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문제 정의
- 연구에 착수 하였다. 본 연구에서는 항염, 항균, 항산화 및 항알러지 작용이 보고된 Baicalein을 함유한 황금과 항염, 진통, 항산화작용이 알려진 6-GingeroK 함유한 생강을 복합하여 수용성겔로 제조한 후, 주성분 정량, 피부 투과 및 잔류량 측정, 항염 및 항산화 효과를 측정 비교하였고, DNCB(2, 4-dinitrochlorobenzene)로 유발된 피부염에 대한 치료효과를 검토한 결과 유의성 있는 결과를 얻게 되었으므로 이를 보고하고자 한다.
- 저자는 활성산소에 의한 피부 조직손상을 보호하고, 각종 염증 및 피부염 질환에 효과적인 생약 복합 치료제의 개발을 목적으로 연구에 착수 하였다. 본 연구에서는 항염, 항균, 항산화 및 항알러지 작용이 보고된 Baicalein을 함유한 황금과 항염, 진통, 항산화작용이 알려진 6-GingeroK 함유한 생강을 복합하여 수용성겔로 제조한 후, 주성분 정량, 피부 투과 및 잔류량 측정, 항염 및 항산화 효과를 측정 비교하였고, DNCB(2, 4-dinitrochlorobenzene)로 유발된 피부염에 대한 치료효과를 검토한 결과 유의성 있는 결과를 얻게 되었으므로 이를 보고하고자 한다.
제안 방법
- DPPH법-수용성겔의 Free radical 소거 활성 측정은 Park 등23) 의 방법을 응용하여 실험하였다. 측정에는 1, 1-diphenyl- 2-picrylhydrazil(DPPH)을 사용하였다.
- Hydroxyl radical scavenging activity법- 수용성겔의 Hydroxyl radical 소거활성은 Choi 등24) 의 방법을 응용하여 실험하였다. 여러 농도의 시료에 1.
- 0mL/min, 감도는 0.Q5 AUFs였고 얻어진 피크의 면적을 측정하여 계산하였다.
- Superoxide quenching activity법 -수용성겔의 Superoxide 소거활성은 Choi 등24) 의 방법을 응용하여 실험하였다. 시료를 여러 농도로 하고 0.
- 8)에 riboflavin, methionine, NBT, EDTA를 가하여 조제한 후 같은 조작을 반복하였다. 각각의 흡광도를 측정하여 O2- 소거활성(Superoxide Quenching Ability, SQA%) 을 계산하였다.
- 피부투과실험 직후에 피부 상에 잔류되어 있는 수용성겔을 제거하고 생리식염수를 사용하여 피부를 충분히 씻어낸 후 수용성겔을 직접 바른 부분의 피부만을 절제하고 냉동고에 보관한 다음 해동시켜 trisbuffer 1 mL을 가하고, sonication 하여 균질화 하였다. 균질 액에 t-buthyl ethylether 5 mL를 가하여 원심분리시킨 후 상징액 ImL를 취하고, 50℃에서 증발 건조시킨 후 용제에 녹여 HPLC에 주입한 다음 피크면적의 양으로써 baicalin, baicalein 및 6- gingerol의 잔류량을 산출하였다.
- 4)에 L-ascorbic acid, CuSO4, cytochrome c를 가하여 조제한 후 위와 같은 조작을 반복하였다. 그리고 각각의 흡광도를 측정하여 -OH 소거율(Hydroxy] Radical Scaveniging. Ability, HRSA%)을 계산하였다.
- 박스 안에 5500 lux 광원으로 20±FC에서 15분동안 5분 간격으로 위치를 변화시켜면서 반응시킨 다음 560nm에서 흡광도를 측정하였다. 대조군으로는 같은 농도의 0.05 M sodium phosphate buffer(pH 7.8)에 riboflavin, methionine, NBT, EDTA를 가하여 조제한 후 같은 조작을 반복하였다. 각각의 흡광도를 측정하여 O2- 소거활성(Superoxide Quenching Ability, SQA%) 을 계산하였다.
- 5 mM sodium phosphate buffer (pH 7, 4), 100 µM L-ascorbic acid, 100 pM CuSO4, 12 µM cytochrome c를 가하여 3mL를 조제하고 25℃에서 90분간 반응시킨 후, 550nm에서 흡광도를 측정하였다. 대조군으로는 같은 농도의 sodium phosphate buffer(pH 7.4)에 L-ascorbic acid, CuSO4, cytochrome c를 가하여 조제한 후 위와 같은 조작을 반복하였다. 그리고 각각의 흡광도를 측정하여 -OH 소거율(Hydroxy] Radical Scaveniging.
- 이 각각의 항목은 없음(0), 약함(1) 중증도(2), 심함(3)으로 채점한 후 채점한 5개 항목을 합한 점수를 비교하였다. 따로 마우스 등피부에 변화양상을 관찰하기 위하여 염증생성 및 치료단계에서 마우스를 에테르로 마취시킨 다음 사진을 촬영하여 치료효과를 관찰하였다.
- DNCB(2,4- dinitrochlorobenzene) 1g을 aceton과 oilive oil(3:l) 혼합용액에 녹이고 100 ml로 하여 피부염 유발용액으로 사용하였다. 마우스의 등 피부를 상처가 나지 않도록 제모한 후 1% DNCB 용액 200µl를 투여하고, 4일 후 0.3% DNCB용액 150g을 일주일에 3회씩 2주 간 투여한 다음, 피부염이 충분히 유발되어 가피가 벗겨지고 긁는 행동이 심화되면 DNCB 처리를 중단하였다. 수용성겔 1g 씩을 염증부위에 매일 2회씩 바르면서 피부염의 형태변화를 임상적 육안 평가법을 이용하여 관찰하고 치료계수를 구하였다.
- 마우스의 피부염 유발 및 수용성겔에 의한 치료효과 관찰 은 Rees 등27) 의 방법을 응용하여 실험하였다. DNCB(2,4- dinitrochlorobenzene) 1g을 aceton과 oilive oil(3:l) 혼합용액에 녹이고 100 ml로 하여 피부염 유발용액으로 사용하였다.
- 1 mM ED1A를 가하여 5 mL를 조제한다. 박스 안에 5500 lux 광원으로 20±FC에서 15분동안 5분 간격으로 위치를 변화시켜면서 반응시킨 다음 560nm에서 흡광도를 측정하였다. 대조군으로는 같은 농도의 0.
- 부종 측정은 plethysmometer를 이용하여 1% λ-carrageenan과 1% kaolin의 투여 전과 투여 후 6, 12, 24 및 48시간대에서 3회 반복측정하여 평균값으로 하였다. 부종율은 λ - carrageenan 주사 직후 및 각 시간대의 발 부피의 변화를 이용하여 다음 식으로 부종율(%, swelling) 및 부종 억제율(%, inhibition)을 산출하였다.
- 3회 반복측정하여 평균값으로 하였다. 부종율은 λ - carrageenan 주사 직후 및 각 시간대의 발 부피의 변화를 이용하여 다음 식으로 부종율(%, swelling) 및 부종 억제율(%, inhibition)을 산출하였다.26)
- 3% DNCB용액 150g을 일주일에 3회씩 2주 간 투여한 다음, 피부염이 충분히 유발되어 가피가 벗겨지고 긁는 행동이 심화되면 DNCB 처리를 중단하였다. 수용성겔 1g 씩을 염증부위에 매일 2회씩 바르면서 피부염의 형태변화를 임상적 육안 평가법을 이용하여 관찰하고 치료계수를 구하였다.
- 4 인산완충용액을 수기 용액으로 하였다. 수용성겔 제제 1.0 g 씩을 마우스 피부에 도포한 후 채취시간마다 시험액 100µl씩을 채취하고 새로운 시험액을 동량 보충하였다. 시험액은 37±0.
- 측정에는 1, 1-diphenyl- 2-picrylhydrazil(DPPH)을 사용하였다. 실험방법은 0.2 mM DPPH 메탄올 용액 0.5 mL에 시료을 여러 농도로 희석한 용액 1 mL를 가하고 Vortex mixer로 10초간 진탕한 후 20℃에서 30 min 간 방치한 다음 517nm에서 흡광도를 측정하였다. 비교 표준물질로는 butylated hydroxy anisole(BHA)를 사용하였다.
- 1 mL를 주사하여 유발시켰다. 약물 도포는 유발 1시간 전에 오른쪽 족저부에 각각 1회씩 도포하였다.
- 평가항목은 홍반(erythema), 가려움과 건조피부(Pruritus & Dry skin), 부종과 혈종(Edema & escoriation), 짖무름 (Erosion) 그리고 태선화(Lichenification)로 나누었으며. 이 각각의 항목은 없음(0), 약함(1) 중증도(2), 심함(3)으로 채점한 후 채점한 5개 항목을 합한 점수를 비교하였다. 따로 마우스 등피부에 변화양상을 관찰하기 위하여 염증생성 및 치료단계에서 마우스를 에테르로 마취시킨 다음 사진을 촬영하여 치료효과를 관찰하였다.
- 평가항목은 홍반(erythema), 가려움과 건조피부(Pruritus & Dry skin), 부종과 혈종(Edema & escoriation), 짖무름 (Erosion) 그리고 태선화(Lichenification)로 나누었으며. 이 각각의 항목은 없음(0), 약함(1) 중증도(2), 심함(3)으로 채점한 후 채점한 5개 항목을 합한 점수를 비교하였다.
- 2℃를 유지하도록 하였으며 cell 내의 교반속도는 600 rpm으로 고정하였다. 피부의 단위 면적당 통과한 주성분의 양을 시간에 대한 함수로 나타낸 후 다음의 식을 이용하여 투과 파라메터들을 구하였다.26)
- 피부투과실험 직후에 피부 상에 잔류되어 있는 수용성겔을 제거하고 생리식염수를 사용하여 피부를 충분히 씻어낸 후 수용성겔을 직접 바른 부분의 피부만을 절제하고 냉동고에 보관한 다음 해동시켜 trisbuffer 1 mL을 가하고, sonication 하여 균질화 하였다. 균질 액에 t-buthyl ethylether 5 mL를 가하여 원심분리시킨 후 상징액 ImL를 취하고, 50℃에서 증발 건조시킨 후 용제에 녹여 HPLC에 주입한 다음 피크면적의 양으로써 baicalin, baicalein 및 6- gingerol의 잔류량을 산출하였다.
- 0으로 하여 gel을 제조하였다. 황금 가수분해 수용성겔(이하 SRH)의 제조는 황금 엑스 분말을 정제수에 용해시키고 P-glucuronidase 500 unit를 가하여 50℃에서 2시간 반응시킨 후에 SRE와 동일한 방법으로 제조하였다. 황금 및 생강 복합 수용성겔(이하 SZH)의 제조는 황금엑스를 가수분해시킨 후 생강 엑스을 혼합하여 SRE와 동일한 방법으로 제조하였다(Table I).
- 황금 가수분해 수용성겔(이하 SRH)의 제조는 황금 엑스 분말을 정제수에 용해시키고 P-glucuronidase 500 unit를 가하여 50℃에서 2시간 반응시킨 후에 SRE와 동일한 방법으로 제조하였다. 황금 및 생강 복합 수용성겔(이하 SZH)의 제조는 황금엑스를 가수분해시킨 후 생강 엑스을 혼합하여 SRE와 동일한 방법으로 제조하였다(Table I).
- 실험하였다. 황금 엑스 분말을 정제수에 용해시키고 propylene glycol, labrosol, ethanol를 순차적으로 가하여 혼합한 후 carbopol 940을 넣어 팽윤시키고 triethanolamine을 적가하여 pH 7.0으로 하여 gel을 제조하였다. 황금 가수분해 수용성겔(이하 SRH)의 제조는 황금 엑스 분말을 정제수에 용해시키고 P-glucuronidase 500 unit를 가하여 50℃에서 2시간 반응시킨 후에 SRE와 동일한 방법으로 제조하였다.
- 황금의 주성분인 baicalin를 가수분해 시키고 생강의 주성분인 6-gingerol< 함유하는 복합 수용성겔 제제를 제조한 후, 항산화 활성 및 부종억제 효과를 비교 관찰하고, 피부염에 대한 보호 및 치료제로서의 가능성을 검토하기 위하여, 피부투과율 측정, 항산화 활성, 항염 효과, 피부염 유발 및 치료 효과 관찰을 통하여 다음과 같은 결론을 얻었다.
대상 데이터
- Carbopol 940은 BASF Co.(Ludwigshafen, Germany), Labras이은 Gattefbsse Co. (Cedex, France)에서 2,4-dinitrochlorobenzene(DNCB)과 1, 1- diphenyl-2-picrylhydrazyl(DPPH)은 Sigma CoJU.S.A.)에서 구입하여 사용하였다. 기타 시약은 특급 시약을 사용하였다.
- 시판품을 구입하여 사용하였다. Baicalin, Baicalein (Sigma Chemical Co., U.S.A.) 및 6-Gingerol(Weko Chemical Co., Japan)은 표준품을 사용하였다. Carbopol 940은 BASF Co.
- 의 방법을 응용하여 실험하였다. DNCB(2,4- dinitrochlorobenzene) 1g을 aceton과 oilive oil(3:l) 혼합용액에 녹이고 100 ml로 하여 피부염 유발용액으로 사용하였다. 마우스의 등 피부를 상처가 나지 않도록 제모한 후 1% DNCB 용액 200µl를 투여하고, 4일 후 0.
- Hairless mouse(웅성, 25±5 g, Charles River Lab., U.S.A.), ICR계 마우스(웅성, 25±5g, Daehan Biolink, Korea) 및 S.D. 계 랫트(웅성, 200±20g, Daehan Biolink, Korea)를 분양 받아 사용하였다. 사육실 온도는 25±1℃, 습도 55±10%를 유지하였고, 명암은 12시간 주기로 하였다.
- High Performance Liquid Chromatograph(M930, Youngin Co., Korea), Spectrophotometer(Shimazu UV-1201, Japan), Skin permeation tester(FCDV-15, Lab Fine, Korea), Surface tensionmeter(Model 3010, Yoshida, Co., Japan), Digital Plethysmometer(LE 7500, Panlab S.I., Spain) 등을 사용하였다.
- 5% phosphoric acid : acetonitrile (73 :27 v/v%)의 혼액을 사용하였다. 검출기는 UV detector로서 파장은 280 nm, 유속은 1.2mL/min, 감도는 0.05 AUFs였고 얻어진 피크의 면적을 측정하여 계산하였다.
- 고정상으로는 µ-Bondapak C18 3.9×300mm, Waters®을 사용하였고, 이동상으로는 0.5% phosphoric acid : acetonitrile (73 :27 v/v%)의 혼액을 사용하였다. 검출기는 UV detector로서 파장은 280 nm, 유속은 1.
- 5 mL에 시료을 여러 농도로 희석한 용액 1 mL를 가하고 Vortex mixer로 10초간 진탕한 후 20℃에서 30 min 간 방치한 다음 517nm에서 흡광도를 측정하였다. 비교 표준물질로는 butylated hydroxy anisole(BHA)를 사용하였다. 그 활성의 크기는 DPPH(66.
- 방법을 응용하여 실험하였다. 측정에는 1, 1-diphenyl- 2-picrylhydrazil(DPPH)을 사용하였다. 실험방법은 0.
- 의 HPLC방법에 따라 측정하였다. 칼럼은 µ-Bondapak C18 3.9×300 mm, Waters ®을 사용하였으며, 이동상으로는 acetonitrile : water (55:45 v/v%)의 혼액을 사용하였다. 검출기는 UV detector로서 파장은 280 nm, 유속은 1.
- 황금(Scutellariae Radix)은 익산 보화당 한의원에서 구입, 음건하여 사용하였고 생강(Zingiberis Rhizoma)은 전북 봉동지역 시판품을 구입하여 사용하였다. Baicalin, Baicalein (Sigma Chemical Co.
- 황금의 황색 분말(Yeild 19.4%)과 생강의 담갈색 분말(Yeild 20.1%)을 얻어 시료로 하였다.
이론/모형
- 생강엑스 및 수용성겔 중에 함유되어 있는 6-gingerol의함량은 Jo 등20) 의 HPLC방법에 따라 측정하였다. 칼럼은 µ-Bondapak C18 3.
- 수용성겔의 피부투과 실험은 Yang 등21) 의 방법에 따라 실험하였다. SRE, SRH 및 SZH제제를 각각 1.
- 수용성겔의 항염 실험은 Winter 등25) 의 방법에 따라 실험하였다. 부종 유발은 랫트의 오른쪽 족 저부에 1% λ- carrageenan과 1% kaolin을 증류수에 녹여 0.
- 피부 잔류량 측정은 Min 등22) 의 방법에 따라 실험하였다. 피부투과실험 직후에 피부 상에 잔류되어 있는 수용성겔을 제거하고 생리식염수를 사용하여 피부를 충분히 씻어낸 후 수용성겔을 직접 바른 부분의 피부만을 절제하고 냉동고에 보관한 다음 해동시켜 trisbuffer 1 mL을 가하고, sonication 하여 균질화 하였다.
- 황금 수용성겔(이하 SRE)의 제조는 Yang 등18) 의 방법에 따라 실험하였다. 황금 엑스 분말을 정제수에 용해시키고 propylene glycol, labrosol, ethanol를 순차적으로 가하여 혼합한 후 carbopol 940을 넣어 팽윤시키고 triethanolamine을 적가하여 pH 7.
- 황금엑스 및 수용성겔 중에 함유되어 있는 baicalin 및 baicalein의 함량은 Rhee 등19)의 HPLC방법에 따라 측정하였다. 고정상으로는 µ-Bondapak C18 3.
성능/효과
- 48시간 후 부터는 감작한 부분의 털이 빠지기 시작하면서, 좁쌀 모양 형태의 검붉은 점들이 일부 나타나기 시작하였다. 1주일 후 감작한 부분의 털이 완전히 빠지면서, 매우 심한 홍반과 혈관확장, 출혈 및 염증이 나타났고, 긁은 행동도 매우 심하게 관찰되었다. 2주후에는 그 증상 더욱 심하게 진행되어 각 겔에서 평가점수가 11점부터 14점 사이로 피부염이 최고조에 달하였다.
- 1주일 후 감작한 부분의 털이 완전히 빠지면서, 매우 심한 홍반과 혈관확장, 출혈 및 염증이 나타났고, 긁은 행동도 매우 심하게 관찰되었다. 2주후에는 그 증상 더욱 심하게 진행되어 각 겔에서 평가점수가 11점부터 14점 사이로 피부염이 최고조에 달하였다.
- 48시간 후 대조군에 대한 부종 억제율을 비교해보면 SRE에서 29%로 나타난 반면, SRH에서 63%, SZH에서는 66%로써 약 2배 정도 높은 억제율을 보여주었다(Figure 10).
- 약물 도포후 4일째 부터는 SZH에서 털이 조금씩 나기 시작하더니 짖무름이나 혈종, 부종이 거의 치료된 상태로 진행되었고, 약간의 홍반과 태선화만 관찰되었다. 4일째 SZH 7.4점으로 SRH 9.2, SRE 10.6점에 비해 우수한 성적을 보여주었고, 6일째에는 겔을 도포한 모든 마우스에서 긁은 행동은 거의 사라졌으며, SRE의 경우에는 홍반과 태선화가 여전해 8.2점을 기록했고, SRH의 경우 털이 많이 나기 시작해 털이 없는 부분에 약간의 홍반과 태선화만 눈에 띄어 7점을 기록했다. SZH의 경우에는 모든 항목에서 약함을 보여 5.
- DNCB 처리를 중단하고 약물을 도포한지 2일 후부터 관찰한 결과 SRE의 경우에는 대조군과는 큰 차이를 보여 주지는 못하였지만, 출혈 및 짖무름은 조금 개선된 상태였고, SRH 및 SZH에서는 출혈 및 짖무름 뿐만 아니라 홍반과부종도 조금 줄어들어, 평가항목에서 10.4점을 기록하였다. 하지만 긁은 행동은 여전히 심하였다.
- DNCB에 의한 피부염 유발 후 치료효과를 비교한 결과, 피부염 생성 6일 후에 SZH에서 치료계수가 5.4로 가장 좋은 성적을 보여주었고, SRH는 7, SRE는 8.2순으로 나타났다. 대조군은 15일까지 염증이 지속되었으나, SZH의 경우 피부염 생성 8일 후 거의 완치됨으로써 치료기간도 단축되었으며 치료효과도 우수한 것으로 평가되었다.
- SZH, SRH 및 SRE 모두가 대조군에 비해 우수한 성적을 보여주었는데, 그 중 SZH에서 가장 우수한 성적을 보여주었고, 치료 기간도 가장 단축된 것으로 나타났다. 치료 기간은 대조군이 13.
- 2순으로 나타났다. 대조군은 15일까지 염증이 지속되었으나, SZH의 경우 피부염 생성 8일 후 거의 완치됨으로써 치료기간도 단축되었으며 치료효과도 우수한 것으로 평가되었다.
- 9%순으로 나타났다. 따라서, 이로 미루어 -OH소거활성은 baicalin이 baicalein에 비해 더 높은 수치를 보여주었으나, 6-gingerol을 함유할 경우 훨씬 높은 -OH 소거활성을 나타내는 것으로 사료된다. (Figure 8).
- 9999로서 250µg/mL끼지 6-gingerol의 직선성이 인정되었다. 생강 엑스중의 6-gingerol 함유량은 48.1±1.86mg/g로 나타났으며,SZH에서의 함량은 0.11%로 나타났다(Table Ⅱ).
- 수용성겔 제제의 피부투과율은 SRE에 함유된 baicalin이 저조한 피부투과율을 나타낸 반면, SRH 및 SZH에 함유된 baicaleine baicalin에 비하여 훨씬 높은 성적을 보여 주었으며 6-gingerole 완만한 피부투과율을 나타내었다.
- 수용성겔 제제의 항산화 효과는 SZH 및 SRH는 Free radical 및 Superoxide 소거활성이 SRE에 비하여 훨씬 높게 나타났고, SZH는 SRH에 비하여 -OH 소거활성이 더 높은 것으로 나타남으로써, SZH에서 Hydroxyl radical, Free radical, Superoxide 소거활성이 모두 높게 나타나 항산화능이 가장 좋은 것으로 나타났다.
- 수용성겔 제제의 항염효과는 SRH 및 SZH에서 SRE에 비하여 약 2.3배 정도의 높은 효과를 나타내었고, SZH는 SRH보다 약간 높았으나 큰 차이를 보여주지는 못하였다.
- 수용성겔에서의 함량은 SRE에서 baicalin이 0.39%, baica-lein이 0.03%이었고, 가수분해시킨 겔인 SRH에서는 baicalin이 0.16%, baicalein이 0.3%이었으며, SZH에서는 baicalin이 0.15%, baicalein이 0.29%로 SRH와 비슷한 함량을 나타내었다(Table Ⅱ).
- 하지만 긁은 행동은 여전히 심하였다. 약물 도포후 4일째 부터는 SZH에서 털이 조금씩 나기 시작하더니 짖무름이나 혈종, 부종이 거의 치료된 상태로 진행되었고, 약간의 홍반과 태선화만 관찰되었다. 4일째 SZH 7.
- 이상의 결과 황금 가수분해물인 baicalein과 생강의 주성분인 6-gingerol을 함유한 수용성겔은 항산화 활성 및 피부염 치료효과를 높여줌으로써 생약 복합 외용제로써 개발 가치성이 높은 것으로 사료된다.
- 치료 과정 중에 관찰양상을 사진으로 촬영해 치료 효과를 확인할 수 있었고, 8일째 되는 날에 대조군, SRE, SRH, SZH을 도포한 마우스의 등 피부를 비교하여 유의성 있는 결과를 눈으로 확인할 수 있었다(Figure 12).
- 치료 기간은 대조군이 13.6일 정도 걸린 반면, SRE에서 9.8일, SRH에서 7.2일, SZH이 6.2일 걸려 대조군에 비해 모두 우수한 성적을 보여주었으나, SZH의 경우가 치료기간이 제일 짧게 나타났다(Table Ⅵ, Figure 11).
- 한편, Superoxide 소거활성 실험에서는 10, 000 µg/mL농도에서 SZH가 79.42%로 가장 높은 억제율을 보여주었고, SRH 74.92%, SRE 55.96%순으로 나타났으며, 농도에 따른 02- 소거활성은 SZH에서 가장 높게 나타났다(Figure 9).
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