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문제 정의
- 적용하여 분해 특성을 관찰하였다. 그리고 시간 경과에 따라 BTEX가 분해 됨과 동시에, BTEX 분해가 토양내 존재하는 기타 미생물에 의한 분해가 아닌, 실제로 동정 분리된 미생물에 의한 분해를 확인하기 위하여 시간 변화에 따른 토양 시료 내의 미생물 종 변화도 함께 관찰하였다.
- 따라서 본 논문에서는 지금까지 BTEX로 오염된 하천 저질에서 분리한 미생물들에 대한 다양한 분해 특성 및 효율 향상과 관련된 회분식 실험 결과*를 바탕으로 오염된 토양에 실제 적용하여 분해 특성을 관찰하였다. 그리고 시간 경과에 따라 BTEX가 분해 됨과 동시에, BTEX 분해가 토양내 존재하는 기타 미생물에 의한 분해가 아닌, 실제로 동정 분리된 미생물에 의한 분해를 확인하기 위하여 시간 변화에 따른 토양 시료 내의 미생물 종 변화도 함께 관찰하였다.
- 본 연구에서는 유류로 오염된 하천저질로부터 benzene, toluene, ethylbenzene, o-xylene을 탄소원으로 NCh-를 전자수용체로 이용하는 미생물을 순수 분리하여 BTEX로 오염시킨 토양에 적용 가능성을 검토하였고 토양 내 토착 미생물과의 상호관계에 의한 미생물 군집 변화를 관찰하였다. 미생물 주입 시, 분해 효율 향상을 위하여 동정 분리한 미생물을 혼합하여 주입하였으며 혼합 비율은 Pseudomonas stutzeri strain 15(DQ 202712): Klebsiella sp.
제안 방법
- primer 341F GC, 534R(Table 1)9)은 약 200 bp 의 16S rRNA의 V3 부위를 증폭하는 PCR에 이용된다.'" PCR 반응물의 조성은 10xbuffer(20 mM Tris-HCl, 100 mMKC1, 0.1 mM EDTA, 1 mM DTT, 0.5% Tween 20, 0.5% Nonidet P-40, 50% Glycerol), 25 mM MgCb, 2.5 mM dNTP Mixture, 20 pmole primer이며, DNA template와 Ex Taq™ polymerase(TAKARA-Korea Biomedicals Inc.)를 첨가하여 총 50 μL의 혼합물을 준비한 후 PCR을 수행하였다. PCR 반응조건은 touch down PCR 방법으로 Fig.
- 16S rDNA의 V3 부위를 증폭하기 위하여 앞에서 언급한 PCR 산물(증폭된 16S rDNA)을 주형으로 nested PCR을 수행하였다. primer 341F GC, 534R(Table 1)9)은 약 200 bp 의 16S rRNA의 V3 부위를 증폭하는 PCR에 이용된다.
- 2) BTEX가 분해됨에 따라 주입한 미생물과 토양 내 토착 미생물과의 상관성 그리고 시간에 따른 미생물 군집의 변화를 관찰하기 위하여 PCR-DGGE를 통하여 미생물 군집구조 분석을 실시하였다. 그 결과 토양에서 토양 내 존재하는 미생물들에 의해 다양한 band가 관찰되었다.
- 영동한 후 겔을 10 mg/mL 농도의 ethidium bromide로 30분간 염색하고, 10분간 초순수에 담그어 destaining 하였다. Gel Documen tation System(Gel Doc 2000, BIO-RAD)으로 band를 분석하였다.
- 1에 나타내었다. PCR 산물은 1% agarose gel 에서 전기 영동하여 확인하였다.
- 추출한 DNA로부터 계통분류학적으로 고유한 특성을 가진 16S rDNA를 증폭하기 위하여 primer 27F와 1492R을 사용9,10)하여 PCR을 수행하였다(Table 1). PCR(Polymerase chain reaction) 반응물의 조성은 10xbuffer(20 mM Tris-HCl, 100 mM KC1, 0.1 mM EDTA, 1 mM DTT, 0.5% Tween 20, 0.5% Nonidet P-40, 50% Glycerol), 25 mM MgCh, 2.5 mM dNTP Mixture, 20 pmole primer이며, DNA template 와 Ex Taq™ polymerase(TAKARA-Korea Biomedicals Inc.)를 첨가하여 총 50 μL의 혼합물을 준비한 후 수행하였다. PCR 조건은 Fig.
- UltraClean™ soil DNA kit(MO BIO. Laboratories, Inc.) 를 사용하여 토양내에 존재하는 미생물의 DNA를 추출하였다. 추출한 DNA로부터 계통분류학적으로 고유한 특성을 가진 16S rDNA를 증폭하기 위하여 primer 27F와 1492R을 사용9,10)하여 PCR을 수행하였다(Table 1).
- 미생물 주입 후, 토양에서의 미생물의 개체군 변화 양상을 알아보기 위한 분자생물학적인 실험인 DGGE 분석 수행 후, Fig. 7에서 관찰된 bands에 대하여 DNA sequencing을 행하였다. 이중 7개의 DNA sequencing 결과를 획득할 수 있었으며, Genbank의 BLAST search database# 이용하여 16S tDNA의 sequence를 alignment한 결과 a, b, c, d, e, f bands에 대한 6 종의 균종을 확인 할 수 있었고 이를 Table 2 에 나타내었다.
- 분석하였다. 배양 시작 후 BTEX가 토양과 head space에서 평형을 이루었다고 판단된 48시간 후 메디아 병의 head space gas를 500 gL gas-tight syringe로 300(1L를 채취하였으며, 토양에 존재하는 BTEX의 농도를 측정하기 위하여 주입한 토양 100 g에 메틸알콜 100 mL과 무수황산나트륨을 적당량 첨가한 후 충분히 흔들어 정치 시켰다. 상등액을 0.
- 본 실험에서는 같은 조건의 시료를 15개씩 준비하여 시간에 따른 head space 및 토양내의 BTEX 농도 측정 후 폐기처리 하였다. 전자 수용체로 KNO3를 23.
- , BIO RAD). 상부 30%, 하부 60% denaturing gradient를 만들기 위해 Formamide와 Urea의 양을 조절하였다. 30% denaturing 용액은 40% Acrylamide/Bis 25 mL, 50><TAE 완충액(2 M Tris base, 1 M acetic acid, 50 mM EDTA) 2 mL, For- mamide(deionized) 12 mL, Urea 12.
- 주입구(Injector) 와 검출기(Flame Ionization Detector)의 온도는 각각 250℃, 300℃ 이었고 운반가스(carrier gas)로는 He gas를 사용하여 분해하였다. 시간 경과에 따른 분해 효율 및 미생물 변화를 관찰하기 위하여 시간대별로 각각의 시료를 준비하였고 측정 후, 해당 시료는 폐기하였다. 이를 통하여 시간대별 시료 채취 과정에서 발생할 수 있는 오차를 최소화하였다.
- 시료내에 존재하는 BTEX의 농도변화를 토양과 기상에서 주기적으로 분석하였다. 배양 시작 후 BTEX가 토양과 head space에서 평형을 이루었다고 판단된 48시간 후 메디아 병의 head space gas를 500 gL gas-tight syringe로 300(1L를 채취하였으며, 토양에 존재하는 BTEX의 농도를 측정하기 위하여 주입한 토양 100 g에 메틸알콜 100 mL과 무수황산나트륨을 적당량 첨가한 후 충분히 흔들어 정치 시켰다.
- 영동장치(DCocgM system, BIO-RAD)에서 미리 60℃로 가열된 1×TAE buffer에 굳은 perpendicular gradient gel을 장치하고, Power supply(Power Pac, BIO-RAD)를 사용해 60 V로 16시간 동안 수직 DGGE를 수행하였다. 영동한 후 겔을 10 mg/mL 농도의 ethidium bromide로 30분간 염색하고, 10분간 초순수에 담그어 destaining 하였다.
- 2 μL를 syringe로 주입한 후 30℃ 에서 배양하였다. 이때 각 병은 테프론으로 코팅된 마개를 사용하여 BTEX의 휘발 손실정도를 최소화 하였다.
- 02 mm) 컬럼이 장착된 gas chromatograph(GC-2010, Shi- madzu, Japan)을 이용하였고, 검출기는 불꽃이온화 검출기 FID(Flame Ionization Detector)를 사용하였다. 주입구(Injector) 와 검출기(Flame Ionization Detector)의 온도는 각각 250℃, 300℃ 이었고 운반가스(carrier gas)로는 He gas를 사용하여 분해하였다. 시간 경과에 따른 분해 효율 및 미생물 변화를 관찰하기 위하여 시간대별로 각각의 시료를 준비하였고 측정 후, 해당 시료는 폐기하였다.
- ) 를 사용하여 토양내에 존재하는 미생물의 DNA를 추출하였다. 추출한 DNA로부터 계통분류학적으로 고유한 특성을 가진 16S rDNA를 증폭하기 위하여 primer 27F와 1492R을 사용9,10)하여 PCR을 수행하였다(Table 1). PCR(Polymerase chain reaction) 반응물의 조성은 10xbuffer(20 mM Tris-HCl, 100 mM KC1, 0.
- 토양 시료를 대상으로 BTEX 생분해 특성을 알아보기 위하여 250 mL 갈색 메디아 병에 토양시료를 각각 100 g 씩 주입하였다. 4종의 시료를 각 샘플 당 15개씩 준비하였으며 시료 각각의 특징은 다음과 같다.
- 7에 나타내었다. 토양만의 시료(A), 토양에 동정 분리한 미생물을 주입한 시료(B), 토양에 동정분리 미생물과 BTEX를 주입한 시료(C, D), 토양에 동정분리한 미생물과 nitrate를 주입한 시료(E, F)에 대하여, 10일 후 20일 후 총 2회 시료를 채취하여 추출한 geno mic DNA에서 16S rDNA 중폭을 통해 획득한 200 bp의 PCR 산물을 DGGE에 적용한 결과 각 시료에서 서로 다른 다양한 band 특성을 관찰할 수 있었다. 각각의 시료에 대한 DGGE 결과에서 공통적으로 4개의 high intensity band를 관찰할 수 있었다.
- 토양에서 BTEX 분해에 따른 토양 시료에 인위적으로 주입한 동정 분리 미생물의 군집 변화 양상을 알아보기 위해 PCR-DGGE 분석을 수행하여 그 결과를 Fig. 7에 나타내었다. 토양만의 시료(A), 토양에 동정 분리한 미생물을 주입한 시료(B), 토양에 동정분리 미생물과 BTEX를 주입한 시료(C, D), 토양에 동정분리한 미생물과 nitrate를 주입한 시료(E, F)에 대하여, 10일 후 20일 후 총 2회 시료를 채취하여 추출한 geno mic DNA에서 16S rDNA 중폭을 통해 획득한 200 bp의 PCR 산물을 DGGE에 적용한 결과 각 시료에서 서로 다른 다양한 band 특성을 관찰할 수 있었다.
대상 데이터
- 상부 30%, 하부 60% denaturing gradient를 만들기 위해 Formamide와 Urea의 양을 조절하였다. 30% denaturing 용액은 40% Acrylamide/Bis 25 mL, 50><TAE 완충액(2 M Tris base, 1 M acetic acid, 50 mM EDTA) 2 mL, For- mamide(deionized) 12 mL, Urea 12.6 g에 로 100 mL 을 채워 사용하였고 60% denaturing 용액은 40% Acrylamide/ Bis 25 mL, 50xTAE 완충액(2 M Tris base, 1 M acetic acid, 50 mM EDTA) 2 mL, Formamide(deionized) 24 mL, Urea 25.2 g에 dH2O로 100 mL을 채워 사용하였다.9) Denaturing 용액을 perpendicular gradient gel sandwich에 변성제 농도를 직선 기울기가 되도록 만든 다음 3시간 정도 굳혔다.
- 4종의 시료를 각 샘플 당 15개씩 준비하였으며 시료 각각의 특징은 다음과 같다.
- 2% agarose gel에서 전기 영동하여 확인하였다. DGGE는 200-400 base pair를 분리할 수 있는 8% gel을 사용하였다(DCode Electrophoresis Reagent Kit., BIO RAD). 상부 30%, 하부 60% denaturing gradient를 만들기 위해 Formamide와 Urea의 양을 조절하였다.
- 실험에 사용된 토양 시료는 KIST 주변의 BTEX로 오염되지 않은 것으로 추측되는 지역에서 채취하였다. 토양 시료를 채취하여 실험실로 옮겨 바로 풍건시켰으며, 토양 시료는 표준 망체(No.
- 토양 시료를 채취하여 실험실로 옮겨 바로 풍건시켰으며, 토양 시료는 표준 망체(No. 16)를 사용하여 직경 1.18 mm 이하로 균일화하여 사용하였다. 준비된 토양 시료의 pH는 5.
이론/모형
- 45 pm syringe filter로 filtering 한 후 2 mL GC vial 에 넣어 준비하였다. 농도 분석은 DB-l(30 m x 0.32 mm x 0.02 mm) 컬럼이 장착된 gas chromatograph(GC-2010, Shi- madzu, Japan)을 이용하였고, 검출기는 불꽃이온화 검출기 FID(Flame Ionization Detector)를 사용하였다. 주입구(Injector) 와 검출기(Flame Ionization Detector)의 온도는 각각 250℃, 300℃ 이었고 운반가스(carrier gas)로는 He gas를 사용하여 분해하였다.
- strain A(DQ 202713) = 2 : 1 : 1의 비율로 주입하였다. 혼합 비율은 Chung8, 등의 연구 결과에서 최적 혼합 비율로 2 : 1 : 1로 보고하고 있어 그 비율을 그대로 적용하였다. 각 병에 benzene 22.
성능/효과
- 1) 동정 분리한 미생물과 함께 nitrate를 주입시킨 sample 에서 기타 시료에 비하여 가장 높은 분해율이 관찰되었으며 토양 내 토착 미생물에 의한 분해율은 이 보다 물질에 따라 benzene에서 최소 40%, ethyl-benzene과 o-xylene에서 최대 60%의 낮은 결과를 관찰할 수 있었다.
- 3) 순수 분리한 혼합 미생물과 전자 수용체로 nitrate를 첨가시킨 BTEX 제거율이 가장 우수했던 sample의 경우 Fig. 7에 나타난 band e에 대한 DNA sequence alignment한 결과, Pseudomonas stzUzeri 와 99%의 상동성을 가지는 것으로 나타났으며 이는 동정 분리하여 주입한 미생물과 동일한 종으로 PCR-DGGE 분석 결과에서도 해당 band의 intensity가 가장 높게 나타났음을 알 수 있었다. Band b의 위치에서 Citrobacter freundii 종이 관찰되 었으나 이는 실험 초기 주입된 동정 분리된 Citrobacter sp와는 약간의 차이를 나타내었다.
- 그 결과 토양에서 토양 내 존재하는 미생물들에 의해 다양한 band가 관찰되었다. BTEX와 nitrate 가 주입됨에 따라 토양 내 존재하는 다양한 미생물 종의 band intensity/} 감소되며 특정 미생물 종의 밴드 intensity/} 증가됨을 관찰할 수 있었다.
- DGGE 결과에서 특징적인 현상은 A 시료에서는 토양 내 존재하는 다양한 미생물들로부터 유래한 다양한 band가 관찰되었고 시료 B의 경우에는 주입된 3종의 미생물 존재 가능성을 확인할 수 있는 A시료에서는 관찰되지 않은 3개의 밴드가 b, e, f의 위치에서 관찰되었다. 그리고 BTEX가 주입되고 또 BTEX와 전자 수용체인 nitrate가 주입됨에 따라 b 와 e 위치의 band에서 높은 intensity를 나타내는 DGGE 결과가 관찰되었다.
- 주입된 동정 분리 미생물 종 가운데 Pseudomonas stutzeri 만이 band e의 위치에서 관찰되었다. b위치의 band에서 Citro bacter 종의 DNA sequencing 결과가 관찰되었으나 본 연구팀에 동정 분리된 미생물과는 약간의 차이가 있었다. 또한 Klebsiella 종의 경우는 band가 전혀 관찰되지 않았다.
- b, e, f의 위치에서 관찰되었다. 그리고 BTEX가 주입되고 또 BTEX와 전자 수용체인 nitrate가 주입됨에 따라 b 와 e 위치의 band에서 높은 intensity를 나타내는 DGGE 결과가 관찰되었다.
- 이 결과로부터 BTEX 의 토양에 대한 흡착이 발생되기는 하나 그 양은 그다지 크지 않은 것을 추정할 수 있다. 동정 분리된 미생물에 의한 분해 효율 관찰을 위한 시료(시료 ③)와 토양 내 indigenous microorganism에 의한 분해 효율 관찰을 위한 시료(시료 ②) 의 경우 모두 20일 경과 후, 최종적으로 65%와 60%의 제거율이 관찰되었다. 이로부터 동정 분리된 미생물과 토양 내 존재하는 indigenous microorganism의 경우 모두 벤젠을 효과적으로 분해하는 미생물 종임을 추정할 수 있었다.
- 또한 Fig. 7의 DGGE 결과에서 band f는 Pseudomonas 종으로 나타났으며 최종적으로 C, D, E, F에서는 관찰되지 않았다. 이로부터 본 실험에서 사용된 동정 분리한 Pseudomonas stutzeri strain 15(DQ 202712)는 BTEX를 탄소원으로 이용하여 BTEX제거에 효과적임을 알 수 있었다.
- 특히 토양에서는 전자 수용체의 유 . 무에 따라 약 30%의 차가 관찰되었고 토양 내 토착 미생물과는 약 50%의 차이를 관찰관찰할 수 있었다. 토착 미생물에 의한 분해는 벤젠의 경우 약 60%, 톨루엔의 경우 약 30%의 분해율이 관찰되었지만, 에틸벤젠, 자이렌의 경우, 토착 미생물에 의한 분해는 거의 관찰되지 않았다.
- 이로부터 BTEX 오염 저질로부터 동정 분리한 미생물 3 종을 BTEX로 오염된 토양에 전자수용체와 함께 주입함으로써 토양 내 존재하는 토착 미생물보다 효율적으로 BTEX를분해할 수 있었으며 20일의 실험 기간 동안에는 주입한 미생물 3종 가운데 Pseudomonas stMtzeri이 우점화되어 BTEX 분해 효율이 향상되는 것으로 판단된다.
- 동정 분리된 미생물에 의한 분해 효율 관찰을 위한 시료(시료 ③)와 토양 내 indigenous microorganism에 의한 분해 효율 관찰을 위한 시료(시료 ②) 의 경우 모두 20일 경과 후, 최종적으로 65%와 60%의 제거율이 관찰되었다. 이로부터 동정 분리된 미생물과 토양 내 존재하는 indigenous microorganism의 경우 모두 벤젠을 효과적으로 분해하는 미생물 종임을 추정할 수 있었다. 그러나 전자 수용체 유 .
- 7의 DGGE 결과에서 band f는 Pseudomonas 종으로 나타났으며 최종적으로 C, D, E, F에서는 관찰되지 않았다. 이로부터 본 실험에서 사용된 동정 분리한 Pseudomonas stutzeri strain 15(DQ 202712)는 BTEX를 탄소원으로 이용하여 BTEX제거에 효과적임을 알 수 있었다.
- 7 의B를 보면 주입한 3종의 미생물이 모두 관찰되지는 않았다. 주입된 동정 분리 미생물 종 가운데 Pseudomonas stutzeri 만이 band e의 위치에서 관찰되었다. b위치의 band에서 Citro bacter 종의 DNA sequencing 결과가 관찰되었으나 본 연구팀에 동정 분리된 미생물과는 약간의 차이가 있었다.
- 6의 o-xylene의 경우 분해효율이 물질별로 약간의 차이는 발견되었지만 모두 벤젠과 유사한 경향을 관찰할 수 있었다. 즉, 각각 물질의 토양 자체에 대한 흡착은 약 10%로 낮은 결과가 관찰되었으며, 토착 미생물에 의한 분해, 동정 분리된 미생물에 의한 분해 그리고 전자 수용체가 존재하는 상태에서의 동정 분리된 미생물에 의한 분해 순으로 분해 효율이 관찰되었다.
후속연구
- 이상의 결과로부터 에틸벤젠과 자일렌과 같이 생물분해가 어려운 물질의 경우, 해당 물질 분해 가능한 미생물을 동정 분리하여 사용한다면 기존의 생물학적 처리 방법 보다 고효율의 처리가 가능할 것으로 판단된다.
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