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문제 정의
- 본 연구의 목적은 두경부 편평세포암종 세포주들을 이용하여, 임상적 조건과 유사한 방사선 치료(200cGy/day, Total dose of 7,000cGy) 후 생존하는 세포들을 선택하여, 두경부 편평세포암종 치료의 난제인 방사선 치료에 내성이 있는 세포에서의 NV1066 종양살상 바이러스의 치료 효과를 알아보고자 한다.
제안 방법
- 2시간 배양 후 2ml의 DME agarous 혼합 배지를 첨가하고, 2일간 배양하였다. 2ml의 Neutral red solution(Sigma N2889)을 첨가 후 빛을 차단한 상태에서 2일간 배양하고, 각 세포주별로 바이러스의 플라크(plaque) 숫자를 세는 방법을 이용하였다.
- 5개의 세포주를 대상으로 모세포와 방사선 치료에 내성을 유도한 세포주들에 대한 NV1066의 치료 효과를 비교하기 위하여, 각각의 세포주에서 세포의 생존률을 비교하였다. MOI=0.
- 5개의 세포주를 대상으로 아무런 처치를 하지않은 모세포와 방사선 치료에 내성을 유도한 세포주들에 대한 NV1066의 치료 효과를 비교하였다. MOI를 MOI=0.
- 5개의 세포주를 대상으로 아무런 처치를 하지않은 모세포와 방사선 치료에 내성을 유도한 세포주들에 대한 NV1066의 치료 효과를 비교하였다. MOI를 MOI=0.05, MOI=0.1, MOI=0.5, MOI=1, MOI=2로 달리하여 바이러스를 감염 시켰으며, 4일 후 각각의 세포주에서 세포의 생존률을 비교하였다. MOI=0.
- 5, 1, 2에서 각각 측정하여 비교하였다. MTT는 살아있는 세포에서 Mitochonrial dehydrogenase에 의하여 보라색의 결정체를 형성하므로, 상층액제거 후, 결정을 DMSO로 용해 시켜 그 농도를 Spectrophotometry를 이용하여 520nm 파장에서 분석하였으며, 각 실험은 4회 반복 실시하였다.
- 수집된 배양액 및 세포를 동결 및 해동 작업을 3~4회 실시하여 세포막을 붕괴시켜 세포 내 헤르페스바이러스를 유리시킨 다음 배양액을 -80℃에 보관하였다. NV1066 바이러스에 민감한 Vero 세포를 6개의 용기(6 well plate, Costar)에 한 용기 당 1×106개의 세포밀도로 이식하고 24시간 배양하였고, 인산완충용액으로 세척 후, 실험 전 얼음 속에서 서서히 녹인 배양액 샘플을 일정 비율의 농도로 희석 후 Vero 세포에 감염시켰다. 2시간 배양 후 2ml의 DME agarous 혼합 배지를 첨가하고, 2일간 배양하였다.
- 이때 실험 군을 5개의두경부편평세포암종 세포주별로 2가지로 나누어 각각에 대한 NV1066바이러스의 종양살상 효과를 측정하였다. 각 군의 구성은 대조군, 즉 아무런 처치를 하지 않은 두경부 편평세포암종 세포주에서 NV1066 바이러스를 처치한 군과 실험군인 방사선 치료에 내성이 유발된 두경부 편평세포암 세포주에서 NV1066 바이러스를 처치한 군으로 나누어지며, 각 그룹에 있어서 생존 세포의 비율을 Day 4에 MOI(multiplicity of infection) of 0.05, 0.1, 0.5, 1, 2에서 각각 측정하여 비교하였다. MTT는 살아있는 세포에서 Mitochonrial dehydrogenase에 의하여 보라색의 결정체를 형성하므로, 상층액제거 후, 결정을 DMSO로 용해 시켜 그 농도를 Spectrophotometry를 이용하여 520nm 파장에서 분석하였으며, 각 실험은 4회 반복 실시하였다.
- 대조군인 방사선을 조사하지 않은 5개의 두경부 편평세포암종 세포주(SCC15, SCC25, MSKQLL1, MSKQLL2, SCCⅦ) 군과 7,000cGy실험군인 방사선을 조사한 후 생존한 방사선치료에 내성이 유도된 5개의 두경부 편평세포암종 세포주 군 (RR-SCC15, RR-SCC25, RR-MSKQLL1, RR-MSKQLL2, RR-SCCⅦ)에서 G207 바이러스의 증식 정도의 차이를 알아보기 위하여, NV1066바이러스 처치 4일 후(Day 4) 세포와 배양액을 수집하였다. 수집된 배양액 및 세포를 동결 및 해동 작업을 3~4회 실시하여 세포막을 붕괴시켜 세포 내 헤르페스바이러스를 유리시킨 다음 배양액을 -80℃에 보관하였다.
- 방사선 치료에 내성이 있는 세포를 만드는 방법은 임상적 치료 환경과 최대한 유사한 방법으로 한번에 2G씩 조사한 후 살아남은 세포를 계대 배양하여 세포주에 따라 2일에서 4일후 T-75 플라스크에서 세포의 밀도가 50%정도 되는 증식기에 다시 2G의 방사선 조사를 계속하는 방법으로 5개 세포주에서 모두 총 35회에 걸쳐 전부 7,000cGy를 조사 하였으며, 살아남은 세포를 실험에 이용하였다. 이렇게 하여 얻어진 세포주들은 모세포와 구분하기 위하여 각각 RR-SCC15, RRSCC25, RR-MSKQLL1, RR-MSKQLL2, RR-SCCVⅡ 로 표기 하고자 한다.
- 특히 방사선 치료 도중 종양세포군에서 출현하는 방사선 치료에 내 성(radioresistant)이 있는 종양세포의 존재 유무가 중요한데, 이러한 종양세포는 전이를 잘 일으킬 뿐만 아니라 추가 적인 방사선 치료나 항암 치료에 잘 반응하지 않으므로, 두경부 종양의 궁극적 치료율을 떨어뜨리는 중요한 원인이 된다2)3). 아직까지 이러한 상황에 대한 뚜렷한 치료 방법이 없는 상태로, 연구자 등은 유전자 조작에 의해 만들어진 종양살상 헤르페스 바이러스인 NV1066를 가지고 인위적으로 방사선 치료에 내성을 유도한 두경부편평세포암종 세포주들에 대한 치료효과를 관찰하였다.
- 필요한 실험별로 세포를 처치 후 의도된 시간에 상층액을 제거하고 인산완충용액을 이용하여 세척 후, MTT(50μg MTT/200μl)가 섞인 배양액을 넣고 4~6시간 배양하였다. 이때 실험 군을 5개의두경부편평세포암종 세포주별로 2가지로 나누어 각각에 대한 NV1066바이러스의 종양살상 효과를 측정하였다. 각 군의 구성은 대조군, 즉 아무런 처치를 하지 않은 두경부 편평세포암종 세포주에서 NV1066 바이러스를 처치한 군과 실험군인 방사선 치료에 내성이 유발된 두경부 편평세포암 세포주에서 NV1066 바이러스를 처치한 군으로 나누어지며, 각 그룹에 있어서 생존 세포의 비율을 Day 4에 MOI(multiplicity of infection) of 0.
- 방사선 치료에 내성이 있는 세포를 만드는 방법은 임상적 치료 환경과 최대한 유사한 방법으로 한번에 2G씩 조사한 후 살아남은 세포를 계대 배양하여 세포주에 따라 2일에서 4일후 T-75 플라스크에서 세포의 밀도가 50%정도 되는 증식기에 다시 2G의 방사선 조사를 계속하는 방법으로 5개 세포주에서 모두 총 35회에 걸쳐 전부 7,000cGy를 조사 하였으며, 살아남은 세포를 실험에 이용하였다. 이렇게 하여 얻어진 세포주들은 모세포와 구분하기 위하여 각각 RR-SCC15, RRSCC25, RR-MSKQLL1, RR-MSKQLL2, RR-SCCVⅡ 로 표기 하고자 한다.
- 임상적 치료 환경과 최대한 유사한 방법으로 2G/day 씩 조사하여 살아남은 세포를 선택하는 방법으로 35회에 걸쳐 전부 7,000cGy를 조사한 후 살아남은 세포를 선택하였다. 이와 같은 방법으로 얻어진 세포주를 가지고 100cGy, 200cGy, 300cGy, 400cGy, 500cGy의 방사선을 각각 조사한 뒤 방사선에 대한 민감도를 측정하였다. 500cGy 방사선 조사 4일 후 SCC15의 66%만이 생존하였으나, RR-SCC15은 96%가 생존하였다.
- 연구자 등은 방사선 치료에 내성이 유발된 두경부 편평세포암 세포주에서 NV1066 바이러스의 종양살상 능력이 의미 있게 증가함을 관찰 할 수 있었다. 이와 같은 실험 결과를 토대로 과연 바이러스의 증식이 얼마만큼 증가 되었는지를 각각의 세포주들을 MOI=0.01로 감염 시키고 48시간 후 viral tittering 방법으로 바이러스의 수를 정량적으로 분석하여 비교하여 보았다.
- 임상적 치료 환경과 최대한 유사한 방법으로 2G/day 씩 조사하여 살아남은 세포를 선택하는 방법으로 35회에 걸쳐 전부 7,000cGy를 조사한 후 살아남은 세포를 선택하였다. 이와 같은 방법으로 얻어진 세포주를 가지고 100cGy, 200cGy, 300cGy, 400cGy, 500cGy의 방사선을 각각 조사한 뒤 방사선에 대한 민감도를 측정하였다.
- 종양세포의 살상능력을 분석 하는데 있어 단순히 혈구 측정기를 이용하여 Trypan blue 염색을 하여 생존해 있는 세포를 계수할 수 있으나 이것은 주관적이며, 아치사의 손상을 입은 세포의 상태를 정확히 대변할 수 없으므로 본 실험에서는 MTT(3-(4,5-Dimethyl thiazole-2-yl)-2,5-Diphenyl tetrazolium Bromide, SIGMA #2128) cytotoxicity assay 를 시행하였다. 편평한 96-well 용기(Falcon Plastics, 3075) 에 200μl의 부피로 5×103개의 종양 세포를 각 실험군에 따라 이식하며, 약 12~18시간 배양 후 세포가 안전하게 세포배양 용기에 착상된 것을 확인하였다.
대상 데이터
- 본 연구에서는 5가지의 두경부 편평세포암종 세포주들이 사용되었다. 4가지 세포는 인간 두경부편평상피세포암종 세포 주로, 2가지는 American Type Culture Collection(ATCC, Manassas, VA；SCC 15, SCC 25)에서 구입하으며, 2가지 세포주(MSKQLL1, MSKQLL2)는 Memorial Sloan-Kettering Cancer Center에서, 분리하여 특성화 한 것이다. SCC Ⅶ 세포주는 미국 Memorial Sloan-Kettering Cancer Center로부터 기증 받은 것으로 C3H/HeJ 쥐에서 자연적으로 발생한 편평세포암종 세포주이다.
- 바이러스의 정량화는 Vero 세포주에서의 플라크형성 단위(plaque forming unit, pfu)에 근거하여 시행하였으며, 사용할 때까지 -80℃에 보관한다. G207 바이러스는 Memorial Sloan-Ketterin Cancer Center의 Surgical Oncology Laboratory에서 기증 받았다.
- 5 loci 유전자 부분이 소실되고, 대신 표식 유전자인 CMV-EGFP 삽입된 다변이 바이러스이다. 바이러스의 증식이 활발히 일어나는 아프리카 green monkey의 신장세포(Vero cell；ATCC)에서 DMEM(Dulbecco’s modified Eagle’s medium) 배지를 이용하여 바이러스를 배양한다. 바이러스의 정량화는 Vero 세포주에서의 플라크형성 단위(plaque forming unit, pfu)에 근거하여 시행하였으며, 사용할 때까지 -80℃에 보관한다.
- 본 연구에서는 5가지의 두경부 편평세포암종 세포주들이 사용되었다. 4가지 세포는 인간 두경부편평상피세포암종 세포 주로, 2가지는 American Type Culture Collection(ATCC, Manassas, VA；SCC 15, SCC 25)에서 구입하으며, 2가지 세포주(MSKQLL1, MSKQLL2)는 Memorial Sloan-Kettering Cancer Center에서, 분리하여 특성화 한 것이다.
성능/효과
- 이와 같은 방법으로 얻어진 세포주를 가지고 100cGy, 200cGy, 300cGy, 400cGy, 500cGy의 방사선을 각각 조사한 뒤 방사선에 대한 민감도를 측정하였다. 500cGy 방사선 조사 4일 후 SCC15의 66%만이 생존하였으나, RR-SCC15은 96%가 생존하였다. 나머지 4세포주에서도 비슷한 결과를 보였는데 같은 조건에서 SCC25는 81%, MSKQLL1은 68%, MSKQLL2는 74%, SCCⅦ은 68%가 생존한 반면, RR-SCC25는 95%, RR-MSKQLL1은 95%, RR-MSKQLL2는 98%, RR-SCCⅦ은 95%가 생존하여 모세포 보다 월등하게 방사선 치료에 대한 내성을 보였다(Fig.
- 1배 증가 되어 있었다. RR-SCC15는 모세포인 SCC15에 비해 바이러스의 수가 2.2배 RR-MSKQLL1은 모세포인 MSKQLL1에 비해 바이러스의 수가 9.7배, RR-MSKQLL2는 모세포인 MSKQLL2에 비해 바이러스의 수가 4.0배, RRSCCⅦ은 모세포인 SCCⅦ에 비해 바이러스의 수가 12.9배 증가 되어 있음을 관찰 할 수 있었다(Fig. 4).
- 1로 바이러스를 감염시킨 4일 후 SCC25의 91%가 생존하였으나, RR-SCC25은 45%만이 생존하였다. 나머지 4세포주에서도 비슷한 결과를 보였는데 같은 조건에서 SCC15는 36%, MSKQLL1은 95%, MSKQLL2는 31%, SCCVII 은 99%가 생존한 반면, RR-SCC15는 17%, RR-MSKQLL1은 68%, RR-MSKQLL2는 12%, RR-SCCⅦ은 82%만이 생존하여 모세포 보다 월등하게 NV1066의 치료에 대한 민감도가 증가하였다. 이와 같은 연구 결과는 다음과 같이 해석 할 수 있다.
- 1로 바이러스를 감염시킨 4일 후 SCC25의 91%가 생존하였으나, RR-SCC25은 45%만이 생존하였다. 나머지 4세포주에서도 비슷한 결과를 보였는데 같은 조건에서 SCC15는 36%, MSKQLL1은 95%, MSKQLL2는 31%, SCCⅦ은 99%가 생존한 반면, RR-SCC15는 17%, RRMSKQLL1은 68%, RR-MSKQLL2는 12%, RR-SCCⅦ은 82%만이 생존하여 모세포 보다 월등하게 NV1066의 치료에 대한 민감도가 증가하였다. 이와 같은 현상은 좀더 높은 MOI 인 MOI=1에서도 비슷한 결과를 보였는데, MOI=1로 바이러스를 감염시킨 4일 후 SCC25의 50%가 생존하였으나, RRSCC25은 21%만이 생존하였다.
- 이와 같은 현상은 좀더 높은 MOI 인 MOI=1에서도 비슷한 결과를 보였는데, MOI=1로 바이러스를 감염시킨 4일 후 SCC25의 50%가 생존하였으나, RRSCC25은 21%만이 생존하였다. 나머지 4세포주에서도 비슷한 결과를 보였는데 같은 조건에서 SCC15는 6%, MSKQLL1은 51%, MSKQLL2는 11%, SCCⅦ은 70%가 생존한 반면, RR-SCC15는 2%, RR-MSKQLL1은 25%, RR-MSKQLL2는 6%, RR-SCCⅦ은 45%만이 생존하여, 여러 비율의 MOI에서 모두 NV1066의 치료에 대한 민감도가 증가함을 확인 할 수 있었다(Fig. 3).
- 증식기의 모세포의 경우 세포주기 중 S-phase를 차지하는 세포의 비중이 SCC15에서는 33%였으나, 증식기의 RRSCC15의 경우는 S-phase를 차지하는 세포의 비중이 48%로 증가되어 있었다. 나머지 4세포주에서도 비슷한 결과를 보였는데 같은 조건에서 SCC25는 31%, MSKQLL1은 30%, MSKQLL2는 30%의 S-phase를 보인 반면, RR-SCC25는 42%, RR-MSKQLL1은 40%, RR-MSKQLL2는 37%의 S-phase을 보여 방사선 치료에 내성이 있는 세포주에서. 모세포 보다 월등하게 S-phase의 부분이 증가되어 있는 것을 관찰할 수 있었다(Fig.
- 500cGy 방사선 조사 4일 후 SCC15의 66%만이 생존하였으나, RR-SCC15은 96%가 생존하였다. 나머지 4세포주에서도 비슷한 결과를 보였는데 같은 조건에서 SCC25는 81%, MSKQLL1은 68%, MSKQLL2는 74%, SCCⅦ은 68%가 생존한 반면, RR-SCC25는 95%, RR-MSKQLL1은 95%, RR-MSKQLL2는 98%, RR-SCCⅦ은 95%가 생존하여 모세포 보다 월등하게 방사선 치료에 대한 내성을 보였다(Fig. 1).
- 나머지 4세포주에서도 비슷한 결과를 보였는데 같은 조건에서 SCC25는 31%, MSKQLL1은 30%, MSKQLL2는 30%의 S-phase를 보인 반면, RR-SCC25는 42%, RR-MSKQLL1은 40%, RR-MSKQLL2는 37%의 S-phase을 보여 방사선 치료에 내성이 있는 세포주에서. 모세포 보다 월등하게 S-phase의 부분이 증가되어 있는 것을 관찰할 수 있었다(Fig. 2).
- 나머지 4세포주에서도 비슷한 결과를 보였는데 같은 조건에서 SCC25는 31%, MSKQLL1은 30%, MSKQLL2는 30%의 S-phase를 보인 반면, RR-SCC25는 42%, RR-MSKQLL1은 40%, RR-MSKQLL2는 37%의 S-phase을 보여 방사선 치료에 내성이 있는 세포주에서. 모세포 보다 월등하게 S-phase의 부분이 증가되어 있는 것을 관찰할 수 있었다(Fig. 2).
- 첫째, 열에 민감하여 발열 시 바이러스 복제가 억제되고, 둘째, acyclovir, gancyclovir와 같은 항바이러스 제재에 감수성이높으므로 치료 시 야기될 수 있는 바이러스의 과도 증식에 의한 부작용을 치료하기 용이하다. 셋째, 바이러스 내의 다수의 유전자 대변이로 인하여 HSV로의 자연적인 전환은 거의 되지 않으며, 넷째, 감염의 지표로 lacZ 유전자 또는 green fluorescent protein(GFP) 유전자 등을 발현하도록 조작되어 있어 바이러스의 증식을 간접적으로 확인 할 수 있다는 장점이 있다9).
- 이상의 결과를 종합하여 보면 방사선 치료에 내성을 유도한 두경부 편평세포암종 세포주들은 임상적으로 쓰이는 방사선 용량의 치료에 의미있게 증가된 내성을 보였으며, 세포주기중 s-phase의 부분이 상승되어 있었다. 이는 NV1066 바이러스의 증식에 좋은 환경을 제공해 주는것이며, 실험결과 모세포 보다 방사선 치료에 내성을 유도한 두경부 편평세포암종 세포주들이 NV1066 바이러스 치료에 의미 있게 민감한 반응을 보였다. 연구자 등은 기존의 연구 결과를 근거로 방사선 치료에 내성이 있는 두경부 편평세포암종 세포주에서 종양살상 NV1066 바이러스의 유전자 치료가 효과적이라는 가설을 검증하였고, 이는 기존 치료 방법의 주된 실패 원인을 해결하는 새로운 치료법으로 자리 매김 할 수 있으리라 기대하며, 궁국적으로 두경부편평세포암종 환자의 생존율을 높이는 새로운 치료법으로서의 가능성을 보여주었다고 생각한다.
- 이러한 방법은 종양세포의 방사선에 대한 민감도를 측정하는데 유효하며, 일시에 7,000cGy를 조사하는 방법 보다 종양세포의 Reassortment, Repair, Repopulation과 Recruitment 현상을 유발한다는 점에서 임상적 환경과 유사하며, 방사선 치료에 내성이 있는 세포를 선택적으로 취하는데 유용한 방법이다11)12). 이렇게 하여 방사선 치료에 내성을 유도한 세포주들을 만들어 실질적으로 방사선 치료에 내성이 생긴 것인지를 검증한 결과 500 cGy 조사 4일 후 95~98%의 생존율을 보였으며 이는 같은 조건에서 68~81%의 생존율을 보인 모세포 보다 의미 있게 방사선 치료에 대해 저항성이 생겼음을 확인 할 수 있었다. 문헌 보고에 의하면 방사선 치료에 잘 반응하지 않는 종양세포는 방사선 조사 후 세포 고사가 잘 일어나지 않으며, 세포 주기중 S-phase의 부분이 많다고 한다13) NV1066의 증식이 세포고사가 잘 일어나지 않으며 세포주기 중 S-phase 의 부분이 많은 세포에서 잘 일어난다는 사실은 이미 밝혀져 있다10)14).
- 이상의 결과를 종합하여 보면 방사선 치료에 내성을 유도한 두경부 편평세포암종 세포주들은 임상적으로 쓰이는 방사선 용량의 치료에 의미있게 증가된 내성을 보였으며, 세포주기중 s-phase의 부분이 상승되어 있었다. 이는 NV1066 바이러스의 증식에 좋은 환경을 제공해 주는것이며, 실험결과 모세포 보다 방사선 치료에 내성을 유도한 두경부 편평세포암종 세포주들이 NV1066 바이러스 치료에 의미 있게 민감한 반응을 보였다.
- 종양살상 헤르페스 바이러스는 다음과 같은 여러 장점을 가지고 있다. 첫째, 열에 민감하여 발열 시 바이러스 복제가 억제되고, 둘째, acyclovir, gancyclovir와 같은 항바이러스 제재에 감수성이높으므로 치료 시 야기될 수 있는 바이러스의 과도 증식에 의한 부작용을 치료하기 용이하다. 셋째, 바이러스 내의 다수의 유전자 대변이로 인하여 HSV로의 자연적인 전환은 거의 되지 않으며, 넷째, 감염의 지표로 lacZ 유전자 또는 green fluorescent protein(GFP) 유전자 등을 발현하도록 조작되어 있어 바이러스의 증식을 간접적으로 확인 할 수 있다는 장점이 있다9).
- cytotoxicity assay 를 시행하였다. 편평한 96-well 용기(Falcon Plastics, 3075) 에 200μl의 부피로 5×103개의 종양 세포를 각 실험군에 따라 이식하며, 약 12~18시간 배양 후 세포가 안전하게 세포배양 용기에 착상된 것을 확인하였다. 필요한 실험별로 세포를 처치 후 의도된 시간에 상층액을 제거하고 인산완충용액을 이용하여 세척 후, MTT(50μg MTT/200μl)가 섞인 배양액을 넣고 4~6시간 배양하였다.
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