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문제 정의
- 본 연구는 DNCB에 의해서 유도된 아토피질환모델 BALB/c 생쥐에서 어성초 혼합 한방 추출물의 항아토피 효과를 평가하여 신약 또는 기능성화장품 개발을 위한 기초자료를 얻기 위하여 수행하였다.
제안 방법
- Louis, MO, USA) 200 uL를 등 부위에 도포하여 면역화 반응을 유도하였다. 3일 후부터 3일에 1회씩 1.0% DNCB 용액 150 uL를 등 부위에 도포하여 아토피 피부염을 유도하였다. DNCB 용액을 등 부위에 2회 도포 이후부터 가피가 형성되면서 긁는 행동이 심화되었고, 등 부위의 가피가 벗겨지기 시작하여 아토피 피부염이 유발되었다.
- DNCB 유도에 의한 BALB/c 아토피마우스에서 어성초 혼합 한방추출물을 이용하여 제조한 크림의 항아토피 피부염증에 대한 효능을 평가 한 결과 다음과 같은 결론을 얻었다.
- 30분 이내에 precision microplate reader(Molecular Devices Inc, New York, USA)에 의하여 각 well의 흡광도를 측정하였다. IgE 측정은 2회 반복으로 시행하였다.
- well plate와 모든 시약을 실온으로 유지 하였고 농축세척액을 증류수로써 10배 희석하였다. IgE 표준물질과 완충용액을 이용하여 IgE 표준농도(0, 1.0, 10, 25, 50, 75, 100 ng/mL)를 각각 제조하였다. 세척액으로 96 well을 채워서 antibody-coated plates를 3회 세척하였다.
- 본 실험에 이용된 어성초, 석창포, 방풍, 황기, 비파잎, 고삼 및 삼백초는 강원도 춘천시 재래시장에서 구입하였다. 각각의 식물 20g을 에틸알코올 1 L을 가하여 80℃에서 3시간 동안 환류냉각장치를 이용하여 추출물을 획득하였다. 추출물을 여과지(Whatman No.
- 마우스의 등 부위를 깨끗하게 제모 후 피부의 미세 상처가 치유되도록 24시간 방치하였다. 아세톤과 올리브오일을 3:1로 혼합하여 제조한 면역교란물질로써 2.
- 5 cm2 넓이로 생검하여 10% 포름알데히드 용액에 고정한 후 조직염색 직전까지 4℃에서 보관하였다. 시료를 4% glutaraldehyde 용액(0.1M cacodylate buffer, pH 7.4)으로 고정 시킨 다음 dehydration, substitution, infiltration and embedding, polymerization, semi-thin sectioning 과정을 거친 후 에너지 여과 투과 전자현미경(EF-TEM, Leo 912AB, Carl Zeiss Inc., Germany)으로 촬영하였다. 피부조직은 피부의 전반적인 상태, 비만세포의 침윤과 탈과립화, 호산구의 침윤을 중심으로 관찰하였다.
- 실험동물의 사육실 온도는 20± 2℃, 상대습도 60± 5%로 유지하였고 조명은 12시간 주기로 조절하였다.
- 특히 야행성 동물인 흰쥐의 생리적인 특성을 고려해서 실험절차에 따른 흰쥐의 스트레스를 최소화하기 위해서 낮의 주기를 어둡게 (09:00∼21:00) 조절하였다. 실험식이는 AIN-76[18]에 기초한 정제식이를 배합 후 펠렛 형태로 조제하였다. 정제식이의 조성은 카제인 20.
- 4회 도포 이후부터 아토피 피부염이 심각한 상태로 유발되었으며 이때부터 실험용 크림을 염증발생 부위에 충분하게 발라주었다. 실험용 크림은 1일 2회씩(11:00, 17:00) 발라주었다. 실험용 크림을 발라주는 기간 중 자연치유에 의한 오차를 막기 위해 3일에 1회씩(10:00) 1.
- 실험용 크림은 1일 2회씩(11:00, 17:00) 발라주었다. 실험용 크림을 발라주는 기간 중 자연치유에 의한 오차를 막기 위해 3일에 1회씩(10:00) 1.0% DNCB 용액 150 uL를 마우스의 등에 도포하였다[19].
- 5주령의 특수병원체부재 숫컷 마우스(BALB/c) 20마리를 대한바이오링크 (주) 로부터 구입하여 일주일 동안 상업용 펠렛식이로 사육하면서 환경에 적응시킨 후 본 실험처리를 하였다. 실험처리는 아토피 피부염 유발 대조군 및 실험용 크림 처리군으로 구분하여 완전 임의 배치하였으며, 각 처리구 당 10마리씩 개체별로 반복해서 사육하였다. 실험동물의 사육실 온도는 20± 2℃, 상대습도 60± 5%로 유지하였고 조명은 12시간 주기로 조절하였다.
- 마우스의 등 부위를 깨끗하게 제모 후 피부의 미세 상처가 치유되도록 24시간 방치하였다. 아세톤과 올리브오일을 3:1로 혼합하여 제조한 면역교란물질로써 2.5% DNCB 용액 (2,4-dinitrochloro benzene, Sigma, St. Louis, MO, USA) 200 uL를 등 부위에 도포하여 면역화 반응을 유도하였다. 3일 후부터 3일에 1회씩 1.
- 정제식이의 조성은 카제인 20.0%, 옥수수전분 15.0%, 설탕 50.0%, α-셀룰로스 5.0%, 옥수수기름 5.0%, 미네랄 혼합제 3.5%, 비타민 혼합제 1.0%, choline bitrate 0.2%, DL-methionine 0.3%로서 구성되었고 식이 내 에너지와 단백질 함량을 동일하게 조절하였다.
- 1filter paper)로 여과한 후 회전식 진공농축기(Rotary vacuum evaporator, N-11, Eyela NE, Tokyo, Japan)에서 감압, 농축하여 동결건조 후 -80℃ deep freezer에 보관하면서 시험제품의 제조에 사용 하였다. 추출물을 (주)NJY 생명과학이 지정한 비율로 혼합한 후 연고기제(프로필렌 글리콜, 세라마이드 및 PCA-나트륨 혼합물)를 첨가하여 크림의 형태로써 시험제품을 제조하였다.
- 각각의 식물 20g을 에틸알코올 1 L을 가하여 80℃에서 3시간 동안 환류냉각장치를 이용하여 추출물을 획득하였다. 추출물을 여과지(Whatman No. 1filter paper)로 여과한 후 회전식 진공농축기(Rotary vacuum evaporator, N-11, Eyela NE, Tokyo, Japan)에서 감압, 농축하여 동결건조 후 -80℃ deep freezer에 보관하면서 시험제품의 제조에 사용 하였다. 추출물을 (주)NJY 생명과학이 지정한 비율로 혼합한 후 연고기제(프로필렌 글리콜, 세라마이드 및 PCA-나트륨 혼합물)를 첨가하여 크림의 형태로써 시험제품을 제조하였다.
- 특히 야행성 동물인 흰쥐의 생리적인 특성을 고려해서 실험절차에 따른 흰쥐의 스트레스를 최소화하기 위해서 낮의 주기를 어둡게 (09:00∼21:00) 조절하였다.
- , Germany)으로 촬영하였다. 피부조직은 피부의 전반적인 상태, 비만세포의 침윤과 탈과립화, 호산구의 침윤을 중심으로 관찰하였다.
- 혈액으로부터 immunoglobulin E 농도는 Mouse IgE ELISA kit(Shibayagi Co., Ltd, Gunma, Japan)를 사용하여 아래와 같이 반응 시킨 후 표준용액의 흡광도와 비교하여 계산하였다. well plate와 모든 시약을 실온으로 유지 하였고 농축세척액을 증류수로써 10배 희석하였다.
- reaction stopper 50 uL를 이용하여 효소반응을 정지시킨 후 이용하여 반응시킨 다음 precision microplate reader(Molecular Devices Inc, New York, USA)에 의해서 450 nm에서 흡광도를 측정하여 히스타민 농도를 계산하였다. 히스타민의 측정은 2회 반복으로 시행하였으며 표준용액을 상기와 동일한 방법으로 진행한 후 시료의 흡광도를 비교하여 계산하였다.
대상 데이터
- 동물을 포함한 모든 과학적 절차는 유럽 실험동물 면허(European Laboratory Animal Treatment License)에서 제시한 기준을 따랐으며 강원대학교 실험동물 윤리위원회의 승인을 얻어서 수행하였다. 5주령의 특수병원체부재 숫컷 마우스(BALB/c) 20마리를 대한바이오링크 (주) 로부터 구입하여 일주일 동안 상업용 펠렛식이로 사육하면서 환경에 적응시킨 후 본 실험처리를 하였다. 실험처리는 아토피 피부염 유발 대조군 및 실험용 크림 처리군으로 구분하여 완전 임의 배치하였으며, 각 처리구 당 10마리씩 개체별로 반복해서 사육하였다.
- 본 실험에 이용된 어성초, 석창포, 방풍, 황기, 비파잎, 고삼 및 삼백초는 강원도 춘천시 재래시장에서 구입하였다. 각각의 식물 20g을 에틸알코올 1 L을 가하여 80℃에서 3시간 동안 환류냉각장치를 이용하여 추출물을 획득하였다.
데이터처리
- 분석된 자료의 통계처리는 SAS program을 이용하였으며 각 처리구의 평균과 표준오차를 구하고 분산분석을 실시한 다음 Duncan's multiple range test에 의하여 95%수준에서 유의성을 검증하였다[20].
이론/모형
- 3%로서 구성되었고 식이 내 에너지와 단백질 함량을 동일하게 조절하였다. 실험사료와 물은 무제한 급여하였으며 기타 사양관리는 강원대학교 관행방법으로 실행하였다.
성능/효과
- 1. 혈액 IgE와 히스타민 농도는 크림 처리군이 DNCB 유도 아토피 대조군에 비해서 각각 57.80%, 59.41%의 유의한 감소율을 나타냈다.
- 2. 아토피 피부염이 심각한 상태의 마우스에게 크림을 발라주었을 때 정상적인 피부상태로 회복되었고 피부 표면의 각질이 없어진 깨끗하고 매끄러운 상태로 회복되었음을 관찰할 수 있었다.
- 3. 크림을 바른 마우스는 아토피 피부염이 심각한 처리군에 비해서 표피층의 표면두께가 균일하고 표층이 부드럽게 형성되었으며 결합 조직도 더욱 일정한 방향으로 형성되어 정상군과 비슷하게 회복되는 것을 확인하였다.
- 4. 본 결과는 아토피 마우스에게 어성초 혼합 한방추출물의 처리가 혈액 IgE를 낮춤과 동시에 비만세포에서 생성되는 히스타민의 배출량을 억제함으로써 항아토피 효능을 갖는다는 점을 시사해준다.
- DNCB 용액을 등 부위에 2회 도포 이후부터 가피가 형성되면서 긁는 행동이 심화되었고, 등 부위의 가피가 벗겨지기 시작하여 아토피 피부염이 유발되었다. 4회 도포 이후부터 아토피 피부염이 심각한 상태로 유발되었으며 이때부터 실험용 크림을 염증발생 부위에 충분하게 발라주었다. 실험용 크림은 1일 2회씩(11:00, 17:00) 발라주었다.
- 피부 상피 조직의 재생과 각질층의 형성 및 기저층에서 망상층의 증식 및 부속기관의 형성은 뚜렷하게 활성화되었으며, 조직 형성층이 두껍고 치밀할 뿐만 아니라 일정한 방향으로 균일하게 형성되었다. 실험용 크림 처리군에서는 피부표면이 깨끗하고 매끄러운 형태로 나타났으나, 조직학적으로 실험용 크림 처리군의 피부조직은 피부표면의 출혈과 표피의 비대화가 두드러져 아토피 피부염 마우스의 표피에 비해 상당히 두꺼워진 형태로 나타났다(Fig. 3c). 그러나 이와 반대로 아토피 피부염 마우스 군의 피부표면은 수많은 각질로 인해 매우 거친 상태였으며 국소적으로 부종이 확인되었다.
- 실험용 크림을 바른 후 피부표면을 관찰한 결과 정상군(Fig. 3a)과 비교할 때 DNCB에 의해서 유도된 아토피 피부염이 심각한 처리군 (Fig. 3b)에서 표피층의 표면두께가 균일하고 표층이 부드럽게 형성되었으며 결합조직도 더욱 일정한 방향으로 형성되어 정상군과 비슷하게 회복되는 것을 확인하였다(Fig. 3c). 진피층의 경우 실험용 크림을 처리한 군에서는 DNCB에 의해서 유도된 아토피 피부염이 심각한 처리군에 비하여 모낭 및 피지선 등의 재형성이 활발하게 일어남을 볼 수 있다.
- 2c). 심각한 아토피 피부염이 발현된 마우스는 실험용 크림 처리군과 비교할 때 홍반, 상처침식, 털 손실, 피부건조, 출혈 및 염증과 같은 피부손상이 나타났다. 이러한 상태의 마우스에 실험용 크림을 1일 2회씩 3일 동안 발라주면 환부의 피부염은 급격히 호전되었으며 6일 동안 발라주게 되면 거의 정상적인 피부상태로 회복되었고 피부 표면의 각질이 없어진 깨끗하고 매끄러운 상태로 회복되었음을 관찰할 수 있다(Fig.
- 심각한 아토피 피부염이 발현된 마우스는 실험용 크림 처리군과 비교할 때 홍반, 상처침식, 털 손실, 피부건조, 출혈 및 염증과 같은 피부손상이 나타났다. 이러한 상태의 마우스에 실험용 크림을 1일 2회씩 3일 동안 발라주면 환부의 피부염은 급격히 호전되었으며 6일 동안 발라주게 되면 거의 정상적인 피부상태로 회복되었고 피부 표면의 각질이 없어진 깨끗하고 매끄러운 상태로 회복되었음을 관찰할 수 있다(Fig. 2d). 가려움증은 피부질환에서 가장 일반적인 증상의 하나로써 염증, 암, 대사성질환, 감염, 정신질환, 약물복용, 스트레스 및 기타 요인에 의해서 일어날 수 있으며 비만세포의 활성화는 사람의 아토피 피부염을 악화시킨다[30-32].
- 1). 이상의 결과는 아토피 피부염 생쥐에게 실험용 크림을 발라주면 혈액 IgE 의 생성을 낮추고 히스타민의 분비가 억제됨으로써 아토피 피부염의 치료효과를 갖는다는 점을 시사해준다.
- 진피층의 경우 실험용 크림을 처리한 군에서는 DNCB에 의해서 유도된 아토피 피부염이 심각한 처리군에 비하여 모낭 및 피지선 등의 재형성이 활발하게 일어남을 볼 수 있다. 피부 상피 조직의 재생과 각질층의 형성 및 기저층에서 망상층의 증식 및 부속기관의 형성은 뚜렷하게 활성화되었으며, 조직 형성층이 두껍고 치밀할 뿐만 아니라 일정한 방향으로 균일하게 형성되었다. 실험용 크림 처리군에서는 피부표면이 깨끗하고 매끄러운 형태로 나타났으나, 조직학적으로 실험용 크림 처리군의 피부조직은 피부표면의 출혈과 표피의 비대화가 두드러져 아토피 피부염 마우스의 표피에 비해 상당히 두꺼워진 형태로 나타났다(Fig.
- 혈액 IgE 농도는 실험용 크림 처리군이 DNCB 유도 아토피 대조군에 비해서 mL 당 32.53 ng이 감소한 것으로 측정되었으며 57.80%의 유의한 감소율(p<0.05)을 나타냈다.
- 혈액 히스타민 농도는 실험용 크림 처리군이 DNCB 유도 아토피 대조군에 비해서 mL 당 23.81 ng이 감소한 것으로 측정되었으며 59.41%의 유의한 감소율(p<0.05)을 나타냈다 (Table 1, Fig. 1).
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