[논문]산겨릅나무 추출물의 이화학적 특성과 암세포 성장 억제 효과

신인철; 사재훈; 심태흠; 이진하

산겨릅나무 추출물의 이화학적 특성과 암세포 성장 억제 효과
The Physical and Chemical Properties and Cytotoxic Effects of Acer tegmentosum Maxim. Extracts 원문보기

한국응용생명화학회지 = Journal of the Korean Society for Applied Biological Chemistry, v.49 no.4, 2006년, pp.322 - 327

신인철 (강원도보건환경연구원) , 사재훈 (강원도보건환경연구원) , 심태흠 (강원도보건환경연구원) , 이진하 (강원대학교 바이오산업공학부)

초록
AI-Helper

우리나라 중부 이북 해발 500m 이상의 고산지대에서 주로 자생하는 산겨릅나무(Acer tegmentosum Maxim.)를 대상으로 식품학적인 성분 분석과 산겨릅나무 줄기의 EtOH추출물의 분획물을 제조하여 DPPH 유리기 대한 소거 기능, 그리고 사람 유래의 암세포들(위암세포(AGS), 간암세포(HepG2), 폐암세포(A549)와 유방암세포(MCF-7))에 대한 항암 효과를 조사하여 다음과 같은 결과를 얻었다. 1) 산겨릅나무 줄기 의 식품성분 함량은 탄수화물이 58.4%, 수분 27.5%, 조단백질 8.7%, 조지방 3.8%, 조회분 1.6%의 순으로 나타났고 무기질의 주요 무기성분은 K과 Ca이 302.4mg%와 116.0mg%로 가장 많이 함유되어 있고 Mg, Na, Mn, Fe, Zn, P, Cu의 함량이 각각 57.8, 24.8, 9.5, 4.4, 1.6, 0.8, 0.2 mg% 순으로 나타났다. 2) DPPH를 이용한 항산화 효능을 보기위하여 산겨릅나무 줄기의 수피부 및 줄기를 80% EtOH로 추출하고, 그 추출물들을 다시 n-hexane, chloroform, EtOAc, n-BuOH 및 aqueous층으로 분리하였다. 분획물들을 대상으로 DPPH 유리기의 소거능을 검증한 결과 전반적으로 줄기 보다는 수피부에서 높은 소거 효과를 나타냈으며 용매별로는 EtOAc>n-BuOH>aqueous>chloroform>n-hexane 순으로 활성을 보였다. 특히, EtOAc fr.($SC_{50}:2.8{\mu}g/ml$과 n-BuOH fr.($SC_{50}:3.2{\mu}g/ml$은 천연항산화제로 쓰이는 ascorbic acid($SC_{50}:4.5{\mu}g/ml$와 $\alpha$-tocopherol($SC_{50}:4.0{\mu}g/ml$ 및 합성 항산화제인 BHT($SC_{50}:6.5{\mu}g/ml$보다도 높은 소거능을 보였다. 3) 유리기의 소거 기능과 분획물들의 성분과의 상호 관계를 조사하기 위하여 각 분획물들의 흡광도를 조사한 결과, 페놀성계 화합물계의 특성을 보이는 280nm부근에서 강한 흡광도를 나타내어 DPPH에 의한 높은 항산화 효능이 페놀성계 성분과 관계가 깊은 것으로 사료되었다. 4) 산겨릅나무 줄기의 80% EtOH 추출물의 암 세포주들에 대한 성장 저해와 정상세포에 대한 세포 독성을 알아보기 위하여 인체기원 세포주인 간암세포(HepG2), 위암세포(AGS),폐암세포(A549), 유방암세포(MCF-7)와 정상 간세포(Chang)를 대상으로 추출농도 0.125, 0.25, 0.5, 1(mg/ml) 등 4단계로 나누어 실험하였으며 다음과 같은 결론을 얻었다. 위암세포의 경우 0.125mg/ml의 저농도에서 50% 이상, 0.5mg/ml에서는 90% 이상의 암세포 생육 억제효과를 보여주었다. 간암세포를 포함한 나머지 폐암세포와 유방암세포의 경우 모두 0.5mg/ml에서 50%이상의 세포 성장 억제 효과를 나타내었다.

Abstract ▼ AI-Helper

Food constituents analysis of Acer tegmentosum. Maxim.(Acer TM) stem was carried out according to AOAC method, and the antiradical activity on DPPH and cytotoxicity on human cell lines (AGS, HepG2, A549, MCF-7 and Chang) for the 80% ethylalcohol(EtOH) extracts of Acer TM stem were studied. The antiradical activity on DPPH radical of the ethylacetate(EtOAc) fraction of the bark showed a higher activity than that of $\alpha$-tocopherol, ascorbic acid and BHT. The inhibition activity of the 80% EtOH extracts from Acer TM stem on human cancer cell lines by SRB assay indicated a dose-dependent growth inhibition on most human carcinoma cells. The growth inhibition rate of each human cancer cell line showed 91.3% to AGS, 75.0% to A549, 74.1% to HepG2, and 70.2% to MCF-7 cells, respectively, when the 80% EtOH extract(1 mg/ml) of Acer TM stem was added.

주제어

AI 본문요약
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문제 정의

본 연구에서는 산겨릅나무에 대한 식품학적 성분 분석과 그 추출물의 생리활성을 탐색하여 효용가치를 높일 수 있는 기초자료로 이용하고자, 항산화 활성 및 수종의 사람 암세포주 성장 억제효과 등을 조사하여 그 결과를 보고한다.

제안 방법

00 g)을 얻었다. 이 농축물들을 각각 "-hexane, chloroform, ethyl acetate(EtOAc), n-butanol(BuOH) 등으로 순차적으로 분획하였으며 각각의 분획 용매를 감압 농축하여 수피에서 w-hexane 분획물(6.60g), chloroform 분획물(12.58 g), EtOAc 분획물(7.98 g), w-BuOH 분획물(42.80 g), aqueous 분획물(125.40 g)을, 줄기에서는 n-hexane 분획물(3.97 g), chloroform 분획물(6.20 g), EtOAc 분획물(4.43 g), n-BuOH 분획물(7.00 g), aqueous 분획물(53.40)을 얻은 후 각 분획물들을 항산화 효과 및 암세포 생육 억제효과 등의 생리활성 탐색에 사용 하였다. DPPH 라디칼 소거 활성.
실험에 사용된 산겨릅나무는 홍천군 내면에서 채취해서 음건, 세절하였으며, 수피(가지에서 벗긴 껍질부분) 와줄기전체(어떤 처리도 하지 않은 자연 상태의 나무줄기 부분) 부가 로 나누어 사용하였다. 각 부위별 추출물 제조는 수직 환류 냉각기를 부착한 추출기를 이용하여 각각의 재료 중량 대 비약 20배의 80% EtOH 용액을 가하여 12시간씩 2회 반복 추출한 후 No. 2 filter paper(Adventec, Japan)로 여과하고 rotary vacuum evaporator에서 감압 농축하여 냉장 보관하며 시료로 사용하였다. 또 일부의 EtOH 추출물은 다시 EtOAc, n- butylalcol(BuOH), n-hexane, chloroform 등으로 분획물을 얻어 시료로 사용하였다.
실험에 사용한 세포는 모두 인체기원 세포주로서 간암세포(HepG2, hepatocellular carcinoma; HB-8064, ATCC), 위임세포(AGS, stomach adenocarcinoma; CRL-1739, ATCC), 폐암세포(A549, lung carcinoma; CCL-185, ATCC), 유방암세 포(MCF-7, mammary 이and, epithelial, breast adeno carcinoma; HTB-22, ATCC)와 정상 간세포(Chang, normal liver cell; CCL-13, ATCC)을 대상으로 하였다. 배양액의 제조는 간암세포, 유방암세포 및 정상 간세포는 NaHCO₃ 3.7 mg/m/ 및 gentamycin sulfate 50 을 첨가한 후 IM HC₁ 로 pH 를 7.4로 조절한 DMEM 배지를 사용하였고 폐암세포와 위암 세포는 NaHCO₃ 2.0 mg/m/ 및 gentamycin sulfate 50|ig/m/을 첨가한 후 1 N HCI로 pH를 7.4로 조절한 RPMI 1640 배지를 사용하였다. 모든 세포주는 각각의 배지에 10% FBS를 첨가하여 37℃, 5% CO₂ incubator 조건 하에서 배양하였다.
분획물에 대한 흡광도 측정. 산겨릅나무의 수피 및 줄기를 항산화성물질로 알려진 화합물들 (protein, aromatic amine, phenol etc.
세포배양 및 세포독성과 암세포 생육억제 효과는 변¹¹⁾ 등의 방법에 따라 수행 하였다^11,18). 산겨릅나무 줄기 추출물은 일정량을 해당 배지에 녹이고 멸균된 Millipore filter disc 0.45 |im로 여 과하여 대조군에 대 하여 0.125, 0.25, 0.5, 1 mg/mZ가 되도록 배지로 희석하여 사용하였다. 75-cm² cell culture flask에 세포가 80% 정도 되었을 때 PBS로 세척한 다음 0.
독성. 산겨릅나무 줄기의 80% 에탄올 추출물을 이용하여 인체 기원 세포주인 간암세포(HepG2), 위암세포(AGS), 폐암세포(A549), 유방암세포(MCF-7)를 대상으로 한 암세포 성장 억제 효과를 Fig. 2에 나타내었다. 실험 결과 암세포주들 모두 농도 의존적으로 성장 억제 효과를 보여주었다.
분획물에 대한 흡광도 측정. 산겨릅나무의 수피 및 줄기를 항산화성물질로 알려진 화합물들 (protein, aromatic amine, phenol etc.)의 용출정도를 285nm에서 흡광도를 측정하였고, 카로티노이드 함량은 450nm에서 측정하였으며 갈색화 반응 생성물질의 농도를 나타내는 갈색도는 490nm에서 측정하였다. 시료는 모두 농도가 0.
DPPH 라디칼 소거 활성. 생체대사과정이나 스트레스, 염증 등의 원인이 되는 유해성 유리기의 일반적인 조사법으로 사용되는 라디칼 소거능을 측정하기 위하여 l, l-diphenyl-2-picryl hydrazyl(DPPH, Wako Co. 일본)에 대한 각 분획물들의 소거 활성을 Brand-Williams, W. 등의 방법을 응용하여 측정하였다^19,20). 즉, 각각의 분획물들을 여러 가지의 농도로 4 m/의 methanol에 녹이고 0.
25% trypsin-EDTA로 부착 세포들을 처리하고 해당 배지 20 m/S- 넣어 1, 000 rpm에서 5분간 원심분리하였다. 원심분리한 세포들을 모은 후 haemocytometer를 이용하여 각각의 세포들을 해당 배지로 희석하여 96 well microplate에 4x10⁴ cells/mZ의 농도로 100μl씨 분주하였고 24 시간 동안 배양한 후 추출물들을 농도별로 100 μl씩 각각의 세포들에게 투여하고 48시간 동안 배양하였다. 세포 독성에 대한 측정은 세포 단백질 염색을 이용하여 세포 생육 정도를 측정하는 Sulforhodamine B(SRB) assay로 실험하였다.
산겨릅나무 줄기 시료의 전처리는 음건한후 건식 회화법을 이용하였다. 즉, 590℃에서 재료를 회화한 후 6M HC₁ 약 10 m/ 가하여 수욕상에서 증발건조하고 3M HC₁ 약 10mZ를 가하여 수분 간 가열 후 원소별 검출 한계 및 직선선 범위를 고려하며 적정 농도로 희석하여 atomic absorption spectrophotometer(Analytic Jena AG NovAA 330, Germany) 로 분석하였다. Calcium(Ca)은 간섭을 피하기 위하여 strontium chloride .
등의 방법을 응용하여 측정하였다^19,20). 즉, 각각의 분획물들을 여러 가지의 농도로 4 m/의 methanol에 녹이고 0.2 mM DPPH 1 첨가한 다음 실온에서 30 분간방치 후 515 nm에서 의 흡광도를 UV/VIS spectrophotometer (DU-800, Beckman Coulter INC, USA)를 사용하여 측정하였다. 시료를 첨가하지 않은 methanol을 대조군으로 하고 흡광도를 50% 감소시키는데 필요한 시료의 농도를 50% scavenging coefficient(SC₅₀)S.
추출물의 분획물에 대한 흡광도 측정. 산겨릅나무 줄기의 수피부와 줄기 추출물들의 용매별 분획물들을 285, 450, 490 nm 에서 흡광도를 측정한 결과를 Fig.
산겨릅나무 줄기의 일반성분 분석은 AOAC법¹⁸⁾ 을 참조하여 실험하였으며 수분은 135℃ 상압 건조법, 조회분은 590℃ 직접 회화법, 조지 방은 Soxhet 추출법 (SOXTHERM- SOX406, Gerhardt Co, Germany)을 이용하였고 조단백질은 단백질 자동 분석 장.치(2300 Kjeltec Analyzer Unit, Foss Tecator AB, Sweden)를 이용하여 질소계수 6.25를 곱하여 함량(%)로나타내었고, 탄수화물은 100에서 수분, 조회분, 조지방, 조단백질을 제외한 값으로 나타냈다.

대상 데이터

2 filter paper(Adventec, Japan)로 여과하고 rotary vacuum evaporator에서 감압 농축하여 냉장 보관하며 시료로 사용하였다. 또 일부의 EtOH 추출물은 다시 EtOAc, n- butylalcol(BuOH), n-hexane, chloroform 등으로 분획물을 얻어 시료로 사용하였다.
시료의 추출. 실험에 사용된 산겨릅나무는 홍천군 내면에서 채취해서 음건, 세절하였으며, 수피(가지에서 벗긴 껍질부분) 와줄기전체(어떤 처리도 하지 않은 자연 상태의 나무줄기 부분) 부가 로 나누어 사용하였다. 각 부위별 추출물 제조는 수직 환류 냉각기를 부착한 추출기를 이용하여 각각의 재료 중량 대 비약 20배의 80% EtOH 용액을 가하여 12시간씩 2회 반복 추출한 후 No.
세포주 및 세포배양. 실험에 사용한 세포는 모두 인체기원 세포주로서 간암세포(HepG2, hepatocellular carcinoma; HB-8064, ATCC), 위임세포(AGS, stomach adenocarcinoma; CRL-1739, ATCC), 폐암세포(A549, lung carcinoma; CCL-185, ATCC), 유방암세 포(MCF-7, mammary 이and, epithelial, breast adeno carcinoma; HTB-22, ATCC)와 정상 간세포(Chang, normal liver cell; CCL-13, ATCC)을 대상으로 하였다. 배양액의 제조는 간암세포, 유방암세포 및 정상 간세포는 NaHCO₃ 3.

이론/모형

(USA) 제품을 사용하였고 그 외 시약들은 시판 특급을 사용하였다. Inverted microscope은 독일 ZEISS사의 TELAVAL3을 사용하였고 microplate reader는 Molecular Devices사(Sunnywle, CA, USA)의 model VERSAmax 을 사용하였다.
6H₂O(Aldrich)> Sr로서 5000ppm이 되도록 첨가한 IM HC1 용액에 희석하여 측정하였다. Phosphorus(P)은 AOAC 법을 참조하여 650nm에서 UV/VIS spectrophotometer(DU-800, Beckman coulter Inc, USA)를 사용하여 몰리브덴 청 비색법으로 분석하였다.
무기질분석. 산겨릅나무 줄기 시료의 전처리는 음건한후 건식 회화법을 이용하였다. 즉, 590℃에서 재료를 회화한 후 6M HC₁ 약 10 m/ 가하여 수욕상에서 증발건조하고 3M HC₁ 약 10mZ를 가하여 수분 간 가열 후 원소별 검출 한계 및 직선선 범위를 고려하며 적정 농도로 희석하여 atomic absorption spectrophotometer(Analytic Jena AG NovAA 330, Germany) 로 분석하였다.
일반성분분석. 산겨릅나무 줄기의 일반성분 분석은 AOAC법¹⁸⁾ 을 참조하여 실험하였으며 수분은 135℃ 상압 건조법, 조회분은 590℃ 직접 회화법, 조지 방은 Soxhet 추출법 (SOXTHERM- SOX406, Gerhardt Co, Germany)을 이용하였고 조단백질은 단백질 자동 분석 장.치(2300 Kjeltec Analyzer Unit, Foss Tecator AB, Sweden)를 이용하여 질소계수 6.
원심분리한 세포들을 모은 후 haemocytometer를 이용하여 각각의 세포들을 해당 배지로 희석하여 96 well microplate에 4x10⁴ cells/mZ의 농도로 100μl씨 분주하였고 24 시간 동안 배양한 후 추출물들을 농도별로 100 μl씩 각각의 세포들에게 투여하고 48시간 동안 배양하였다. 세포 독성에 대한 측정은 세포 단백질 염색을 이용하여 세포 생육 정도를 측정하는 Sulforhodamine B(SRB) assay로 실험하였다. 즉, 각각의 세포를 48시간 배양한 후 배양액을 제거하고 4℃의 10% TCA 100μl를 투여하여 1시간 동안 냉장고에서 세포를 고정시켰다.
성장 억제 효과. 세포배양 및 세포독성과 암세포 생육억제 효과는 변¹¹⁾ 등의 방법에 따라 수행 하였다^11,18). 산겨릅나무 줄기 추출물은 일정량을 해당 배지에 녹이고 멸균된 Millipore filter disc 0.

성능/효과

8μg/m7)과 수피부의 n-BuOH fr.(SC₅₀: 3.2 μg/m/)은 천연항산화제로 쓰이는 ascorbic acid와(*>S: C 4.5μg/mZ), a-tocopherol(SC₅₀: 4.0 μg/m/) 및 합성 항산화제인 BHT(SC₅₀: 6.5 μg/m/) 보다도 높은 소거 능을 보였다.
실험 결과 암세포주들 모두 농도 의존적으로 성장 억제 효과를 보여주었다. 0.5 mg/m/ 의 농도에서 모든 암세주들이 50% 이상의 억제를 나타내었고 특히 AGS에서는 0.125 mg/m/의 저농도에서 억제효과가 50%에 가까웠으며 0.5 mg/m/에서는 90% 이상의 억제효과가 나타나 실험에 사용된 세포주들 중에서 가장 높은 억제효과를 보여주었다. 다음으로 MCF-7 > HepG2 > A549 순으로 나타났다.
2에 나타내었다. 실험 결과 암세포주들 모두 농도 의존적으로 성장 억제 효과를 보여주었다. 0.
산겨릅나무 줄기 시료 추출물의 분획물들에 대한 DPPH법에 의한 라디칼 소거효능을 Table 2에 나타내었다. 실험 결과 전반적으로 줄기 보다는 수피부에서 높은 소거 효과를 나타냈으며, 분획물 별로는 EtOAc > m-BuOH > aqueous > chloroform > n-hexane 순으로 활성을 보였다. 특히, 수피부의 EtOAc fr.
산겨릅나무 줄기 시료의 전처리는 음건하여 건식 회화법으로 분해한 후 일정농도로 희석하여 분석한 무기질 함량을 Table 1에 나타내었다. 주요 무기성분은 K과 Ca이 302.4 mg%와 116.0 mg%로 가장 많이 함유되어 있고 Mg, Na, Mn, Fe, Zn, P, Cu의 함량이 각각 57.8, 24.8, 9.5, 4.4, 1.6, 0.8, 0.2 mg% 순으로 나타났다.

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저자의 다른 논문 :

표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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