활엽수림과 침엽수림 산림토양의 각 층위로부터 1년간 총 32개 토양시료를 채취하여 pH, 수분함량, 탄질률을 조사한 결과, 산림토양의 각 층위는 생태학적으로 매우 다양한 서식공간임이 확인되었다. 산림토양 내 분포하는 다양한 세균군집의 정량적 평가를 위하여 통상농도의 NB배지와 NB배지를 10-2로 희석한 DNB배지에서 세균수를 측정한 결과, DNB배지에서 계수된 세균수가 NB배지에서 계수된 세균수 보다 2 ~ 20배 이상 높은 계수치를 나타내었다. 이와 같은 결과로부터 산림토양 내에는 통상농도의 영양배지에서 심한 생육저해를 받는 저영양세균이 다수 존재함이라 판단되었다. 산림토양 시료를 NB배지와 DNB배지를 이용하여 28℃에서 1200시간동안 배양하면서 평판배지상에 형성된 ...
활엽수림과 침엽수림 산림토양의 각 층위로부터 1년간 총 32개 토양시료를 채취하여 pH, 수분함량, 탄질률을 조사한 결과, 산림토양의 각 층위는 생태학적으로 매우 다양한 서식공간임이 확인되었다. 산림토양 내 분포하는 다양한 세균군집의 정량적 평가를 위하여 통상농도의 NB배지와 NB배지를 10-2로 희석한 DNB배지에서 세균수를 측정한 결과, DNB배지에서 계수된 세균수가 NB배지에서 계수된 세균수 보다 2 ~ 20배 이상 높은 계수치를 나타내었다. 이와 같은 결과로부터 산림토양 내에는 통상농도의 영양배지에서 심한 생육저해를 받는 저영양세균이 다수 존재함이라 판단되었다. 산림토양 시료를 NB배지와 DNB배지를 이용하여 28℃에서 1200시간동안 배양하면서 평판배지상에 형성된 콜로니를 정기적으로 계수하였다. NB배지에서는 배양 7일 이내에 세균수가 최고치를 나타낸 반면, DNB배지에서는 배양시간이 증가함에 따라 콜로니수가 계속 증가하면서 3개 이상의 콜로니형성곡선(colony forming curve; CFC)을 형성하는 특징을 나타내었다. 즉, 배양 96~216시간이내에 빠른 속도로 형성된 콜로니 형성곡선(CFC-I), 216~480시간이내에 형성된 콜로니 형성곡선(CFC-II) 그리고 480시간 이후에 더딘 속도로 형성된 콜로니 형성곡선(CFC-III)로 구분되었다. 콜로니 형성곡선(CFC)에 따라 CFC-Ⅰ기로부터 459균주, CFC-Ⅱ기로부터 401균주 그리고 CFC-Ⅲ기로부터 363균주 총 1223균주를 확보하였다. 평판배지로부터 1차 분리된 균주를 대상으로 2차 계대배양하는 과정 중 생육능이 소실되어 순수분리에 실패한 균주가 다수 확인되었다. 이와 같이 실험실 배양과정 중 1차 분리는 성공적으로 이루어졌으나 계대배양 과정 중 생육능이 소실되는 균주에 대하여 "일시적배양균 (temporarily culturable bacteria)"으로 정의하였다. 각 평판배지로부터 분리된 토양세균 중 일시적배양균으로 총 73 균주를 확보하였다. 산림토양의 각 층위로부터 확보된 일시적배양균 49균주에 대해 계통학적 특성을 검토한 결과 α- β- γ-Proteobacteria, Actinobacteria, Acidobacteria, Firmicutes의 6개의 다양한 계통군이 확인되었으며, 대부분의 균주가 미배양성 미동정균임이 확인되었다. 산림토양으로부터 분리된 세균 중 저영양배지에서 배양 1000시간이 경과한 후에 미세한 콜로니를 형성하는 이들 배양속도가 매우 더디고 저영양배지에서 증식가능한 토양세균을 『난배양성 저영양세균 (slow-growing oligotrophic bacteria)』로 정의하고, 18균주를 순수분리하였다. 난배양성 저영양세균으로 순수분리된 18균주 중에는 新科(6균주), 新屬(4균주), 新種(4균주)이 미기록종 신규미생물로 확보되었다. 저영양성 신규미생물로 제안할 수 있는 10균주의 분류․동정을 위해 주사형전자현미경을 이용한 형태관찰, API20NE kit를 이용한 생리학특성조사, 지방산, 퀴논분석을 통한 생화학적 특성, G+C함량, 16S rDNA 염기서열해석을 통한 계통학적 분석을 수행한 결과, α-proteobacteria에 속하는 L5, L8 L9, L70 균주는 Rhodospirillales 目의 新科로 제안되었고, L34균주는 Rhodospirillaceae 科의 新種으로, Bradyrhizobiaceae 科에 속하는 L55균주는 新屬으로 제안되었다. β-proteobacteria에 속하는 Burkholderia 屬에 속하는 L27균주는 신종으로 제안되었다. Actinobacteria에 속하는 L64균주는 Solirubrobacter 屬의 新種으로 제안되었다. 식물생육촉진능이 있는 저영양세균 To13균주는 Sphingomonas 屬의 新種으로 제안되었으며, To47균주는 Sphingomonadaceae 科의 新屬으로 제안되었다. 본 연구를 통하여 순수분리 및 동정된 상기의 저영양성 신규미생물의 배양배지 설계를 위하여 저영양세균의 생리학적 특성을 조사하였다. 저영양세균의 대표적인 생리학적 특성으로는 통상농도의 NB배지에서 심한 증식저해를 받는 것으로, NB배지의 주요 성분인 아미노산에 대한 저영양세균의 감수성을 평가하기 위해 통상농도의 NB배지와 토양 내 아미노산의 정량․정성 분석을 수행하였다. 토양 내 아미노산 함량은 통상농도의 NB배지보다 200배~600배 낮은 함량을 나타내었다. 기초배지에 14종류의 아미노산을 첨가한 배지에 저영양세균을 각각 접종하고 증식능을 조사한 결과 1mM 농도 이상에서 증식 효과를 나타내는 아미노산으로 glutamic acid, leucine, threonine, proline, isoleucin이 선발되었다. 저영양세균 증식에 높은 증식효과 보인 glutamic acid, isoleucin아미노산을 기초배지에 1mM 농도로 첨가하여 토양세균수를 측정한 결과 DNB배지 보다 1.5 ~ 2배 이상 더 높은 계수치를 나타내었다. 이와 같은 결과를 바탕으로 저영양세균 증식에 높은 효과를 나타내는 glutamic acid를 1mM, 5mM, 10mM 농도로 각각 첨가한 배지에 저영양세균을 접종한 후 저영양세균의 증식능을 비교 검토한 결과 DNB배지보다 4배 이상의 높은 증식능을 나타냄을 확인 할 수 있었다. 본 연구를 통하여 바이오 산업에 이용 가능한 저영양세균의 대량배양 배지설계에 중요한 기초자료를 제공할 수 있으리라 기대된다.
활엽수림과 침엽수림 산림토양의 각 층위로부터 1년간 총 32개 토양시료를 채취하여 pH, 수분함량, 탄질률을 조사한 결과, 산림토양의 각 층위는 생태학적으로 매우 다양한 서식공간임이 확인되었다. 산림토양 내 분포하는 다양한 세균군집의 정량적 평가를 위하여 통상농도의 NB배지와 NB배지를 10-2로 희석한 DNB배지에서 세균수를 측정한 결과, DNB배지에서 계수된 세균수가 NB배지에서 계수된 세균수 보다 2 ~ 20배 이상 높은 계수치를 나타내었다. 이와 같은 결과로부터 산림토양 내에는 통상농도의 영양배지에서 심한 생육저해를 받는 저영양세균이 다수 존재함이라 판단되었다. 산림토양 시료를 NB배지와 DNB배지를 이용하여 28℃에서 1200시간동안 배양하면서 평판배지상에 형성된 콜로니를 정기적으로 계수하였다. NB배지에서는 배양 7일 이내에 세균수가 최고치를 나타낸 반면, DNB배지에서는 배양시간이 증가함에 따라 콜로니수가 계속 증가하면서 3개 이상의 콜로니형성곡선(colony forming curve; CFC)을 형성하는 특징을 나타내었다. 즉, 배양 96~216시간이내에 빠른 속도로 형성된 콜로니 형성곡선(CFC-I), 216~480시간이내에 형성된 콜로니 형성곡선(CFC-II) 그리고 480시간 이후에 더딘 속도로 형성된 콜로니 형성곡선(CFC-III)로 구분되었다. 콜로니 형성곡선(CFC)에 따라 CFC-Ⅰ기로부터 459균주, CFC-Ⅱ기로부터 401균주 그리고 CFC-Ⅲ기로부터 363균주 총 1223균주를 확보하였다. 평판배지로부터 1차 분리된 균주를 대상으로 2차 계대배양하는 과정 중 생육능이 소실되어 순수분리에 실패한 균주가 다수 확인되었다. 이와 같이 실험실 배양과정 중 1차 분리는 성공적으로 이루어졌으나 계대배양 과정 중 생육능이 소실되는 균주에 대하여 "일시적배양균 (temporarily culturable bacteria)"으로 정의하였다. 각 평판배지로부터 분리된 토양세균 중 일시적배양균으로 총 73 균주를 확보하였다. 산림토양의 각 층위로부터 확보된 일시적배양균 49균주에 대해 계통학적 특성을 검토한 결과 α- β- γ-Proteobacteria, Actinobacteria, Acidobacteria, Firmicutes의 6개의 다양한 계통군이 확인되었으며, 대부분의 균주가 미배양성 미동정균임이 확인되었다. 산림토양으로부터 분리된 세균 중 저영양배지에서 배양 1000시간이 경과한 후에 미세한 콜로니를 형성하는 이들 배양속도가 매우 더디고 저영양배지에서 증식가능한 토양세균을 『난배양성 저영양세균 (slow-growing oligotrophic bacteria)』로 정의하고, 18균주를 순수분리하였다. 난배양성 저영양세균으로 순수분리된 18균주 중에는 新科(6균주), 新屬(4균주), 新種(4균주)이 미기록종 신규미생물로 확보되었다. 저영양성 신규미생물로 제안할 수 있는 10균주의 분류․동정을 위해 주사형전자현미경을 이용한 형태관찰, API20NE kit를 이용한 생리학특성조사, 지방산, 퀴논분석을 통한 생화학적 특성, G+C함량, 16S rDNA 염기서열해석을 통한 계통학적 분석을 수행한 결과, α-proteobacteria에 속하는 L5, L8 L9, L70 균주는 Rhodospirillales 目의 新科로 제안되었고, L34균주는 Rhodospirillaceae 科의 新種으로, Bradyrhizobiaceae 科에 속하는 L55균주는 新屬으로 제안되었다. β-proteobacteria에 속하는 Burkholderia 屬에 속하는 L27균주는 신종으로 제안되었다. Actinobacteria에 속하는 L64균주는 Solirubrobacter 屬의 新種으로 제안되었다. 식물생육촉진능이 있는 저영양세균 To13균주는 Sphingomonas 屬의 新種으로 제안되었으며, To47균주는 Sphingomonadaceae 科의 新屬으로 제안되었다. 본 연구를 통하여 순수분리 및 동정된 상기의 저영양성 신규미생물의 배양배지 설계를 위하여 저영양세균의 생리학적 특성을 조사하였다. 저영양세균의 대표적인 생리학적 특성으로는 통상농도의 NB배지에서 심한 증식저해를 받는 것으로, NB배지의 주요 성분인 아미노산에 대한 저영양세균의 감수성을 평가하기 위해 통상농도의 NB배지와 토양 내 아미노산의 정량․정성 분석을 수행하였다. 토양 내 아미노산 함량은 통상농도의 NB배지보다 200배~600배 낮은 함량을 나타내었다. 기초배지에 14종류의 아미노산을 첨가한 배지에 저영양세균을 각각 접종하고 증식능을 조사한 결과 1mM 농도 이상에서 증식 효과를 나타내는 아미노산으로 glutamic acid, leucine, threonine, proline, isoleucin이 선발되었다. 저영양세균 증식에 높은 증식효과 보인 glutamic acid, isoleucin아미노산을 기초배지에 1mM 농도로 첨가하여 토양세균수를 측정한 결과 DNB배지 보다 1.5 ~ 2배 이상 더 높은 계수치를 나타내었다. 이와 같은 결과를 바탕으로 저영양세균 증식에 높은 효과를 나타내는 glutamic acid를 1mM, 5mM, 10mM 농도로 각각 첨가한 배지에 저영양세균을 접종한 후 저영양세균의 증식능을 비교 검토한 결과 DNB배지보다 4배 이상의 높은 증식능을 나타냄을 확인 할 수 있었다. 본 연구를 통하여 바이오 산업에 이용 가능한 저영양세균의 대량배양 배지설계에 중요한 기초자료를 제공할 수 있으리라 기대된다.
Thirty-two soil samples were collected from different layers of quercus and coniferous forest soil throughout the one year and analyzed pH, water content, and C/N ratio in each layer, and from the results, we confirmed that forest soil contains ecologically various habits. The average number of bact...
Thirty-two soil samples were collected from different layers of quercus and coniferous forest soil throughout the one year and analyzed pH, water content, and C/N ratio in each layer, and from the results, we confirmed that forest soil contains ecologically various habits. The average number of bacteria on the 10-2 diluted NB medium(DNB) was higher than that from the full strength NB medium with all samples taken at different layers throughout the year. Results suggest that oligotrophic bacteria exist abundantly in bacterial populations of rendzina forest soil. The number of colonies on DNB plates increased with incubation time following triple colony formation curves(CFCs). According to CFC, we obtained 459 isolates from CFC-I(about 24 to 216 hr), 401 from CFC-II(about 216 to 480 hr), and 363 from CFC-III(about 480 to 1200 hr), so a total of 1223 isolates. Seventy-three isolated successfully in the 1st isolation but did not grow in subculture. We temporarily designate as ‘temporarily culturable bacteria'. Based on the 16S rDNA sequences, 49 temporarily culturable isolates were classified into 6 phylogenetic groups: α-, β-, γ-proteobacteria, Acidobacteria, Actinobacteria and Firmicutes. A large proportion of these isolates not closely related to any genus in the current 16S rDNA sequence database, indicating the possibility of new genera. Among bacteria isolated from forest soil, soil bacteria that formed small colonies very slowly after 1000 hours’ culture and 18 bacteria were isolated from CFC-III. We temporarily designate as ‘slow growing oligotrophic bacteria.’ These were classified into 4 phylogenetic groups: α-, β-, γ-Proteobacteria and Actinobacteria. Slow-growing oligotrophic bacteria were suggested as novel order (6 isolates), novel family (4 isolates), and novel species (4 isolates). According to the results of the purification and identification experiment, strains L5, L8 L9, and L70 belonging to α-proteobacteria were suggested as novel order Rhodospirillales, strain L34 as a novel species belonging to family Rhodospirillaceae, and strain L55 as family Bradyrhizobiaceae. Strain L27, which belongs to family Burkholderia of β-proteobacteria, was suggested as a novel species. Strain L64 belonging to Actinobacteria was suggested as a novel species of family Solirubrobacter. Oligotrophic bacteria strain To13, which promotes plant growth, was suggested as a novel species of family Sphingomonas, and isolate To47 was suggested as a novel family of order Sphingomonadaceae. In order to design culture medium for the oligotrophic novel bacteria purified and identified in this study as above, we investigated the physiological characteristics of the oligotrophic bacteria. The amino acid content in soil was 200 ~ 600 times lower than that in NB medium. When oligotrophic bacteria were seeded in medium, which was prepared by adding 14 kinds of amino acid to basal medium, and analyzed their multiplication, amino acids showing a multiplication effect at concentration of over 1mM were glutamic acid, leucine, threonine, proline, and isoleucin. When glutamic acid and isoleucin amino acid, which showed high multiplication of oligotrophic bacteria, were added to basal medium at concentration of 1mM and the soil bacterial count was measured, the count was 1.5 ~ 2 times higher than that in DNB medium. Based on the results, we seeded oligotrophic bacteria in mediums to which glutamic acid, which showed high multiplication of oligotrophic bacteria, was added at concentration of 1mM, 5mM and 10mM respectively, and compared the multiplication of the oligotrophic bacteria. In the result, multiplication was over 4 times higher than that in DNB medium. The results of this study are expected to provide important basic materials necessary to design medium for the mass culture of industrial usable oligotrophic bacteria based on the physiological and biochemical characteristics of slow-growing oligotrophic bacteria.
Thirty-two soil samples were collected from different layers of quercus and coniferous forest soil throughout the one year and analyzed pH, water content, and C/N ratio in each layer, and from the results, we confirmed that forest soil contains ecologically various habits. The average number of bacteria on the 10-2 diluted NB medium(DNB) was higher than that from the full strength NB medium with all samples taken at different layers throughout the year. Results suggest that oligotrophic bacteria exist abundantly in bacterial populations of rendzina forest soil. The number of colonies on DNB plates increased with incubation time following triple colony formation curves(CFCs). According to CFC, we obtained 459 isolates from CFC-I(about 24 to 216 hr), 401 from CFC-II(about 216 to 480 hr), and 363 from CFC-III(about 480 to 1200 hr), so a total of 1223 isolates. Seventy-three isolated successfully in the 1st isolation but did not grow in subculture. We temporarily designate as ‘temporarily culturable bacteria'. Based on the 16S rDNA sequences, 49 temporarily culturable isolates were classified into 6 phylogenetic groups: α-, β-, γ-proteobacteria, Acidobacteria, Actinobacteria and Firmicutes. A large proportion of these isolates not closely related to any genus in the current 16S rDNA sequence database, indicating the possibility of new genera. Among bacteria isolated from forest soil, soil bacteria that formed small colonies very slowly after 1000 hours’ culture and 18 bacteria were isolated from CFC-III. We temporarily designate as ‘slow growing oligotrophic bacteria.’ These were classified into 4 phylogenetic groups: α-, β-, γ-Proteobacteria and Actinobacteria. Slow-growing oligotrophic bacteria were suggested as novel order (6 isolates), novel family (4 isolates), and novel species (4 isolates). According to the results of the purification and identification experiment, strains L5, L8 L9, and L70 belonging to α-proteobacteria were suggested as novel order Rhodospirillales, strain L34 as a novel species belonging to family Rhodospirillaceae, and strain L55 as family Bradyrhizobiaceae. Strain L27, which belongs to family Burkholderia of β-proteobacteria, was suggested as a novel species. Strain L64 belonging to Actinobacteria was suggested as a novel species of family Solirubrobacter. Oligotrophic bacteria strain To13, which promotes plant growth, was suggested as a novel species of family Sphingomonas, and isolate To47 was suggested as a novel family of order Sphingomonadaceae. In order to design culture medium for the oligotrophic novel bacteria purified and identified in this study as above, we investigated the physiological characteristics of the oligotrophic bacteria. The amino acid content in soil was 200 ~ 600 times lower than that in NB medium. When oligotrophic bacteria were seeded in medium, which was prepared by adding 14 kinds of amino acid to basal medium, and analyzed their multiplication, amino acids showing a multiplication effect at concentration of over 1mM were glutamic acid, leucine, threonine, proline, and isoleucin. When glutamic acid and isoleucin amino acid, which showed high multiplication of oligotrophic bacteria, were added to basal medium at concentration of 1mM and the soil bacterial count was measured, the count was 1.5 ~ 2 times higher than that in DNB medium. Based on the results, we seeded oligotrophic bacteria in mediums to which glutamic acid, which showed high multiplication of oligotrophic bacteria, was added at concentration of 1mM, 5mM and 10mM respectively, and compared the multiplication of the oligotrophic bacteria. In the result, multiplication was over 4 times higher than that in DNB medium. The results of this study are expected to provide important basic materials necessary to design medium for the mass culture of industrial usable oligotrophic bacteria based on the physiological and biochemical characteristics of slow-growing oligotrophic bacteria.
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