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문제 정의
- anammox 미생물의 존재는 확인할 수 없었다. 본 연구의 목적은 높은 질소제거 효율을 보이고 있는 anammox UASB 반응기에 나타나는 붉은색 혐기성 입상 솔거지를 채취하여 미생물 군집구조를 분석하는 것이다. 좀 티 세부적으로는, 분자생물학적 기법인 16S rRNA gene 분셕과 FISH (Fluorescence In Situ Hybridization)를 활읗하여 anammox 미생물의 존재를 확인하고 우점도를 파악하는 것이다.
제안 방법
- 0.06 kg N/n?-day로 유지하였고, 연속 배양에 따른 anammox 반응 효율의 변화를 관찰하기 위해 주기적으로 유출수를 분석하였다. anammox 활성에 의해서 유입 암모니아성 질소의 농도가 안정적으로 제거되었을 때, 유입 질소 농도를 단계적으로 증가시켜 암모니아성 질소와 아질산성 질소의 농도를 각각 300 mg/L의 조건에서 운전하였다.
- 이후, X-gal과 ampicillin이 첨가된 한천배지에 형질 전환된 미생물을 도말하여 선택배양하였다. 16S rRNA gene 의 십, 입이 확인된 미생물을 ampicillin이 첨가된 LB Broth에서 과량배양 후 Plasmid Miniprep Kit(DyneBioInc., Korea) 를 이용하여 plasmid# 순수정제하였다. Plamid에 삽입된 16S rRNA gene의 염기서열은 DYEnamic ET Terminator Sequen cing Kit(GE Health Care, USA) 와 MegaBACE 1000 DNA sequencer(GE Health Care, USA)에 의해 분석되었다.
- 16S rRNA gene의 증폭은 MyCycler™(BIO-RAD, USA)를이용하여 시행하였다. PCR 증폭조건은 pre-heating(94℃, 4분), denaturing(94℃, 1 분), annealing(55 ℃, 1 분), extension(72 ℃, 1분), final extension(72℃, 10분)이였고, 30회 증폭을 실시하였다.
- 19) AMX368 탐침자가 anammox 미생물을 전체적으로 탐침할 수 있는지 확인하기 위해서 in siHco FISH test를 수행하였다. 이를 위해 문헌조사를 통해 파악한 모든 anammox 미생물의 16S rRNA gene 염기서열 정보와 Probe Match(Ribosomal Database Project)에서 AMX368 로 탐침되는 미생물 정보를 대조하였다.
- 총 90, 211개의 염기서열을 참조하여 Probe Match를 시행한 결과 AMX368은 anammox 외의 미생물을 탐침 하지는 않았으나, 모든 anam mox 미생물을 탐침하지는 못하였다. AMX368에 의해 탐침 되는 미생물은 Type I으로 표시하였고, AMX368에 의해 탐침 되지 않는 anammox 미생물은 Type Ⅱ, Ⅲ으로 분류하였다(Table 4). Planctomycete KSU-1, Candidatus "Jettenia asi- atica", Uncultured Planctomycetales bacterium clone P14, Can didatus 4tAnammoxoglobus propionicus"를 AMX368가 탐침 하지 못하는 이유는 탐침 대상인 E.
- Anammox 반응은 메탄형성반응기의 처리수를 처리하는 탈질 유동층 반응기 (nitrifying fluidized bed reactor) 의 암모니아: 가 사라지는 현상에서 발견되었다암모늄의 산화 및 제거기작은 nitrite의 소비와 질소가스 생산과 연관되어있고, nitrite 가 전자 수용체로 활용되면서 암모늄이 산화되고, 동시에 질소가스가 생성되는 혐기성 암모늄 산화반응으로 결론지어졌다. Strous 등에 의해 정립된 anammox 반응의 반응식은 아래와 같다.
- CHIMERA. CHECK 프로그램을 이용하여 부분적 염기서열(500 bp)중의 chimera를 스크리닝하였다. Chimera가 아닌 염기서열을 NCBI (National Center for Biotechnology Information) 의 BLAST Network Service 에 입력하여 최상의 유사성을 보이는 근유종을탐색하였다.
- CHECK 프로그램을 이용하여 부분적 염기서열(500 bp)중의 chimera를 스크리닝하였다. Chimera가 아닌 염기서열을 NCBI (National Center for Biotechnology Information) 의 BLAST Network Service 에 입력하여 최상의 유사성을 보이는 근유종을탐색하였다. 근유종 정보를 계통분류학적 분지도 상에서 확인하기 위해서 염기서열을 ClustalX 1.
- 시행하였다. PCR 증폭조건은 pre-heating(94℃, 4분), denaturing(94℃, 1 분), annealing(55 ℃, 1 분), extension(72 ℃, 1분), final extension(72℃, 10분)이였고, 30회 증폭을 실시하였다. 증폭산물은 100 mV에서 25분 동안의 전기영동(Mupid-a, Japan)하였고, 단일 band의 DNA Power Gel Extraction Kit (Dyne BioInc.
- 각분지에 표시된 숫자는 1000회 bootstrap resampling에 의해묶여진 백분율을 나타내는 것으로 5개의 phylum 집단은 85% 이상의 견고성을 나타냈다. Table 3을 기반으로 각 phylum 집단의 다양성과 우점도 정보를 추출할 수 있는데, phylum에 해당하는 근유종의 개수로 다양성을 판단하고, 총 51개 clone 중 해당 phylum에 속한 clone의 비율로 우점도를 계산하였다(Fig. 4). BLAST 및 계통분류학적 분지도 분석결과 anam mox 반응기 환경 이 혐 기성 독립영 양 조건임에도 불구하고 다양한 미생물이 존재하는 것을 나타내고 있다.
- 06 kg N/n?-day로 유지하였고, 연속 배양에 따른 anammox 반응 효율의 변화를 관찰하기 위해 주기적으로 유출수를 분석하였다. anammox 활성에 의해서 유입 암모니아성 질소의 농도가 안정적으로 제거되었을 때, 유입 질소 농도를 단계적으로 증가시켜 암모니아성 질소와 아질산성 질소의 농도를 각각 300 mg/L의 조건에서 운전하였다. pH 는 조절하지 않았으며, 반응기내 온도는 항온조에서 히터를 이용하여 증온조건인 35±1℃의 조건을 유지하였다.
- BLAST를 통해 최상의 유사도를 가지는 미생물을 검색한 결과 27개의 clone은 anam mox bacteria, P-proteobacteria 3 가지, Chlorobi 2가지, Acido bacteria, Chloroflexi의 총 8가지 미생물로 분류되었다(Table 3). 각 근유종에 대하여 최고의 유사도를 보이는 8개의 clone 들(GR 3, GR 15, GR 24, GR 35, GR 45, GR 55, GR 77, GR 88)과 근유종으로 예상되는 염기서열들을 NCBI에서 발췌 및 참조하여 계통분류학적 분지도를 작성하였다(Fig. 3). 각분지에 표시된 숫자는 1000회 bootstrap resampling에 의해묶여진 백분율을 나타내는 것으로 5개의 phylum 집단은 85% 이상의 견고성을 나타냈다.
- 01% chromium potassium sulfhte)으로 코팅시킨 에폭시 수지 코팅 슬라이드에 올려 약 20분 동안 자연 건조시켰다. 그 후 각각 2분간 50, 80, 96% 에탄을에 2번씩 담구어 탈수시킨 후 hybridization을 수행하였다. hybridization은 46℃, 3시간 동안 hybridization buffer(0.
- Chimera가 아닌 염기서열을 NCBI (National Center for Biotechnology Information) 의 BLAST Network Service 에 입력하여 최상의 유사성을 보이는 근유종을탐색하였다. 근유종 정보를 계통분류학적 분지도 상에서 확인하기 위해서 염기서열을 ClustalX 1.81 을 이용하여 정렬하고, 정렬된 염기서열 정보를 MEGA 3.1 으로 분석하여 계통분류 학적 분지도를 작성하였다. 계통분류학적 분지도 작성 시 neighbor-joining method를 알고리즘으로 이용하였으며, 신뢰성을 확보하기 위해 1000회의 bootstrap을 시행하였다.
- 입상혐기성 슬러지는 반응기 유효부피의 약 60%(v/v)로 채워졌으며, 주입되기 전 수 차례 세척하였다. 반웅기 하부에는 직경 7-10 mm의 ceramic ball을 약 90 mL 부피로 채워 식종미생물의 유실을 방지하였고, 미량펌프(Model QSY with RH, Fluidmetering Inc.)를 이용하여 합성폐수를 유입하였다. 합성폐수의 조성은 아래 Table 1과 같다.
- pH 는 조절하지 않았으며, 반응기내 온도는 항온조에서 히터를 이용하여 증온조건인 35±1℃의 조건을 유지하였다. 발생가스량은 매일 측정하였고, 유출 가스내 질소가스 함량은 매주 1회 측정하였다. 유입, 유출수의 암모니아성 질소, 아질산성 질소와 질산성 질소의 농도는 매주 3회 분석하였다.
- 35 L의 UASB(UPflow Anaerobic Sludge Blanket) 형태이며, 반응기의 온도를 조절하기 위하여 127 cm(가로)×70 cm(세로)× 151 cm(높이) 크기의 상자에 히터를 장착한 항온시스템을 제작하였고, 발생되는 가스는 반응기 상부의 GSS(Gas Solid Separator)에 의해 분리된 후; 습식 가스 미터 (TG05 type, Ritter)를 이용하여 생성가스량을 측정하였다. 배양초기에는 주정폐수를 처리하고 있는 UASB 반응기에서 채취해 혐기성 입상혐기성 슬러지와 anammox 활성이 나타난 국내의 축산폐수 처리장의 부유성 슬러지, 오수처리용 회전원판접촉식 반응기(Rotating Biological Contrac- tor)에서 탈리된 부유성 슬러지롤 식종하여 운전하였으며, 침전조 상부로 anammox 미생물이 유실되는 것을 최소화하고, 지속적으로 UASB 반응기로 anammox미생물을 공급하기 위해서 탄소섬유판을 UASB 앞단에 설치하여 연속배양을 실시하였다(Fig. 1). 입상혐기성 슬러지는 반응기 유효부피의 약 60%(v/v)로 채워졌으며, 주입되기 전 수 차례 세척하였다.
- 본 연구에서는 83.3-93.5%의 총질소 제거율를 보이는 anam mox UASB 반응기에 나타나는 붉은색 혐기성 입상 슬러지의 미생물 군집구조를 분자생물학적 기법인 16S rRNA gene 분석과 FISH를 활용하여 분석하였다. 16S rRNA gene 클로닝을 통해 획득한 염기서열 정보를 활용하여 BLAST를 시행하고 계통분류학적 분지도를 작성한 결과 반응기 내의 미생물 군집구조가 다양함을 확인하였다.
- 분자생물학적 기법을 이용하여 반응기내 미생물을 분석하기 위하여, 연속반응기 하부의 시료 채취구를 통하여 반응 기내 입상 슬러지를 채취하였다. 운전초기 식종한 혐기성 입상슬러지는 검은색을 나타내었지만, anammox 활성이 중가됨에 따라 점점 갈색 또는 붉은색으로 변화되었다.
- 세포에 Tissue-Tek OCT compound(Sakura Finetek, USA) 를 침투시켜 하루 밤 동안 급냉 후(-38C), 샘플을 20℃에서 미세절단기(ReichertJung Cryocut 1500, Leica)를 사용하여 10-20 μm의 두께로 절단하였다. 이후, 절단된 샘플을 젤라틴(0.
- 좀 티 세부적으로는, 분자생물학적 기법인 16S rRNA gene 분셕과 FISH (Fluorescence In Situ Hybridization)를 활읗하여 anammox 미생물의 존재를 확인하고 우점도를 파악하는 것이다. 아울러, anammox 미생물과 공존하는 미생물의 군집구조를 조사하였다.
- 연속 반응기는 유효부피 3.35 L의 UASB(UPflow Anaerobic Sludge Blanket) 형태이며, 반응기의 온도를 조절하기 위하여 127 cm(가로)×70 cm(세로)× 151 cm(높이) 크기의 상자에 히터를 장착한 항온시스템을 제작하였고, 발생되는 가스는 반응기 상부의 GSS(Gas Solid Separator)에 의해 분리된 후; 습식 가스 미터 (TG05 type, Ritter)를 이용하여 생성가스량을 측정하였다. 배양초기에는 주정폐수를 처리하고 있는 UASB 반응기에서 채취해 혐기성 입상혐기성 슬러지와 anammox 활성이 나타난 국내의 축산폐수 처리장의 부유성 슬러지, 오수처리용 회전원판접촉식 반응기(Rotating Biological Contrac- tor)에서 탈리된 부유성 슬러지롤 식종하여 운전하였으며, 침전조 상부로 anammox 미생물이 유실되는 것을 최소화하고, 지속적으로 UASB 반응기로 anammox미생물을 공급하기 위해서 탄소섬유판을 UASB 앞단에 설치하여 연속배양을 실시하였다(Fig.
- 2(a)는 R3 반응기의 연속배양에 따른 유입, 유출 수의 암모니아성 질소농도의 변화를 나타낸 것으로서, 유입수의 암모니아성 질소의 농도는 32 mg/L에서 단계적으로 50, 100, 200, 300 mg/L까지 증가시켰다. 운전 17일까지는 유입 아질산성 질소의 농도를 32 mg/L로 주입하였으나, 유출수내 아질산성 질소의 제거율이 낮게 나타난 운전 18일부터 49일까지는 아질산성 질소의 농도를 20 mg/L로 낮추어서 주입하여 배양기의 안정화를 시도하였다.
- 발생가스량은 매일 측정하였고, 유출 가스내 질소가스 함량은 매주 1회 측정하였다. 유입, 유출수의 암모니아성 질소, 아질산성 질소와 질산성 질소의 농도는 매주 3회 분석하였다.
- 19) AMX368 탐침자가 anammox 미생물을 전체적으로 탐침할 수 있는지 확인하기 위해서 in siHco FISH test를 수행하였다. 이를 위해 문헌조사를 통해 파악한 모든 anammox 미생물의 16S rRNA gene 염기서열 정보와 Probe Match(Ribosomal Database Project)에서 AMX368 로 탐침되는 미생물 정보를 대조하였다. 총 90, 211개의 염기서열을 참조하여 Probe Match를 시행한 결과 AMX368은 anammox 외의 미생물을 탐침 하지는 않았으나, 모든 anam mox 미생물을 탐침하지는 못하였다.
- 정제된 16S rRNA gene은 T&A cloning vector(Real Bioteh Corp., Taiwan)를 사용하여 ligation 하고, HIT™ competent cells(Real Biotech Corp, Taiwan)을 사용하여 형질전환을 시행하였다. 이후, X-gal과 ampicillin이 첨가된 한천배지에 형질 전환된 미생물을 도말하여 선택배양하였다.
- PCR 증폭조건은 pre-heating(94℃, 4분), denaturing(94℃, 1 분), annealing(55 ℃, 1 분), extension(72 ℃, 1분), final extension(72℃, 10분)이였고, 30회 증폭을 실시하였다. 증폭산물은 100 mV에서 25분 동안의 전기영동(Mupid-a, Japan)하였고, 단일 band의 DNA Power Gel Extraction Kit (Dyne BioInc., Korea)를 사용하여 정제하였다.
- 채취한 샘플은 3차 증류수로 세척하여 부유물을 제거하였다. 채취한 붉은색 입상 슬러지는 250 mg 정도를 Power Soil™ DNA kit(Mo Bio Laboratories Inc., USA)에 투입하여 혼합 genomic DNA 를 추출하였다. 혼합 genomic DNA를 주형으로 이용하여 다양한 원핵 미생물의 16S rRNA gene을 증폭하였는데, 이를 위해 전체 원핵 미생물의 16S rRNA gene의 증폭이 가능한 27f(5, -AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3, )와 1492r(5'- TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3, )을 primer로 사용하였다.
- , USA)에 투입하여 혼합 genomic DNA 를 추출하였다. 혼합 genomic DNA를 주형으로 이용하여 다양한 원핵 미생물의 16S rRNA gene을 증폭하였는데, 이를 위해 전체 원핵 미생물의 16S rRNA gene의 증폭이 가능한 27f(5, -AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3, )와 1492r(5'- TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3, )을 primer로 사용하였다. PCR을 위한 혼합액은 총 20 |1L이고, 2 J1L의 10X PCR bu- ffer(15 mM MgCl2), 0.
대상 데이터
- 미량원소 I용액은 EDTA 5 g/J와 FeSO4 . 7H2O 5 g/L로 제조되었고 미량원소 II용액은 ZnSO4 - 7H2O 0.43 g/L, CoCl2 . 6H2O 0.
- 01% sodium dodecyl sulfate (SDS))에 슬라이드를 담아 배양하였다. 본 실험에 사용된 탐침 자는 전체 박테리아 식별을 위한 fluorescein labeled EUB338 Ⅰ, Ⅱ, Ⅲ mix와 anammox 미생물 식별을 위한 HEX labeled AMX368 이었다.
- 54 kg N/n?-day로 우수한 anammox 활성을 나타낸 운전 200일 이후의 입상 슬러지를 채취하여 육안으로 살펴본 결과, 일부는 갈색을 나타내었고, 일부의 입상슬러지에서는 표면에 anammox 균으로 추정되는 붉은 색의 미생물군이 부착되었고, 일부는 붉은 색의 입상슬러지로 구성되어 있었다. 본 연구에서는 주로 입상 anammox균으로 추정되는 붉은색 입상 슬러지만을 채취하여 실험하였다. 채취한 샘플은 3차 증류수로 세척하여 부유물을 제거하였다.
- 01% sodium dodecyl sulfate (SDS))에 담구어 48℃, 20분 동안 정치한 후 탈이온수로 세정하여 자연건조 시켰다. 현미경 관찰은 위상차 Neofluar 렌즈와 axiocam이 장착된 형광현미경 (Axioskop 2plus, Zeiss, Germany)을 사용하였다.
이론/모형
- 1 으로 분석하여 계통분류 학적 분지도를 작성하였다. 계통분류학적 분지도 작성 시 neighbor-joining method를 알고리즘으로 이용하였으며, 신뢰성을 확보하기 위해 1000회의 bootstrap을 시행하였다.
성능/효과
- Anammox 미생물 그룹은 25%(13/51)의 높은 우점도를 나타내었으나, 다양한 anammox 미생물이 발견되지는 않았다. 현재까지 밝혀진 anammox 미생물은 Candidatus uBrocadia anammoxidans", Candidates aKuenenia stuttgartiensis", Candidatus "Scalindua wagneri", Candidatus "Scalindua brodae, \ Candi datus "Scalindua sorokinii, , , Candidatus uBrocadia fulgida, \ Candidatus "Jettenia asiatica" 와 Candidatus uAnammoxoglo- bus propionicus, 1 등으로 다양하지만 본 연구실의 UASB 반응기의 anammox 미생물 군집구조는 단일한 특성을 나타내었다. 그리고 한국 고유의 슬러 지로부터 유래한 특유의 anam mox 미생물 clone을 발견하지 못하였다.
- 질소 제거속도가 0.54 kg N/n?-day로 우수한 anammox 활성을 나타낸 운전 200일 이후의 입상 슬러지를 채취하여 육안으로 살펴본 결과, 일부는 갈색을 나타내었고, 일부의 입상슬러지에서는 표면에 anammox 균으로 추정되는 붉은 색의 미생물군이 부착되었고, 일부는 붉은 색의 입상슬러지로 구성되어 있었다. 본 연구에서는 주로 입상 anammox균으로 추정되는 붉은색 입상 슬러지만을 채취하여 실험하였다.
- 5%의 총질소 제거율를 보이는 anam mox UASB 반응기에 나타나는 붉은색 혐기성 입상 슬러지의 미생물 군집구조를 분자생물학적 기법인 16S rRNA gene 분석과 FISH를 활용하여 분석하였다. 16S rRNA gene 클로닝을 통해 획득한 염기서열 정보를 활용하여 BLAST를 시행하고 계통분류학적 분지도를 작성한 결과 반응기 내의 미생물 군집구조가 다양함을 확인하였다. 붉은색 혐기성 임상슬러지에 서식하는 박테리아는 anammox bacteria, p-proteo- bacteria 3 가지, Chlorobi 2가지, Acidobacteria, Chloroflexi로분석 되었으며, 0-proteobacteria의 우점도와 다양성이 가장 큰 것으로 나타났다.
- Anammox 미생물 그룹은 25%(13/51)의 높은 우점도를 나타내었으나, 다양한 anammox 미생물이 발견되지는 않았다. 현재까지 밝혀진 anammox 미생물은 Candidatus uBrocadia anammoxidans", Candidates aKuenenia stuttgartiensis", Candidatus "Scalindua wagneri", Candidatus "Scalindua brodae, \ Candi datus "Scalindua sorokinii, , , Candidatus uBrocadia fulgida, \ Candidatus "Jettenia asiatica" 와 Candidatus uAnammoxoglo- bus propionicus, 1 등으로 다양하지만 본 연구실의 UASB 반응기의 anammox 미생물 군집구조는 단일한 특성을 나타내었다.
- 4). BLAST 및 계통분류학적 분지도 분석결과 anam mox 반응기 환경 이 혐 기성 독립영 양 조건임에도 불구하고 다양한 미생물이 존재하는 것을 나타내고 있다.
- 모두 27개로 파악되었다. BLAST를 통해 최상의 유사도를 가지는 미생물을 검색한 결과 27개의 clone은 anam mox bacteria, P-proteobacteria 3 가지, Chlorobi 2가지, Acido bacteria, Chloroflexi의 총 8가지 미생물로 분류되었다(Table 3). 각 근유종에 대하여 최고의 유사도를 보이는 8개의 clone 들(GR 3, GR 15, GR 24, GR 35, GR 45, GR 55, GR 77, GR 88)과 근유종으로 예상되는 염기서열들을 NCBI에서 발췌 및 참조하여 계통분류학적 분지도를 작성하였다(Fig.
- E. coll rRNA gene base numbering 368-385 사이의 염기서열 유형으로 파악된 Type Ⅰ, Ⅱ, Ⅲ를 기반으로 51개의 clone에 대하여 in-silico hybridization을 시행한 결과 11개의 clone은 Type II에 해당하는 anammox 미생물이었고, 1 개의 clone만이 AMX368과 정확히 일치하는 것을 보였다 (Table 6). Table 6의 결과에 따르면, 혐기성 질소산화 UASB 반웅기에 우점하는 anammox 미생물은 Planctomycete KSU-1 과 같은 Type Ⅱ이고, Type I의 anammox 미생물의 우점도는 낮은 것으로 파악된다.
- coli rRNA gene base number 368-385 범위에서의 교체현상에 의해 개선이 필요한 것으로 확인되었다. In-situ EUB338 Ⅰ, Ⅱ, Ⅲ와 AMX368 FISH pro- be를 사용하여 anammox 미생물의 분포형태를 확인한 결과 anammox 미생물이 붉은색 혐기성 입상 슬러지에 우점하고 있었으며, 붉은 생물막에 특히 집중적으로 존재하였다.
- Table 3의 No 1-12에 해당하는 clone들은 오직 일본의 anam- mox 반응기에서 유래된 AB057453(Planctomycete KSU-1) 과유사한 것으로 밝혀졌고, 유사도가 98-100%로 상당히 높았다. Anammox 미생물 그룹은 25%(13/51)의 높은 우점도를 나타내었으나, 다양한 anammox 미생물이 발견되지는 않았다.
- 운전 70일 이후에는 유입질소의 부하변동과 농도변경에 관계없이 거의 100% 아질산성 질소제거율을 나타내었다. anam- mox공정의 반응부산물인 질산성 질소의 경우에는 반응기에서 제거된 암모니아성 질소에 따라 유출수내 질산성 질소의 농도는 유입 암모니아성 질소의 농도가 200 mg/L이었을 때 유출되는 질산성 질소의 농도는 20-50 mg/L의 변동폭을 나타내었고, 유입 암모니아성 질소의 농도가 300 mg/L이었을 때에는 유출 질산성 질소의 농도가 70-80 mg/L로 나타났다. 이는 유입 암모니아성 질소의 농도가 200과 300 mg/L일 때 이론적으로 생성되는 질산성 질소의 값인 52와 78 mg/L에 근접한 농도로서 본 반응기의 질소전환반응도 anammox 반응임을 알 수 있었다.
- 13-17의 Clone들은 p-proteobacteria phylum에 속하는 것으로 판단된다. p-proteobacteria 집단은 3가지 근유종이 파악되어 가장 다양한 군집을 보이고, 총 24개의 clone(47%) 이 발견되어 가장 큰 우점도를 보였다. 이러한 다양성과 우점도를 기반으로 판단해 볼 때, p-proteobacteria?} anammox 반응과 일부 관여하고 있는 것으로 사료된다.
- 기초실험으로 수행된 16S rRNA gene 분석 결과에 따르면, anammox UASB에 존재하는 미생물은 a, 0, y, 8-proteO- bacteria, Planctomecetes, Acidobacteria와 Chloroflexi로서 혹독한 혐기성 독립영양조건에서도 다양하 군집구조를 나타냈었지만, anammox 미생물의 존재는 확인할 수 없었다. 본 연구의 목적은 높은 질소제거 효율을 보이고 있는 anammox UASB 반응기에 나타나는 붉은색 혐기성 입상 솔거지를 채취하여 미생물 군집구조를 분석하는 것이다.
- 회복되었다. 또한 운전 86일에 암모니아성 질소의 농도를 100 mg/L에서 200 mg/L로 증가시켰을 때에도 일시적으로 60 mg/J까지 암모니아성 질소가 증가하기도 하였지만 급속하게 회복되었고, 운전 100일 이후에는 안정적인 질소 제거율을 지속적으로 나타내었다. 운전 169일에 유입농도를 200 에서 300 mg/L까지 상승시켰을 때에도 안정적인 암모니아성 질소 농도를 지속적으로 나타내어 우수한 연속배양특성을 나타내었다.
- 본 연구에서는 27f forward primer를 포함하고 있는 500 bp의 부분적 염기서열 총 89개 sequence중 CHIMERA_ CHECK-g- 통해 non-chimera 염기서열 51개를 선별하고 염기서열이 중복되는 clone을 제외한 결과, 최종적인 분석대상 염기서열은 모두 27개로 파악되었다. BLAST를 통해 최상의 유사도를 가지는 미생물을 검색한 결과 27개의 clone은 anam mox bacteria, P-proteobacteria 3 가지, Chlorobi 2가지, Acido bacteria, Chloroflexi의 총 8가지 미생물로 분류되었다(Table 3).
- 16S rRNA gene 클로닝을 통해 획득한 염기서열 정보를 활용하여 BLAST를 시행하고 계통분류학적 분지도를 작성한 결과 반응기 내의 미생물 군집구조가 다양함을 확인하였다. 붉은색 혐기성 임상슬러지에 서식하는 박테리아는 anammox bacteria, p-proteo- bacteria 3 가지, Chlorobi 2가지, Acidobacteria, Chloroflexi로분석 되었으며, 0-proteobacteria의 우점도와 다양성이 가장 큰 것으로 나타났다. AMX368은 전체 anammox 미생물을 탐침 하기 위해 개발되었는데, E.
- 암모니아성 질소의 경우 운전 38일부터 비교적 안정적으로 제거되기 시작하였고, 운전 100일째 암모니아성 질소의 농도를 50 mg/L로 증가시켰을 때, 제거율이 급격히 저하되었다가서시히 회복되었다. 또한 운전 86일에 암모니아성 질소의 농도를 100 mg/L에서 200 mg/L로 증가시켰을 때에도 일시적으로 60 mg/J까지 암모니아성 질소가 증가하기도 하였지만 급속하게 회복되었고, 운전 100일 이후에는 안정적인 질소 제거율을 지속적으로 나타내었다.
- 또한 운전 86일에 암모니아성 질소의 농도를 100 mg/L에서 200 mg/L로 증가시켰을 때에도 일시적으로 60 mg/J까지 암모니아성 질소가 증가하기도 하였지만 급속하게 회복되었고, 운전 100일 이후에는 안정적인 질소 제거율을 지속적으로 나타내었다. 운전 169일에 유입농도를 200 에서 300 mg/L까지 상승시켰을 때에도 안정적인 암모니아성 질소 농도를 지속적으로 나타내어 우수한 연속배양특성을 나타내었다.
- 입상 슬러지를 채취하였다. 운전초기 식종한 혐기성 입상슬러지는 검은색을 나타내었지만, anammox 활성이 중가됨에 따라 점점 갈색 또는 붉은색으로 변화되었다. 질소 제거속도가 0.
- 운전초기와 유입 암모니아성 및 아질산성 질소 농도를 각각 30에서 50 mg/L, 100에서 200 mg/L로 증가시켰을 때를 제외하고 암모니아성 질소와 아질산성 질소의 제거율은 100% 에 가까웠으며, 반응이 안정화된 이후부터는 83.3-93.5%의 총질소 제거율을 나타내었다. 유입질소부하가 0.
- 이를 위해 문헌조사를 통해 파악한 모든 anammox 미생물의 16S rRNA gene 염기서열 정보와 Probe Match(Ribosomal Database Project)에서 AMX368 로 탐침되는 미생물 정보를 대조하였다. 총 90, 211개의 염기서열을 참조하여 Probe Match를 시행한 결과 AMX368은 anammox 외의 미생물을 탐침 하지는 않았으나, 모든 anam mox 미생물을 탐침하지는 못하였다. AMX368에 의해 탐침 되는 미생물은 Type I으로 표시하였고, AMX368에 의해 탐침 되지 않는 anammox 미생물은 Type Ⅱ, Ⅲ으로 분류하였다(Table 4).
후속연구
- 16~18) 사상 Chloro- flexi는 thermophilic 폐수처리를 위한 입상화 슬러지에 풍부하게 존재하고, 플럭구조의 지탱과 팽화(bulking)에 주요한 역할을 한다. Chlorobi(green sulfur bacteria) 근유종 AY548931 과 AY609340이 혐기성 질소제거 공정에서 발견되고 있으므로, 그들이 혐기성조건하에서의 질소제거에 기여하는 역할에 대한 규명도 필요할 것으로 판단된다.
- 7과 같이 확대관찰을 통하여 확인하였다. FISH 결과는 degeneracy를 고려하여 개선된 AMX368 FISH probe를 사용하였을 경우 더욱 정교해질 수 있을 것으로 판단된다.
- 현재까지 밝혀진 anammox 미생물은 Candidatus uBrocadia anammoxidans", Candidates aKuenenia stuttgartiensis", Candidatus "Scalindua wagneri", Candidatus "Scalindua brodae, \ Candi datus "Scalindua sorokinii, , , Candidatus uBrocadia fulgida, \ Candidatus "Jettenia asiatica" 와 Candidatus uAnammoxoglo- bus propionicus, 1 등으로 다양하지만 본 연구실의 UASB 반응기의 anammox 미생물 군집구조는 단일한 특성을 나타내었다. 그리고 한국 고유의 슬러 지로부터 유래한 특유의 anam mox 미생물 clone을 발견하지 못하였다.
- 따라서, anammox 미생물들을 효과적으로 탐침하기 위해서는 Type Ⅰ과 Ⅱ anammox 미생물을 동시에 탐침할 수 있도록 개선된 AMX368 FISH probe 를 사용하여야 한다. 또한 잠재적으로 존재할 수 있는 Type Ⅲ 의 anammox 탐침을 위하여 3가지 degeneracy가 고려될 수 있도록 AMX368을 개선하는 것 또한 필요하다.
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