관련증상을 관찰하였다. DNCB 또는 용매물질의 두 번째 challenge가 끝난 다음날과 2주후 마우스가 앞다리를 이용해 안면 혹은 등부위 피부를 긁는 횟수를 30분간 측정하였다.
- DNCB 혹은 용매물질을 최초 감작하기 5일전과 DNCB 또는 용매물질의 두 번째 challenge가 끝난 4일후에 안와정맥총에서 채혈을 하였고 희생부검시 심장채혈을 시행하였다. 희생 부검시 비장을 세포 배양을 위해 무균적으로 적출하였다. 혈액에서 분리된 혈장은 사용 전까지 -80℃ 냉동고에 보관하였다.
- 희생부검시 채취한 혈액에서 혈장을 분리한 뒤 lgG1 과 lgG2a 수준을 측정하여 DNCB 도포군과 대조군간 비교를 하였다(Fig. 2). BALB/c 마우스의 경우 lgG1은 DNCB 도포군에서 9.
대상 데이터
- 1% DNCB(Sigma, St. Louis, MO)와 0.2% DNCB를 용매물질(acetone : olive oil = 4:1 혼합)에 녹여 제조하였다. 우선 1% DNCB 100 ㎕를 일주일에 3일 간격으로 2회 등 부위에 도포하여 감작시켰다(sensitization).
- 8주령의 특정병원체부재(specific pathogen free) 숫컷BALB/c 마우스(대한바이오링크) 및 12주령의 특정병원체 부재 숫컷 NC/Nga 마우스(일본 SLC)를 구입하여 무균적으로 관리하면서(사육실 온도: 25℃, 습도: 55%, 멸균 1차 증류수 공급) 실험하였다. 시험물질 도포 하루 전 실험동물의 등을 목에서부터 골반쪽으로 2X4 cm 되도록 제모하였고 이후 일주일 간격으로 제모하였다.
- ,2005). 매 실험시 DNCB 도포군으로 NC/Nga 마우스 및 BALB/c 마우스 각각 5마리, 용매물질은 각각 3마리를 사용하였고 2회 이상 반복실험하였다. 마우스는 DNCB 혹은 용매물질의 2번째 challenge가 끝난 19일 후(NC/Nga 마우스) 또는 4주 후(BALB/c 마우스) 희생부검하였다.
데이터처리
- 검토하였다. Single factor ANOVA와 Dunnett's f-test로 유의성을 검정하였다. 필요에 따라 Student's f-test 또는 Mann- Whitney tesi로 추가 유의성 검정을 시행하였고 p value가 0.
- 각 군간 측정치의 유의한 차이는 SigmaPlot 통계프로그램(SPSS, Chicago, USA)을 이용하여 검토하였다. Single factor ANOVA와 Dunnett's f-test로 유의성을 검정하였다.
- Single factor ANOVA와 Dunnett's f-test로 유의성을 검정하였다. 필요에 따라 Student's f-test 또는 Mann- Whitney tesi로 추가 유의성 검정을 시행하였고 p value가 0.05 미만일 때를 유의한 차이로 판정하였다. 그림에서 *는 p< 0.
이론/모형
- 이를 위해 각 마우스에서 비장을 채취한 뒤 이 비장세포들을 24 well-culture plate에 분주한뒤 CO2 배양기에서 48시간 배양하였다. 이때 T 임파구의 in vitro 활성화를 위해 polyclonal stimulator로 immobilized anti-CD3 mAb(5 pig/5X 105 cells, BDPharmingen, San Jose, CA)을 사용하였고, 세포배양액 내 cytokine 수준 정량은 sandwich ELLSA 방법에 의하였다(김영옥 등, 2005). 각 cytokine 별 lower detection limit는 다음과 같다: IL-4(4 pg/ml), IFNy(100 pg/ml).
- 혈장내 존재하는 IgE 수준을 대조군 마우스와 비교분석하기 위해 sandwich ELISA 방법에 의해 total IgE를 정량하였고, 또한 IgG의 isotype인 lgG1 및 lgG2a의 수준을 측정하기 위해서는 goat-anti mouse lgG1 및 lgG2a (Serotec, Raleigh, NC) capture antibody와 peroxidase conjugated anti-mouse IgG detection antibody를 사용하는 sandwich ELISA 방법을 이용하였다(김영옥 등, 2005).
성능/효과
- 있었다. DNCB를 도포한 마우스에서 아토피성 피부염의 대표적인 면역학적 지표인 혈장내 IgE 수준이 대조군 마우스에 비해 유의하게 항진되었고, type-1 response에 비해 상대적으로 우세한 type-2 response 활성화가 유도되었다. 즉, IL-4에 의해 isotype switching0] 유도되는 lgG1 수준이 IFNy에 의해 isotype switching되는 lgG2a 수준에비해 유의하게 증가된 것과 비장 T 임파구를 in vitro에서 활성화시켰을 때 IFNy에 비해 상대적으로 항진된 Ⅱ.
- 이들 연구와 본 저자들의 연구를 비교해볼 때 감작/challenge 방법 상 가장큰 차이점은 challenge시 귀가 아닌 감작부위와 동일한 등 부위를 선택하였다는 점과 challenge 도포를 매일하지 않고 3일 간격으로 시행하였다는 점이다. DNCB를 이용하여 사람에게서 접촉성 알레르기성 피부염 감작능력을 평가하였을 때 도포한 물질 총량보다는 단위 피부 면적당 도포한 DNCB의 농도가 감작 효율을 결정하는 중요한 인자라는 최근 한 연구결과를 고찰하면(Friedmann, 2006), 본 연구에서 challenge시 2X4 cm 등부위에 DNCB를도포함으로써 기존 DNCB를 이용한 접촉성 피부염 유도 시 선택하는 귀 부우](약 1X1 cm) 보다 8배 정도 넓은 면적에 도포함으로써 단위 피부면적당 DNCB challenge 농도를 저하시켰던 것이 type-2 response가 우세한 면역반응을 유도했을 가능성을 생각해 볼 수 있겠다. 이러한 관점에서 피부를 통해 항원이 침투하였을 때 이후 면역반응을 선택적으로 type-1 response 혹은 type-2 response중 어느 한쪽으로 진행시키는데 핵심적인 역할을 하는 것으로 알려진(Hilkens et al.
- 9H 비해 약 3배 정도 높았다. IL-4와 IFNy 수준 비교를 통한 type-2 cytokine 생성의 상대적 항진 여부를 평가한 결과 통계적인 유의성을가지지는 못하였지만 DNCB도포가 type-2 response로의 편향^을 촉진하는 경향을 볼 수 있었다.
- 4). challenge가 끝난 다음날의 경우 DNCB challenge 마우스의 긁는 빈도가 용매물질 도포 대조군에 비해 약 25배정도로 유의하게 높았다. challenge 14일이 지난 후에는 DNCB 도포군과 대조군간 차이가 감소하였지만 아직도 DNCB 도포군 마우스가 4배 정도(DNCB 도포군, 26.
- 등 부위 피부의 육안 증상을 관찰한 결과 사람에서 아토피 피부염 발현시 피부에 발생되는 농양성 • 홍반성 구진,가피탈피 증상을 DNCB를 도포한 BALB/c 마우스와 NC/ Nga 마우스 모두에서 관찰할 수 있었으며 심한 경우는 출혈 소견도 있었다(Fig. 5). 대조군 마우스에서는 이러한 육안 증상을 희생부검시까지 관찰할 수 없었다.
- , 1999; Boguniewicz and Beltrani, 2002)을 본 실험에서도 평가하였다, 비록 통계적으로 유의한 차이는 아니었더라도 BALB/c 마우스의 비장내 T 임파구를 in ec에서활성화시켰을 때 생성된 IL-4의 수준은 대조군에 비해 DNCB 도포군에서 높았으며(Table 1), 이러한 경향은 NC/Nga 마우스에서도 관찰되었다. 반면 IFNy 생성은 BALB/c 마우스에서는 DNCB도포군에 비해 대조군에서 높았으며 NC/Nga 마우스에서는 대조군과 DNCB 도포군간 주목할 만한 차이는 보이지 않았다.
- 대표적 면역학적 지표치이다. 본 DNCB를 이용한 아토피성 피부염 관련 면역능 변화 유도시험에서 BALB/c 마우스와 NC/Nga 마우스 모두에서 DNCB를 두 번째 challenge한 지 4일 뒤 측정한 IgE 수준은 대조군에 비해 각각 4배(Fig. 1B), 6배(Fig. 1A)로 유의하게 항진되어있었다. 이러한 IgE 수준 항진은 DNCB를 두 번째 challenge한 지 약 3~4주 지난 후까지도 유지되었는데 특히 BALB/c 마우스에서는 DNCB 두 번째 challenge4일 후 측정한 IgE 수준과 비슷한 수준을 유지하였다(Fig.
- DNCB를 도포한 마우스에서 아토피성 피부염의 대표적인 면역학적 지표인 혈장내 IgE 수준이 대조군 마우스에 비해 유의하게 항진되었고, type-1 response에 비해 상대적으로 우세한 type-2 response 활성화가 유도되었다. 즉, IL-4에 의해 isotype switching0] 유도되는 lgG1 수준이 IFNy에 의해 isotype switching되는 lgG2a 수준에비해 유의하게 증가된 것과 비장 T 임파구를 in vitro에서 활성화시켰을 때 IFNy에 비해 상대적으로 항진된 Ⅱ.4의 생성을 DNCB 도포 마우스에서 관찰할 수 있었다. 본 실험동물 모형이 사람의 아토피성 피부염에 대한 각종 연구를 수행하기 위한 모형으로서 확립되기 위해서는 병변이발생한 피부조직에서 비만세포(mast cell), 랑게르한스 세포, 임파구 등 아토피성 피부염 발생 관련 면역세포들의 침착여부 및 활성정도에 대한 추가적인 정보가 필요할것이다(Kiekens et al.
- 현재까지 아토피성 피부염 발생과 원인적 연관성을 갖고 있는 것으로 확인된 물질이 부재한 상황이어서 본 연구에서는 접촉성 알레르기성 피부염을 유발하는 것으로 알려진 DNCB를 이용하여 사람에게서 발생되는 아토피성피부염의 면역학적 이상과 유사한 과민반응 발현을 BALB/ c 마우스 및 NC/Nga 마우스에서 유도할 수 있었다. DNCB를 도포한 마우스에서 아토피성 피부염의 대표적인 면역학적 지표인 혈장내 IgE 수준이 대조군 마우스에 비해 유의하게 항진되었고, type-1 response에 비해 상대적으로 우세한 type-2 response 활성화가 유도되었다.
후속연구
- ,2002) 추가 연구도 필요할 것이다. 또한 본 연구에서 관찰된 type-2 response의 상대적 항진이 어느 시기까지유지될 수 있는지를 평가하기 위한 시계열적 실험이 보충되어야 할 것이다.
- 본 실험동물 모형에서 아토피성 피부염의 배경이 되는type-2 response로의 편향화가 유도된 기전에 대한 연구도 순차적으로 진행되어야 할 것이다. 고농도(1%)의DNCB로 2회 감작한 뒤 저농도(0.
- 4의 생성을 DNCB 도포 마우스에서 관찰할 수 있었다. 본 실험동물 모형이 사람의 아토피성 피부염에 대한 각종 연구를 수행하기 위한 모형으로서 확립되기 위해서는 병변이발생한 피부조직에서 비만세포(mast cell), 랑게르한스 세포, 임파구 등 아토피성 피부염 발생 관련 면역세포들의 침착여부 및 활성정도에 대한 추가적인 정보가 필요할것이다(Kiekens et al., 2001). 아울러 아토피성 피부염이 진행되고 있는 사람에게서 발현이 증가되는 것으로보고된 interleukin-13 및 interleukin-10과 같은 type-2 cytokine에 대한(Ohmen et al.
- , 2001). 아울러 아토피성 피부염이 진행되고 있는 사람에게서 발현이 증가되는 것으로보고된 interleukin-13 및 interleukin-10과 같은 type-2 cytokine에 대한(Ohmen et al., 1995; Tsunemi et al.,2002) 추가 연구도 필요할 것이다. 또한 본 연구에서 관찰된 type-2 response의 상대적 항진이 어느 시기까지유지될 수 있는지를 평가하기 위한 시계열적 실험이 보충되어야 할 것이다.
- 전반적인 면역반응을 type-2 response로 유도하는모형을 제시하였다. 이러한 면역반응 편향성에 대한 기전규명 등 추가적으로 필요한 연구가 있지만 본 실험 모형은 아토피성 피부염 관련 여러 형태의 연구에 적절한 in vivo 모형으로 이용될 수 있음에 그 가치를 찾을 수 있겠다.
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