반응표면분석법을 이용하여 Sacharomyces cerevisaeJUL3의 균체량 생산을 위한 배지조성 최적화 Optimization of Medium Components for Cell Mass Production of Saccharomyces cerevisiae JUL3 using Response Surface Methodology원문보기
본 연구는 효모의 세포벽에 존재하는 본 연구는 효모의 세포벽에 존재하는 ${\beta}-Glucan$을 대량생산하기 위해 Saccharomyces cerevisiae JUL3의 균체량을 증가시키기 위한 연구를 수행하였다. S. cerevisiae JUL3의 배양학적 특성을 알아보기 위해 kinetic parameter를 조사하였을 때 specific growth rate (${\mu}$)는 $0.145\;h^{-1}$, yield ($Y_{x/s}$)는 0.332 g/g, glucose 소모속도($q_{s}$)는 $0.437\;h^{-1}$이며 productivity (P)는 $0.4827\;g/{\ell}{\cdot}h$을 나타내었다. 균체량이 가장 높게 나타난 탄소원과 질소원은 고과당 (high fructose syrup)과 yeast extract이었다. 효모균체 대량생산 및 scale up을 위하여 반응표면 분석법을 통하여 고과당과 yeast extract에 대한 최적농도를 조사하였다. 균체량이 가장 많이 생산되어질 수 있는 조건으로 제시된 고과당과 yeast extract의 최적 농도는 각각 8.0 %와 5.2 %였으며, 이 때 예측되는 균체량은 $16.95\;g/{\ell}$ 이었다.
본 연구는 효모의 세포벽에 존재하는 본 연구는 효모의 세포벽에 존재하는 ${\beta}-Glucan$을 대량생산하기 위해 Saccharomyces cerevisiae JUL3의 균체량을 증가시키기 위한 연구를 수행하였다. S. cerevisiae JUL3의 배양학적 특성을 알아보기 위해 kinetic parameter를 조사하였을 때 specific growth rate (${\mu}$)는 $0.145\;h^{-1}$, yield ($Y_{x/s}$)는 0.332 g/g, glucose 소모속도($q_{s}$)는 $0.437\;h^{-1}$이며 productivity (P)는 $0.4827\;g/{\ell}{\cdot}h$을 나타내었다. 균체량이 가장 높게 나타난 탄소원과 질소원은 고과당 (high fructose syrup)과 yeast extract이었다. 효모균체 대량생산 및 scale up을 위하여 반응표면 분석법을 통하여 고과당과 yeast extract에 대한 최적농도를 조사하였다. 균체량이 가장 많이 생산되어질 수 있는 조건으로 제시된 고과당과 yeast extract의 최적 농도는 각각 8.0 %와 5.2 %였으며, 이 때 예측되는 균체량은 $16.95\;g/{\ell}$ 이었다.
[ ${\beta}-Glucan$ ], one of the cell wall components, is most plentiful polysaccharides in cell wall and has several advantages in immune system. In yeast ${\beta}-glucan$ is mainly contained in the yeast cell wall, and thus it is important to produce high levels of cell mass ...
[ ${\beta}-Glucan$ ], one of the cell wall components, is most plentiful polysaccharides in cell wall and has several advantages in immune system. In yeast ${\beta}-glucan$ is mainly contained in the yeast cell wall, and thus it is important to produce high levels of cell mass for the mass production of yeast ${\beta}-glucan$. The best carbon and nitrogen sources on cell mass production were high fructose syrup and yeast extract. Response surface methodology (RSM) was very potential tool for the optimization of process factor and medium component. It was applied to estimate the effects of medium components on the production of cell mass. Optimal concentrations of high fructose syrup and yeast extract by response surface methodology were 8.0% (v/v) and 5.2% (w/v), respectively and the cell mass predicted was $17.0\;g/{\ell}$ at 20 h of cultivation.
[ ${\beta}-Glucan$ ], one of the cell wall components, is most plentiful polysaccharides in cell wall and has several advantages in immune system. In yeast ${\beta}-glucan$ is mainly contained in the yeast cell wall, and thus it is important to produce high levels of cell mass for the mass production of yeast ${\beta}-glucan$. The best carbon and nitrogen sources on cell mass production were high fructose syrup and yeast extract. Response surface methodology (RSM) was very potential tool for the optimization of process factor and medium component. It was applied to estimate the effects of medium components on the production of cell mass. Optimal concentrations of high fructose syrup and yeast extract by response surface methodology were 8.0% (v/v) and 5.2% (w/v), respectively and the cell mass predicted was $17.0\;g/{\ell}$ at 20 h of cultivation.
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제안 방법
S. cerevisiase JUL3 균주를 배양배지에서 배양하였을 때 glucose 농도, pH 그리고 균체량 (Dry cell weight)의 변화를 조사하였다(Fig. 1). Lag phase는 6~8시간이었으며 stationary phase는 18~20시간이었다, Glucose는 배양 10시간부터 급속히 소모되어 18시간에 완전히 소모되었다.
본 연구는 5. cerevisiae JUL3 변이주의 균체량을 증가시켜 P-glucan# 대량생 산하기 위하여 통계 학적 분석 방법 인 반응표면분석 법을 이용하여 효모 균체량을 증가시키는데 가장 적합한 배지의 조성을 조사하였다.
균체량 생산에 대한 glucose 농도의 영향을 조사하기 위하여 배양배지에 glucose 농도를 1.0~5.0%로 변화시켜 배양하였다. 최종 pH는 glucose 농도가 증가할수록 감소하였다.
균체량 생산에 대한 접종량의 영향을 조사하기 위하여 배양 배지에 종균배양액을 다양한 농도로 접종하여 20시간 배 양하였다. 생산된 균체 량은 9.
0%로 접종하여 shaking incubator에서 30℃, 200 rpm으로배 양하였다. 균체량을 증가시 키 기 위하여 탄소원과 질소원을 변화시켜 액체배양하였다.
배지 조성에 대한 실험은 Table 4와 같이 균체량 생산에 중요한 독립변수 (為)로 고려되는 인자 즉, 탄소원 (X。과 질소원 02)에 대한 실험범위를 설정하여 각각을 5단계로 부호화하고 12개의 실험계획으로 이루어진 중심 합성 계획법 (central composite design)을 실시하였다. 또한, 독립 변수의 영 향을 받는 종속변수 (Y) 즉, 균체량을 측정하여 그 값을 회귀 분석에 사용하였으며, 이때 2개의 독립변수와 종속변수에 대한 2차 회귀 모형식은 다음과 같다.
배양배지에 다양한 유기질소원을 1.0%와 3.0%로 첨가하여 질소원의 영향을 조사하였다. 유기 질소원을 1.
배양배지에 탄소원 종류와 농도를 변화시켜 배양함으로서 탄소원의 영향을 조사하였다. Sucrose와 fructose보다는 glucose를 이용했을 때 균체량이 다소 높았다.
본 연구에서는 균체량을 증가시 킬 수 있는 배지 조성 최적화를 위하여 반응표면 분석법을 사용하였다(12). 배지 조성에 대한 실험은 Table 4와 같이 균체량 생산에 중요한 독립변수 (為)로 고려되는 인자 즉, 탄소원 (X。과 질소원 02)에 대한 실험범위를 설정하여 각각을 5단계로 부호화하고 12개의 실험계획으로 이루어진 중심 합성 계획법 (central composite design)을 실시하였다. 또한, 독립 변수의 영 향을 받는 종속변수 (Y) 즉, 균체량을 측정하여 그 값을 회귀 분석에 사용하였으며, 이때 2개의 독립변수와 종속변수에 대한 2차 회귀 모형식은 다음과 같다.
효모의 균체량을 증가시키 기 위한 배지조성의 최적화를 위하여 탄소원과 질소원 영향의 실험에서 좋은 효과를 보인 고과당 (high fructose syrup)과 yeast extract를 독립 변수로 하고 건조균체량을 종속변수로 하여 2 변수, 5 수준의 중심 합성 계 획 법 으로 최적 화를 실시하였다. High fructose syrup과 yeast extract# 독립변수로 실험을 실시하였고 균체량에 대한 반응표면 회귀식은 다음과 같다.
회귀계수이다. 회귀분석에 의한 모델식의 예측은 SAS (statistical analysis system) 9.1 버전의 프로그램을 이용하였다.
이론/모형
, Korea)를 실시하여 얻어졌다. P-Glucan 함량은 Yeast f-glucan kit (K-YBGL, Megazyme International Ireland Ltd.)를 이용한 분석 과정을 통하여 측정되었다(www.megazyme.com).
이다. 본 연구에서는 균체량을 증가시 킬 수 있는 배지 조성 최적화를 위하여 반응표면 분석법을 사용하였다(12). 배지 조성에 대한 실험은 Table 4와 같이 균체량 생산에 중요한 독립변수 (為)로 고려되는 인자 즉, 탄소원 (X。과 질소원 02)에 대한 실험범위를 설정하여 각각을 5단계로 부호화하고 12개의 실험계획으로 이루어진 중심 합성 계획법 (central composite design)을 실시하였다.
성능/효과
75 잉叉로 가장 높은 균체량을 나타내었다. Glucose 소모량도 유기 질소원이 1% 로 첨가되었을 때보다도 3.0%로 첨가하였을 때 좋았으며, 최종 pH는 유기질소원에 따라 다양하게 나타나게 되었다. 무기질소원인 ammonium sulfate를 첨가하였을 때는 균이잘 성장하지 못하여 균체 량이 2.
탄소원의 영향을 조사하였다. Sucrose와 fructose보다는 glucose를 이용했을 때 균체량이 다소 높았다. 값싼 산업용 배지인 hydrol, high fructose syrup (고과당), 그리고 molasses (당밀)을 사용하였을 때는 균체량이 glucose와 비슷하여 효모균체 생산에 적합한 값싼 배지로 이용될 수 있음을 확인하였다.
Sucrose와 fructose보다는 glucose를 이용했을 때 균체량이 다소 높았다. 값싼 산업용 배지인 hydrol, high fructose syrup (고과당), 그리고 molasses (당밀)을 사용하였을 때는 균체량이 glucose와 비슷하여 효모균체 생산에 적합한 값싼 배지로 이용될 수 있음을 확인하였다. 사용된 탄소원 중 high fructose syrup에서 최대 균체량 (13.
5 에 나타난 타원형과 경사진 그래프의 형상에서 확인하였다(13). 균체량 생산이 가장 높은 고과당과 yeast extract의 최적 수준값 (농도)은 각각 2.0 (8.0%)과 1.467 (5.2%)이었으며, 예측되는 최대 균체량은 16.95 g//이었다.
5에 도식하였다. 균체량에 대한 IF는 0.9352로 높은 유의성을 보였고 변동계수 (Coffeicient of Variation, CV)는 6.47 로 이전실험과 비교할 때, 상대적으로 낮은 수치를 나타내어 균체량 생산에 변수들의 독립적인 영향이 있을 뿐만 아니라 변수들의 상호작용도 높음을 나타내었으며 Fig. 5 에 나타난 타원형과 경사진 그래프의 형상에서 확인하였다(13). 균체량 생산이 가장 높은 고과당과 yeast extract의 최적 수준값 (농도)은 각각 2.
0%로 첨가하였을 때 좋았으며, 최종 pH는 유기질소원에 따라 다양하게 나타나게 되었다. 무기질소원인 ammonium sulfate를 첨가하였을 때는 균이잘 성장하지 못하여 균체 량이 2.0 g/Z 보다 낮아서 효모의 균체량을 증가시키는데 적합하지 않은 배지조성으로 판명되었다(Fig. 4).
값싼 산업용 배지인 hydrol, high fructose syrup (고과당), 그리고 molasses (당밀)을 사용하였을 때는 균체량이 glucose와 비슷하여 효모균체 생산에 적합한 값싼 배지로 이용될 수 있음을 확인하였다. 사용된 탄소원 중 high fructose syrup에서 최대 균체량 (13.10 g//)을 얻었으며, 당밀 (molasses)에서도 glucose와 비슷한 수준의 균체량을 얻어 경제적인 측면을 고려할 때 당밀 (molasses) 또한 우수한 탄소 원으로 생각된다(Table 3).
양하였다. 생산된 균체 량은 9.50-9.89 g//로 비슷하였으며, 당은 모두 소모되었고 최종 pH는 접종량이 증가할수록 증가하였다(Fig. 2).
각각의 kinetic parameter 값을 Table 2에 나타내었다. 생산된 효모 균체의 P-glucan 함량을 Yeast P -glucan kit를 사용하여 분석한 결과 97.2 mg/g of dry cell weight 이었다.
0%로 첨가하여 질소원의 영향을 조사하였다. 유기 질소원을 1.0%로 첨가하였을 때는 bacto-peptone이 최 대균체량 (8.20 g/L)을 보였으나, 3.0%로 첨가하였을 때는 tryptone과 yeast extract에서 균체생산량이 각각 9.75 과 10.75 잉叉로 가장 높은 균체량을 나타내었다. Glucose 소모량도 유기 질소원이 1% 로 첨가되었을 때보다도 3.
0%로 변화시켜 배양하였다. 최종 pH는 glucose 농도가 증가할수록 감소하였다. 이것은 효모가 배양에 필요한 탄소원을 사용하면서 대사산물로 유기산을 배출하여서 나타난 현상이며 탄소원의 농도가 높을수록 배출되는 유기산의 농도가 높아지기 때문에 pH가 낮게 나타나게 된다.
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