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문제 정의
- 따라서 본 연구에서는 선택적 배양 없이 매립지 생태계에 존재하는 미생물의 유전체(genomic DNA)를 추출하여 PCR을 이용한 16S rDNA 유전자의 염기서열을 분석하는 분자생물학적 기술을 이용하여 매립지 주변 생태계에 존재하는 미생물의 다양성을 확인하였다. 또한 Real-Time PCR을 이용하여 탈질화 및 메탄생성 유전자를 정량하고, 수질인자와의 상관분석 통해 매립지 안정화정도 모니터링 인자로써 미생물 지표를 개발하고자 하였다.
- 다양성을 확인하였다. 또한 Real-Time PCR을 이용하여 탈질화 및 메탄생성 유전자를 정량하고, 수질인자와의 상관분석 통해 매립지 안정화정도 모니터링 인자로써 미생물 지표를 개발하고자 하였다.
- 본 연구에서는 분자생물학적 방법을 사용하여 매립지 침출수 내에 분포하는 미생물의 다양성을 확인하고 탈질 및 메탄생성에 관여하는 유전자를 정량화하여 오염물질 농도와의 상관관계를 확인하여 분자생물학적인 안정화 지표를 개발하고자 하였다.
제안 방법
- 일반 균종을 분석하기 위하여 universal primer 27F와 1492R을 이용하여 16S rDNA를 증폭하였다.9) PCR 증폭 산물을 100 mV에서 30분 동안 전기영동(Mupid-a, Japan)을 하여 겔 상에 나타난 16S rDNA 부분을 분리한 후 Winzard® SV Gel and PCR Clean-Up System (Promega, USA)을 사용하여 정제하였다. 정제된 16S rDNA PCR 산물을 pGEM-T easy vector(Promega, USA)에 ligation 한 후 competent cell(E.
- Competitive PCR을 이용한 nirS gene 및 cnorB gene 의 정량을 위해 competitor DNA를 제작하였다. PCR 산물의 크기가 800 bp 인 nirS gene 의 competitor DNA는 600 bp로 제작하였고, 크기가 380 bp인 cnorB gene의 competitor DNA는 304 bp로 제작하였다.
- Real-Time PCR 반응은 master mix로 제조된 iQ SYBR Green Supermix(2X, BioRad, USA)> 사용하여 증폭하였다.
- Real-Time PCR을 이용하여 정량된 nirS gene, cnorB gene 및 MCR gene 의 개체수와 TOC, N*, H3 NO3-N, NO2-N, Cl;alkalinity 수질 분석 자료와의17) 상관관계를 분석하였다. 먼저 J 매립지의 경우 Fig.
- USA)을 사용하였다. 각 gene에 대한 특이적인 DNA의 절대적 정량을 위한 standard curve 작성을 위해 nirS gene, cnorB gene, nosZ gene 및 MCR gene PCR product를 pGEM-T easy vector(Promega, USA) 에 삽입하고 competent cell을 이용하여 다량으로 cloning하였다. Spectrophotometer(HP-agilent 8453)를 이용하여 각각의 gene에 대한 plasmid vector의 농도를 측정한 후 각 gene의 농도에 따른 copy number를 식 (1)과 같이 산정하였다.
- O를 N?로 환원시키는 nitrous oxide reductase 효소를 발현하는 nosZ gene을 Competitive PCR 및 Real-Time PCR 이용하여 정량하였다. nirS gene 정량을 위한 primer는 Liu 등12)이 제안한 것을 적용하였고, cnorB gene 정량을 위한 primer는 Baker 등13)이 제안한 것, nosZ gene을 중폭하기 위해 Seals 등14)이 제안한 것을 이용하였다.
- 매립지 침출수에서 추출한 genomic DNA 중에서 정량을 위한 nirS gene과 절대적 양을 알고 있는 competitor DNA를 혼합하여 PCR 반응을 수행하였다. PCR 결과 시료에서 추출된 genomic DNA 내에는 다양한 종류의 DNA가 혼합되어 있어서, competitor DNA와 비교하여 nirS gene을 정량하는 것이 불가능하였다.
- (HA-1000-3, Hanil Science)하였다. 분리된 농축액 약 500mg에 FastDNA® SPIN kit(Biol01 system, Q-Bio gene)를 사용하여 FastPrep® Instrument(Q-Bio gene) speed 4에서 5초동안 bead beating을 한 후 genomic DNA를 추출하였다. 추출한 genomic DNA를 주형으로 중합연쇄반응(Polymerase Chain Reaction, PCR)을 실시하였다.
- 0 6 범위로 희석하여 검량선을 작성하였다. 이 검량선을 이용하여 시료 중 각 gene의 농도를 copy수 기준으로 환산하여 정량하였다.
- 추출한 genomic DNA를 주형으로 중합연쇄반응(Polymerase Chain Reaction, PCR)을 실시하였다. 일반 균종을 분석하기 위하여 universal primer 27F와 1492R을 이용하여 16S rDNA를 증폭하였다.9) PCR 증폭 산물을 100 mV에서 30분 동안 전기영동(Mupid-a, Japan)을 하여 겔 상에 나타난 16S rDNA 부분을 분리한 후 Winzard® SV Gel and PCR Clean-Up System (Promega, USA)을 사용하여 정제하였다.
- 정량 목적 DNA가 PCR에 의해 증폭되는 동안 DNA 이중나선에 특이적으로 결합하는 SYBR Green I dye 의 형광 신호를 측정하기 위해 iCyber iQ Real-Time Detection System(BioRad, USA)을 사용하였다. 각 gene에 대한 특이적인 DNA의 절대적 정량을 위한 standard curve 작성을 위해 nirS gene, cnorB gene, nosZ gene 및 MCR gene PCR product를 pGEM-T easy vector(Promega, USA) 에 삽입하고 competent cell을 이용하여 다량으로 cloning하였다.
- 9) PCR 증폭 산물을 100 mV에서 30분 동안 전기영동(Mupid-a, Japan)을 하여 겔 상에 나타난 16S rDNA 부분을 분리한 후 Winzard® SV Gel and PCR Clean-Up System (Promega, USA)을 사용하여 정제하였다. 정제된 16S rDNA PCR 산물을 pGEM-T easy vector(Promega, USA)에 ligation 한 후 competent cell(E.coli XLl-blue)에 형질전환(Transfbrmation)하여 Ampicillin, X-gal/IPTG(Promega, USA)가 처리된 LB(Luria-Bertani) 고체배지에서 선택배양 한 후 Winzard® Plus Minipreps DNA Purification System(Promega, USA)을 사용하여 plasmid를 정제하였다.
- 정제된 plasmid에 대한 염기서열을 분석(3100 Capillary DNA sequencer, &)plied Biosystems)한 후 분석된 염기서열은 NCBI(National Center for Biotechnology Information) 의 BLAST Network Service 를 이용하여 Genebank database 내의 bacterial 16S rDNA sequence와 비교하여 97% 이상의 유사성을 보이는 근연종을 기준으로 시료 중 존재하는 미생물 종류를 분류하였다.
- 증폭된 16S rDNA 유전자를 정제하여 pGEM-T easy vector에 삽입한 후 다시 plasmid를 회수 정제하여 DNA의 염기서열을 분석하였다. J 매립지의 경우 cloning한 DNA 중 sequence가 분석된 것을 BLAST search한 결과 47.
- 분리된 농축액 약 500mg에 FastDNA® SPIN kit(Biol01 system, Q-Bio gene)를 사용하여 FastPrep® Instrument(Q-Bio gene) speed 4에서 5초동안 bead beating을 한 후 genomic DNA를 추출하였다. 추출한 genomic DNA를 주형으로 중합연쇄반응(Polymerase Chain Reaction, PCR)을 실시하였다. 일반 균종을 분석하기 위하여 universal primer 27F와 1492R을 이용하여 16S rDNA를 증폭하였다.
대상 데이터
- 위해 competitor DNA를 제작하였다. PCR 산물의 크기가 800 bp 인 nirS gene 의 competitor DNA는 600 bp로 제작하였고, 크기가 380 bp인 cnorB gene의 competitor DNA는 304 bp로 제작하였다. 제작된 competitor DNA의 크기를 전기영동으로 확인한 결과를 Fig.
- 매립지 침출수 내 미생물의 군집 분석을 위해 폐기물 매립지역을 기준으로 지하수 흐름 방향으로 100 m 이내에 설치된 각각 7개(J 매립지)와 8개(T 매립지)의 관측정(지름 2 in)에서 침줄수 시료를 채취하였다. 침출수 시료 채취는 각 관측정에서 bailer(Cole-Parmer, USA)를 사용하여 멸균된 1 L 채수병에 head space가 없도록 채수하여 밀봉한 후 4℃ 이하의 냉온 상태로 실험 전까지 보관하였다.
- 본 연구에 적합한 매립지 선정을 위해 국내의 사용종료매립지 1,170개소 증 정밀조사 대상매립지로 선정된 244개소에 대한 기초자료 조사 및 현장 답사를 통하여 매립지 2개소(천안 J 매립지, 원주 T 매립지)를 선정하였다.1,2) 선정된 연구대상매립지에 대한 기본적 현황을 Table 1에 나타내었다.
- 탈질화 각 단계에 관여하는 효소를 발현하는 유전자를 대상으로 정량을 실시하였다. 탈질화 단계 증 NC^-에서 NO2-로 환원되는 과정에 관여하는 nitrate reductase는 탈질화 과정뿐만 아니라 질소호흡과정에도 관여한다고 알려져 있다.
이론/모형
- 및 Real-Time PCR 이용하여 정량하였다. nirS gene 정량을 위한 primer는 Liu 등12)이 제안한 것을 적용하였고, cnorB gene 정량을 위한 primer는 Baker 등13)이 제안한 것, nosZ gene을 중폭하기 위해 Seals 등14)이 제안한 것을 이용하였다.
- 메탄 생성 유전자 정량을 위해서 메탄 생성 기작의 마지막 단계를 촉매하는 methyl coenzyme M reductase(MCR gene) 발현 유전자 증폭을 위한 primer 및 PCR 조건은 Hales 등15)의 방법을 적용하였다.
성능/효과
- 이러한 결과는 침출수에서 채취된 genomic DNA는 혼합 DNA(total genomic DNA)이고 이 중 특정 유전자가 차지하는 비중은 매우 작아 상대적으로 미량 존재하기 때문에 순수한 단일 조성의 DNA인 competitor DNA와의 경쟁 반응에서 효율적으로 증폭되지 않았기 때문인 것으로 판단되었다. 이러한 결과는 Real-Time PCR법을 통한 정량결과에서 "irS gene이 cnorB gene에 비해 약 7배 정도 많이 검출된 결과에 의하여 설명될 수 있다. 결과적으로 competitive PCR 정량 결과는 Real-Time PCR 정량 결과에 비해 상대적으로 작은 양이 측정되었다.
- 1) 분자생물학적 방법을 사용하여 cloning한 16S rDNA 중 분석된 DNA sequence를 BLAST search한 결과 97% 이상 유사성을 보이는 근연종은 J 매립지, T 매립지 각각 47.6%, 32.5%이었고, 유사종이 확인되지 않는 DNA sequence를 고려한 난배양성 미생물은 각각 78%, 95%로 확인되었다. 배양성 미생물 중에는 두 매립지 모두 Proteobacteria phylum이 가장 많이 분포하는 것으로 나타났다.
- 2) Real-Time PCR을 이용한 탈질 미생물의 정량 결과 nirS gene과 cnorB gene 모두 T 매립지보다 J 매립지에 각각 7배, 4배 정도 많이 분포하고 있는 것으로 나타났다. 이러한 결과는 암모니아성 질소의 농도가 높은 J 매립지에서 질산화가 일어남과 동시에 탈질이 활발하게 일어나고 있음을 보여준다.
- 3) Real-Time PCR을 이용한 메탄 생성 미생물의 정량 결과 매립지 내부인 J1 지점에서 1, 310, 000 copies/uL로 가장 높게 나타났으며, 지하수 흐름 방향으로 침출수가 이동함에 따라 개체수가 급격히 감소하였다. 이러한 결과는 매립지에서 유출된 침줄수가 지하수를 따라 이동하면서 자연포기가 발생하여 메탄 생성 미생물이 성장할 수 있는 조건인 혐기성 조건에서 호기성 조건으로 점진적으로 변함과 동시에 영양원이 감소하였기 때문인 것으로 사료된다.
- 3) 이러한 불량매립지에서 발생된 침출수는 별다른 처리없이 지하수, 하천 및 호소 등으로 유출되어 심각한 수질오염 및 토양오염을 지속적으로 유발하고 있다.
- 4) Competitive PCR과 Real-Time PCR 방법을 통한 미생물 정량 결과 competitive PCR은 침출수에서 채취한 genomic DNA의 경우 수많은 종의 DNA가 혼합되어 있어서 경쟁반응에 의한 PCR 증폭이 잘 이루어지지 않아 정확한 정량이 이루어지지 않았다. 반면에 Real-Time PCR은 형광 dye에 의한 증폭 산물의 실시간 측정으로 적은 양의 DNA도 정량이 가능하였다.
- 8480의 상관성을 보였다. Fig. 10에 나타난 바와 같이 MCR gene의 개체수는 CT과 R 제곱값이 0.9936으로 가장 높은 상관성을 보였고, NCb-N, NH3-N, TOC, alkalinity 순서로 R 제곱값이 각각 0.9767, 0.9640, 0.9257, 0.9244으로 나타났다. 그러나 nirS gene, cnorB gene 및 MCR gene 모두 NO-N와는 높은 상관성을 보이지 않았다.
- 8444의 값을 나타냈다. Fig. 9에 나타난 바와 같이 cnorB gene의 개체수는 TOC와 R 제곱값이 0.9770으로 가장 높은 상관성을 보였고, alkalinity, NH3-N, CT의 순서로 R 제곱값이 각각 0.9706, 0.9665, 0.9347으로 나타났다. cnorB gene 역시 NO2-N와는 상대적으로 낮은 0.
- 7에 나타난 바와 같이 J 매립지의 경우 JI, J2, J3 및 J4 지점의 침출수에서 MCR gene이 확인되었고, T 매립지의 경우 T1 과 T2 지점의 침출수에서만 확인되었다. J 매립지에서 J1 지점에서는 1,310,000 copies/^L로 가장 높게 측정 되었지만, J2, J3, J4 지점에서는 각각 101,000 copies/uL, 21,500 copies/uL, 14, 200 copies/^L로 급격하게 감소되는 것을 확인하였다. 또한 T1 과 T2 지점에서는 각각 5,410 copies/uL, 7,280 copies/pL로 J 매립지에 비해 약 1/20~1/2배 정도 적게 분포하는 것으로 나타났다.
- 분석하였다. J 매립지의 경우 cloning한 DNA 중 sequence가 분석된 것을 BLAST search한 결과 47.6%가 근연종을 확인할 수 있었고, 그 중 53.1%는 난배양성 미생물, 46.9%는 배양성 미생물로 확인되었다. 배양성 미생물 중 Proteobacteria phylum이 53.
- 혼합하여 PCR 반응을 수행하였다. PCR 결과 시료에서 추출된 genomic DNA 내에는 다양한 종류의 DNA가 혼합되어 있어서, competitor DNA와 비교하여 nirS gene을 정량하는 것이 불가능하였다. 그 원인을 분석하기 위하여 Com petitor DNA를 10배, 100배, 1000배 희석해서 PCR 반응시킨 결과 target DNA가 증폭되지 않음을 확인하였다.
- 1%로 가장 많이 분포하였고, Aminobacteria, Flavobacteria, Lactobacillales 등이 분포하는 것으로 확인되었다. T 매립지의 경우 cloning한 DNA 증 sequence가 분석된 것을 BLAST search한 결과 32.5%가 근연종을 확인할 수 있었고, 그 중 85.2%는 난배양성 미생물, 14.8%는 배양성 미생물로 확인되었다. 또한 J 매립지와 마찬가지로 배양성 미생물 중 Proteobacteria phylum이 22.
- 5, 6에 나타난 바와 같이 J 매립지와 T 매립지를 비교해 봤을 때 nirS gene은 각각 평균 192, 800 copies/uL, 26, 99 copies/^iL로 J 매립지에 약 7배 정도 많이 분포하고 있는 것으로 나타났다. cnorB gene은 J 매립지와 T 매립지를 비교해 봤을 때 각각 평균 1,596 copies/|iL, 371 copies/uL로 J 매립지에 약 4배 정도 많이 분포하고 있는 것으로 나타났다. 두 매립지의 nirS gene과 cnorB gene의 분포 경향을 살펴보면 전체적으로 nirS gene이 cnorB gene에 비해 약 100배 정도 많이 분포하고 있는 것으로 나타났다.
- 이러한 결과는 Real-Time PCR법을 통한 정량결과에서 "irS gene이 cnorB gene에 비해 약 7배 정도 많이 검출된 결과에 의하여 설명될 수 있다. 결과적으로 competitive PCR 정량 결과는 Real-Time PCR 정량 결과에 비해 상대적으로 작은 양이 측정되었다. 이는 competitive PCR법의 경우에는 겔 상에 나타난 DNA 밴드의 단순 비교 분석에 의한 정량법이므로 Real-Time PCR의 경우보다 객관성과 신뢰성이 결여된다고 할 수 있다.
- PCR 결과 시료에서 추출된 genomic DNA 내에는 다양한 종류의 DNA가 혼합되어 있어서, competitor DNA와 비교하여 nirS gene을 정량하는 것이 불가능하였다. 그 원인을 분석하기 위하여 Com petitor DNA를 10배, 100배, 1000배 희석해서 PCR 반응시킨 결과 target DNA가 증폭되지 않음을 확인하였다. 따라서 다시 competitor DNA의 희석 배율을 각각 10, 배, 5*10 5배, 배, 5*106배, io, 배로 증가시켜 PCR 반응을 수행한 결과 Fig.
- cnorB gene은 J 매립지와 T 매립지를 비교해 봤을 때 각각 평균 1,596 copies/|iL, 371 copies/uL로 J 매립지에 약 4배 정도 많이 분포하고 있는 것으로 나타났다. 두 매립지의 nirS gene과 cnorB gene의 분포 경향을 살펴보면 전체적으로 nirS gene이 cnorB gene에 비해 약 100배 정도 많이 분포하고 있는 것으로 나타났다. 이러한 결과는 cnorB gene이 관여하는 NO에서 NQ로 환원되는 과정보다 nirS gene에 의한 NR에서 N?로의 전환이 급속하게 발생하고 있음을 알 수 있다.
- 즉, 매립지와 같은 자연환경에는 기존의 순수배양을 통해서는 확인할 수 없었던 난배양성 미생물이 더욱 많이 분포하고 있음을 확인하였다. 또한 BLAST search 결과에서 약 59% 정도는 근연종을 확인할 수 없었는데, 이것은 기존에 동정되지 않은 난배양성의 새로운 미생물 종일 가능성이 높다고 사료된다. 이러한 결과를 토대로 전체적으로 J 매립지와 T 매립지에는 각각 78%, 95%의 난 배양성 미생물이 분포하고 있다고 사료된다.
- 8%는 배양성 미생물로 확인되었다. 또한 J 매립지와 마찬가지로 배양성 미생물 중 Proteobacteria phylum이 22.2%로 가장 많이 분포하였고, Actinobacteria, Flavobacteria 등이 분포하는 것으로 확인되었다. 즉, 매립지와 같은 자연환경에는 기존의 순수배양을 통해서는 확인할 수 없었던 난배양성 미생물이 더욱 많이 분포하고 있음을 확인하였다.
- 이러한 결과는 지질 구조가 점토 성분으로 이루어진 J 매립지에 비해 T 매립지는 모래 성분으로 이루어져 있어 지질 구조가 불균질하고 통기성이 좋아 탈질 및 메탄 생성균이 존재하기에는 부적합한 환경이기 때문이라고 사료된다. 또한 두 매립지의 사용종료 후 경과기간을 비교해 봤을 때 J 매립지, T 매립지 각각 7년, 13년으로 T 매립지는 안정화가 이미 진행된 상태로 본 연구대상 미생물의 개체수가 적게 분포하고 있는 것으로 사료된다.
- 11, 12, 13에 나타난 바와 같이 J 매립지에 비해 nirS gene, cnorB gene 및 MCR gene의 개체수가 약 1/20~1/10배 적게 분포하고 있는 것으로 나타났다. 또한 수질 인자와의 상관관계 분석에서도 뚜렷한 상관성을 보이지 않았다. 이러한 결과는 지질 구조가 점토 성분으로 이루어진 J 매립지에 비해 T 매립지는 모래 성분으로 이루어져 있어 지질 구조가 불균질하고 통기성이 좋아 탈질 및 메탄 생성균이 존재하기에는 부적합한 환경이기 때문이라고 사료된다.
- 매립지에서 채취된 침출수를 원심분리하여 얻은 농축 고형물에서 FastDNA® SPIN kit(Biol01 system, Q-Bio gene)를 사용하여 bead beating의 강도를 speed 5.5에서 실시한 결과 추출된 genomic DNA가 많이 손상되었다. 재 실험에서 bead beating의 강도를 speed 4로 낮추어 추출한 결과, 보다 순도가 높은 genomic DNA를 추출해낼 수 있었다.
- 먼저 J 매립지의 경우 Fig. 8에 나타난 바와 같이 nirS gene의 개체수는 NH3-N와 R 제곱값이 0.9267로 가장 높았고, CT, alkalinity, TOC 순서로 R 제곱값이 각각 0.9262, 0.9207, 0.9146을 나타냈다. 그러나 NCh-N와는 상대적으로 낮은 0.
- 9%는 배양성 미생물로 확인되었다. 배양성 미생물 중 Proteobacteria phylum이 53.1%로 가장 많이 분포하였고, Aminobacteria, Flavobacteria, Lactobacillales 등이 분포하는 것으로 확인되었다. T 매립지의 경우 cloning한 DNA 증 sequence가 분석된 것을 BLAST search한 결과 32.
- 5%이었고, 유사종이 확인되지 않는 DNA sequence를 고려한 난배양성 미생물은 각각 78%, 95%로 확인되었다. 배양성 미생물 중에는 두 매립지 모두 Proteobacteria phylum이 가장 많이 분포하는 것으로 나타났다.
- 또한 BLAST search 결과에서 약 59% 정도는 근연종을 확인할 수 없었는데, 이것은 기존에 동정되지 않은 난배양성의 새로운 미생물 종일 가능성이 높다고 사료된다. 이러한 결과를 토대로 전체적으로 J 매립지와 T 매립지에는 각각 78%, 95%의 난 배양성 미생물이 분포하고 있다고 사료된다.
- 5에서 실시한 결과 추출된 genomic DNA가 많이 손상되었다. 재 실험에서 bead beating의 강도를 speed 4로 낮추어 추출한 결과, 보다 순도가 높은 genomic DNA를 추출해낼 수 있었다. 추출된 genomic DNA를 전기영동 겔 상에서 확인한 결과를 Fig.
- 또한 T1 과 T2 지점에서는 각각 5,410 copies/uL, 7,280 copies/pL로 J 매립지에 비해 약 1/20~1/2배 정도 적게 분포하는 것으로 나타났다. 전체적으로 매립지의 경계영역를 기준으로 지하수 흐름 방향으로 내려감에 따라 메탄생성 미생물의 개체수가 급격히 감소하는 것을 확인하였다.
- 2%로 가장 많이 분포하였고, Actinobacteria, Flavobacteria 등이 분포하는 것으로 확인되었다. 즉, 매립지와 같은 자연환경에는 기존의 순수배양을 통해서는 확인할 수 없었던 난배양성 미생물이 더욱 많이 분포하고 있음을 확인하였다. 또한 BLAST search 결과에서 약 59% 정도는 근연종을 확인할 수 없었는데, 이것은 기존에 동정되지 않은 난배양성의 새로운 미생물 종일 가능성이 높다고 사료된다.
후속연구
- 5) 환경에서 자연정화의 주체가 미생물임을 고려하고 오염물의 농도에 따른 미생물 분포의 상관관계를 확인해 본 결과, 매립지 침출수에 의한 주변 지역의 오염 정도의 확인 및 매립지의 안정화 평가로써 분자생물학 기술을 이용한 미생물 지표의 사용이 가능할 것으로 사료된다.
- 반면에 Real-Time PCR은 형광 dye에 의한 증폭 산물의 실시간 측정으로 적은 양의 DNA도 정량이 가능하였다. 그러므로 환경시료와 같은 혼합 DNA/일 경우 Real-Time PCR에 의한 정량이 더욱 신뢰성이 높은 결과를 얻을 수 있을 것으로 사료된다.
- 이러한 결과는 Real-Time PCR을 이용한 특이적 유전자에 대한 정량 실험에서도 유전자에 따라 신뢰성이 결여된 실험결과를 얻을 수 있음을 나타낸다. 따라서 Real-Time PCR을 이용하여 nosZ gene 의 보다 더 정확한 정량을 위해서는 보다 더 특이적인 primer의 제작이 필요할 것으로 사료된다.
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