무혈청 배지에서 계대배양한 비적응 CHO(Chinese Hamster Ovary) 세포의 증식력 개선에 관한 연구 Improvement of Proliferation Capacity of Non-adapted CHO Cells Subcultured Using Serum Free Media in Long-term Culture원문보기
본 연구에서는 CHO 세포를 이용해 세포를 별도의 적응기간 없이 무혈청 배지에서 배양했을 때 세포의 증식이 중단되는 원인을 찾고 배지 첨가 성분을 통해 이를 개선하고자 했다. 현재 개발된 무혈청 배지는 아직까지 혈청을 대체할 만한 성분을 포함하고 있지 않다. 때문에 무혈청 배지에 적응되지 않은 비적응 세포의 경우 계대 배양에 한계가 있다. 이런 한계가 나타나는 원인은 다양할 것으로 생각이 되지만 혈청의 부재로 인해 세포가 받게 되는 스트레스와 그로 인한 세포주기의 정지가 가장 근본적인 원인으로 생각된다. 무혈청 배지에서 세포가 받는 스트레스의 정도를 알아보고 배양 환경과 첨가물에 따른 ROS 농도의 변화를 측정하기 위해 배지와 세포의 ROS 농도를 측정하였다. ROS 농도를 측정한 결과 무혈청 상태에서 세포내 ROS가 엄청난 양으로 증가하는 것을 알 수 있었다. 이것은 혈청이 항산화능력을 갖고 있어서가 아니라 세포가 무혈청 환경에서 극심한 스트레스상태에 놓이기 때문인 것으로 생각된다. 이렇듯 증가한 ROS가 세포의 증식이 멈추게 되는 원인 중 하나로 생각되고, 항산화제를 첨가한 경우에도 증식력이나 ROS의 농도에 큰 차이가 없었던 것으로 미루어 보아 근본적으로 혈청과 같은 강력하게 증식을 촉진하는 성분을 배지에 첨가해야 할 것으로 여겨진다. ROS 이외에 세포의 증식이 멈추는 또 다른 원인으로 세포사멸의 여부를 확인했다. 무혈청 배지에서 배양한 적응세포와 비적응 세포 모두 특별한 세포사멸의 징후가 나타나지 않았다. 또한 무혈청 배지에서 증식이 멈춘 세포를 회수해 다시 혈청배지에서 배양한 경우 곧바로 증식력이 회복되기 때문에 대규모의 세포사멸은 발생하지 않는 것으로 생각된다. 위와 같은 현상들은 모두 혈청이 없기 때문에 발생하는 것으로 혈청을 대체할 수 있는 첨가물을 배지에 더해주면 세포의 증식이 개선될 것이다. 그래서 몇 가지 첨가물을 이용해 세포의 증식력에 변화가 나타나는지 알아보았다. 첨가물을 이용한 실험에서 IGF-I의 경우 장기간 배양에서 세포의 수를 안정적으로 유지하고 계대 횟수를 증가시키는 효과를 보였다. 이는 IGF-I이 어느정도 세포의 증식을 유지시켜주는 역할을 하기 때문인 것으로 생각된다. 무혈청 배지에서 비적응 CHO 세포의 계대 배양에 한계가 있는 것은 세포주기가 멈추기 때문인 것으로 생각된다. 세포주기가 멈추는 growth factor와 같이 세포의 증식을 지속적으로 유도할 수 있는 물질이 무혈청 배지에서는 부족하기 때문인 것으로 생각되고, IGF-I과 같은 첨가물을 통해 극복할 수 있는 문제라고 여겨진다.
본 연구에서는 CHO 세포를 이용해 세포를 별도의 적응기간 없이 무혈청 배지에서 배양했을 때 세포의 증식이 중단되는 원인을 찾고 배지 첨가 성분을 통해 이를 개선하고자 했다. 현재 개발된 무혈청 배지는 아직까지 혈청을 대체할 만한 성분을 포함하고 있지 않다. 때문에 무혈청 배지에 적응되지 않은 비적응 세포의 경우 계대 배양에 한계가 있다. 이런 한계가 나타나는 원인은 다양할 것으로 생각이 되지만 혈청의 부재로 인해 세포가 받게 되는 스트레스와 그로 인한 세포주기의 정지가 가장 근본적인 원인으로 생각된다. 무혈청 배지에서 세포가 받는 스트레스의 정도를 알아보고 배양 환경과 첨가물에 따른 ROS 농도의 변화를 측정하기 위해 배지와 세포의 ROS 농도를 측정하였다. ROS 농도를 측정한 결과 무혈청 상태에서 세포내 ROS가 엄청난 양으로 증가하는 것을 알 수 있었다. 이것은 혈청이 항산화능력을 갖고 있어서가 아니라 세포가 무혈청 환경에서 극심한 스트레스상태에 놓이기 때문인 것으로 생각된다. 이렇듯 증가한 ROS가 세포의 증식이 멈추게 되는 원인 중 하나로 생각되고, 항산화제를 첨가한 경우에도 증식력이나 ROS의 농도에 큰 차이가 없었던 것으로 미루어 보아 근본적으로 혈청과 같은 강력하게 증식을 촉진하는 성분을 배지에 첨가해야 할 것으로 여겨진다. ROS 이외에 세포의 증식이 멈추는 또 다른 원인으로 세포사멸의 여부를 확인했다. 무혈청 배지에서 배양한 적응세포와 비적응 세포 모두 특별한 세포사멸의 징후가 나타나지 않았다. 또한 무혈청 배지에서 증식이 멈춘 세포를 회수해 다시 혈청배지에서 배양한 경우 곧바로 증식력이 회복되기 때문에 대규모의 세포사멸은 발생하지 않는 것으로 생각된다. 위와 같은 현상들은 모두 혈청이 없기 때문에 발생하는 것으로 혈청을 대체할 수 있는 첨가물을 배지에 더해주면 세포의 증식이 개선될 것이다. 그래서 몇 가지 첨가물을 이용해 세포의 증식력에 변화가 나타나는지 알아보았다. 첨가물을 이용한 실험에서 IGF-I의 경우 장기간 배양에서 세포의 수를 안정적으로 유지하고 계대 횟수를 증가시키는 효과를 보였다. 이는 IGF-I이 어느정도 세포의 증식을 유지시켜주는 역할을 하기 때문인 것으로 생각된다. 무혈청 배지에서 비적응 CHO 세포의 계대 배양에 한계가 있는 것은 세포주기가 멈추기 때문인 것으로 생각된다. 세포주기가 멈추는 growth factor와 같이 세포의 증식을 지속적으로 유도할 수 있는 물질이 무혈청 배지에서는 부족하기 때문인 것으로 생각되고, IGF-I과 같은 첨가물을 통해 극복할 수 있는 문제라고 여겨진다.
Animal cell culture industry has a large market and an exponential growth rate among biological industry field. Chines hamster ovary(CHO) cells are the most widely used cell lines for recombinant protein production. They can avoid infection from polio, herpes, hepatitis B, HIV, measles, adenovirus a...
Animal cell culture industry has a large market and an exponential growth rate among biological industry field. Chines hamster ovary(CHO) cells are the most widely used cell lines for recombinant protein production. They can avoid infection from polio, herpes, hepatitis B, HIV, measles, adenovirus and etc. Moreover it is easy to transfection recombinant genes and possible to suspension culture. Serum free media is one of the most important factor of protein production. Because serum has problems. Serum is not defined the contents until now, it has a number of proteins, lipids, carbohydrates and unknown molecules that cause of risk involve in infection and high cost of product purification. CHO cell line cultured using serum free media were the basis of a very successful method to produce(glyco-)protein in mammalian cells, which are then used as pharmaceutical products. Also, the low protein content of the developed medium facilitates downstream processing and product purification. But non-adapted CHO cells have a limit of proliferation cultured using serum free media and it takes very long time to adapt non-adapted cells to serum free media. There are a number of causes of a limit of proliferation using serum free media. Absence of growth factors and growth stimulating molecules is a major factor of the reasons. It makes growth signals and moves cell cycle. And increase of cellular stress is another reason. It induces increase of intraceullar ROS concentration. The purpose of this study is about improvement of proliferation capacity of non-adapted CHO cells cultured using serum free media without adaptation process.
Animal cell culture industry has a large market and an exponential growth rate among biological industry field. Chines hamster ovary(CHO) cells are the most widely used cell lines for recombinant protein production. They can avoid infection from polio, herpes, hepatitis B, HIV, measles, adenovirus and etc. Moreover it is easy to transfection recombinant genes and possible to suspension culture. Serum free media is one of the most important factor of protein production. Because serum has problems. Serum is not defined the contents until now, it has a number of proteins, lipids, carbohydrates and unknown molecules that cause of risk involve in infection and high cost of product purification. CHO cell line cultured using serum free media were the basis of a very successful method to produce(glyco-)protein in mammalian cells, which are then used as pharmaceutical products. Also, the low protein content of the developed medium facilitates downstream processing and product purification. But non-adapted CHO cells have a limit of proliferation cultured using serum free media and it takes very long time to adapt non-adapted cells to serum free media. There are a number of causes of a limit of proliferation using serum free media. Absence of growth factors and growth stimulating molecules is a major factor of the reasons. It makes growth signals and moves cell cycle. And increase of cellular stress is another reason. It induces increase of intraceullar ROS concentration. The purpose of this study is about improvement of proliferation capacity of non-adapted CHO cells cultured using serum free media without adaptation process.
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문제 정의
증식이 개선될 것이다. 그래서 몇 가지 첨가물을 이용해 세포의 증식력에 변화가 나타나는지 알아보았다. 첨가물을 이용한 실험에서 IGF-I의 경우 장기간 배양에서 세포의 수를 안정적으로 유지하고 계대 횟수를 증가시키는 효과를 보였다.
때문에 혈청 배지와 무혈청 배지에 각각 혈청을 농도별로 첨가하고 세포의 증식에 미치는 영향을 알아보았다.
본 연구에서는 CHO 세포를 이용해 세포를 별도의 적응 기간 없이 무혈청 배지에서 배양했을 때 세포의 증식이 중단되는 원인을 찾고 배지 첨가 성분을 통해 이를 개선하고자 했다.
그러나 현재 적응기간을 거치지 않은 세포의 경우 무혈청 배지에서 계대배양에 한계가 있다. 본 연구에서는 CHO 세포용 무혈청 배지인 Sigma C5467 배지를 이용하여 비적응 CHO 세포의 계대 배양에서의 문제점과 해결방안을 찾고자하였다.
본 연구에서는 무혈청 배지에 적응되지 않은 비적응 CHO 세포를 이용하여 무혈청 배지에서 비적응 CHO 세포가 증식이 멈추는 이유를 알아보고 별도의 적응기간 없이 장기간 계대배양이 가능하도록 무혈청 배지에 몇 가지 성분을 첨가하여 증식력을 개선시키고자 하였다. 먼저 혈청의 유무가 비적응 CHO 세포의 계대배양에 미치는 영향을 알아보기 위해 혈청을 농도별로 첨가하고 세포의 농도를 비교하였다.
제안 방법
ROS 이외에 세포의 증식이 멈추는 또 다른 원인으로 세포사멸의 여부를 확인했다. 무혈청 배지에서 배양한 적응 세포와 비적응 세포 모두 특별한 세포사멸의 징후가 나타나지 않았다.
peroxides가 Fe2+ 이온을 Fe3+ 이온으로 변환시키면 Fe3 + 이온이 xylenol orange와 결합해서 발색이 되고, 발색된 용액을 560 nm에서 읽는 방법으로 측정하였다(29).
4B) 혈청 자체가 갖는 ROS 제거 능력은 아주 미미하다는 것을 알 수 있었다. 그러나 세포 내 ROS를 측정한 결과 혈청의 농도에 따라 세포 내 ROS의 농도가 현저히 감소하는 것은 혈청이 부족 할수록 세포가 받는 스트레스가 증가하는 것을 의미하며, 이는 배지에 항산화제를 직접 첨가한 경우에도 계대 배양 횟수가 크게 증가하지 않는 것으로 미루어 볼 때(Fig. 11) 혈청에 포함된 증식인자가 세포 내에서 ROS를 스스로 제거할 수 있는 항산화 효소의 생산을 돕는 것으로 보아야 할 것계대 배양의 횟수가 증가할수록 지속적으로 ROS의 양이 증가하는지를 알아보기 위해 계대 횟수에 따른 ROS 농도를 측정하였다(Fig. 7). 계대 횟수에 따라 ROS의 양이 증가하지는 않았고 혈청 배지에서 무혈청 배지로 처음 옮겼을 때 ROS가 가장 많이 증가하고 그 이후 일정하게 유지되는 것을 알 수 있었다.
DCF-DA를 20 uM 농도로 첨가한 후 10분간 37℃에서 배양한다. 다시 원심분리해서 세포를 회수한 후 PBS로 resuspension하고 FACS를 이용해 형광을 읽는 방법으로 세포 내 ROS의 양을 측정했다(30).
확인 됐다. 따라서 배지의 ROS 제거 능력이 세포의 증식에 미치는 영향을 좀 더 명확하게 밝히기 위해 배지의 종류와, 혈청의 첨가 여부, 계대 시간 등에 따른 세포 내 ROS의 농도를 FACS를 이용하여 측정하였다.
먼저 혈청의 유무가 비적응 CHO 세포의 계대배양에 미치는 영향을 알아보기 위해 혈청을 농도별로 첨가하고 세포의 농도를 비교하였다. 또한 무혈청 배지에서 세포가 받는 스트레스를 알아보기 위해 ROS (radical oxygen species) 농도를 측정하였고, 세포 고사 (apoptosis)의 유무를 FACS (fluorescence activated cell sorter) 를 이용해 알아봤다. 마지막으로 IGF (insulin-like growth factor)를 첨가해 무혈청 배지에서 장기간 배양시 세포의 증식력에 미치는 영향을 조사하였다(18-27).
또한 무혈청 배지에서 세포가 받는 스트레스를 알아보기 위해 ROS (radical oxygen species) 농도를 측정하였고, 세포 고사 (apoptosis)의 유무를 FACS (fluorescence activated cell sorter) 를 이용해 알아봤다. 마지막으로 IGF (insulin-like growth factor)를 첨가해 무혈청 배지에서 장기간 배양시 세포의 증식력에 미치는 영향을 조사하였다(18-27).
먼저 무혈청 배지가 혈청 배지와 비교해서 ROS 제거속도에 차이가 있는지 알아봤다. 혈청 배지인 MEM-a와 무혈청 배지인 C5467의 ROS 제거속도를 측정한 결과 MEM-a가 C5467보다 ROS 제거 속도가 빨랐다(Fig.
먼저 비적응 세포가 무혈청 배지로 옮겨지면서 받는 스트레스를 측정하기 위해 혈청이 5% 첨가된 MEM-a에서 배양하던 세포를 무혈청 배지인 C5467로 옮기고 ROS를 측정하였다(Fig. 5). 그 결과 세포를 혈청 배지에서 무혈청배지로 옮기게 되면 세포 내 ROS가 약 33.
증식력을 개선시키고자 하였다. 먼저 혈청의 유무가 비적응 CHO 세포의 계대배양에 미치는 영향을 알아보기 위해 혈청을 농도별로 첨가하고 세포의 농도를 비교하였다. 또한 무혈청 배지에서 세포가 받는 스트레스를 알아보기 위해 ROS (radical oxygen species) 농도를 측정하였고, 세포 고사 (apoptosis)의 유무를 FACS (fluorescence activated cell sorter) 를 이용해 알아봤다.
무혈청 배지에서 비적응 세포의 증식이 멈추는 이유가 세포사멸이 아닌 세포주기의 정지에 의한 것인지 좀 더 명확하게 밝히기 위해, 무혈청 배지에서 증식이 멈춘 세포를 다시 혈청이 5% 첨가된 MEM-a 와 IGF-I 25 ng/ml이 첨가된 무혈청 배지로 옮겨서 재배양하고 증식곡선을 구했다.
무혈청 배지에서 세포가 받는 스트레스의 정도를 알아보고 배양 환경과 첨가물에 따른 ROS 농도의 변화를 측정하기 위해 배지와 세포의 ROS 농도를 측정하였다. ROS 농도를 측정한 결과 무혈청 상태에서 세포 내 ROS가 엄청난 양으로 증가하는 것을 알 수 있었다.
비적응 CHO 세포를 별도의 적응기간 없이 바로 무혈청배지에서 배양을 시작하고 계대 수를 신속히 증가시키기 위해 48시간에 한 번씩 계대하여 증식곡선을 작성하였다. Fig.
세포 내 ROS를 측정하기 위해 FACS를 사용하였다. 배양된 세포를 수거하고 PBS로 수세한다.
앞선 결과에서 나타난 것처럼 혈청이 세포의 증식에 결정적인 역할을 하기 때문에, 혈청이 배지에 있는 ROS 농도에 미치는 영향을 알아보기 위해 혈청을 첨가하지 않은 경우와 첨가한 경우 배지의 ROS 제거 속도를 측정했다. 그러나 측정 결과 혈청의 첨가가 배지에 있는 ROS의 제거에는 크게 영향을 미치지 않는 것을 알 수 있었다(Fig.
따라서 세포의 스트레스에 가장 영향을 미치는 인자로 활성산소를 고려하였으며 세포 내 . 외의 ROS 농도를 측정하여 세포에 축적되는 스트레스의 정도를 알아보고 ROS가 세포의 계대배양에 미치는 영향을 조사했다.
원심분리해서 상등액을 제거하고 PBS 100 出로 재현탁시킨 다음 Annexin V-FITC와 propidium iodide를 각각 5 ul씩 첨가하고 상온에서 15분간 방치한 후 FACS를 이용해 형광을 읽는 방법으로 세포고사를 측정했다.
이러한 ROS의 증가가 세포의 DNA 손상을 유발하거나 세포사멸 (apoptosis)을 유발하는지 또한 무혈청 배지에서 세포의 증식이 멈추는 것이 세포사멸 때문인지, 아니면 단순히 세포주기 (cell cycle)가 멈추는 것인지 확인하기 위해 5회 이상 무혈청 배지에서 계대가 진행된 적응세포와 비적응세포를 대상으로 apoptosis detection을 시행하였다.
또한 혈청 배지와 무혈청 배지에서 CHO 세포의 유전자 발현변화를 측정한 이전의 연구 결과에 따르면 IGF-I의 발현이 무혈청 배지에서 2배 이상 감소하는 것으로 나타났다 (32). 이러한 이유로 해서 무혈청 배지에 IGF-I을 첨가하고 세포의 증식력에 차이가 나타나는지 측정했다.
이런 스트레스 때문에 세포 내 ROS의 양이 증가하고 세포주기가 멈춰 세포의 증식이 멈추게 되는 것이다. 이를 보완하기 위해 세포 주기의 진행을 돕는 것으로 알려진 IGF-I을 배지에 첨가하고 세포의 증식에 차이가 있는지 확인하였다.
22% sodium bicarbonate, 320 nM methotrexate (MTX, Sigma)> 첨가한 MEM-a (Gibco BRL) 배지를 기본 배지로 하여 37℃, 5% CO2 습윤 배양기에서 하였고 세포의 농도가 5 X 105 cells/ml 되도록 하여 계대 배양하며 실험에 사용하였다. 장기배양 실험은 계대 수를 신속히 증가시키기 위해 2일에 한번씩 계대 배양하는 방법을 사용하였다.
대상 데이터
PeroxiDetect Kit, catechin, 2, 6-Di-tert-butyl-p-cresol (BHT)는 Sigma에서 구입해서 사용했고, L-a-Lysophosphatidylcholine (LPC)는 두산바이오텍, insulin-like growth factor l(IGF-I)은 JRH bioscience 의 LongReIGF-I 을 사용하였다. Apoptosis detection kit는 BD Pham血gen 의 Annexin V-FITC apoptosis detection kit I을 구입해서 사용했다
사용하였다. PeroxiDetect Kit, catechin, 2, 6-Di-tert-butyl-p-cresol (BHT)는 Sigma에서 구입해서 사용했고, L-a-Lysophosphatidylcholine (LPC)는 두산바이오텍, insulin-like growth factor l(IGF-I)은 JRH bioscience 의 LongReIGF-I 을 사용하였다. Apoptosis detection kit는 BD Pham血gen 의 Annexin V-FITC apoptosis detection kit I을 구입해서 사용했다
Sigma사의 PeroxiDetect Kit를 이용해서 배지내 ROS를 측정하였다. peroxides가 Fe2+ 이온을 Fe3+ 이온으로 변환시키면 Fe3 + 이온이 xylenol orange와 결합해서 발색이 되고, 발색된 용액을 560 nm에서 읽는 방법으로 측정하였다(29).
무혈청 배지는 Sigma의 CHO 세포용 무혈청 배지인 CHO protein free medium, C5467을 사용하였다. PeroxiDetect Kit, catechin, 2, 6-Di-tert-butyl-p-cresol (BHT)는 Sigma에서 구입해서 사용했고, L-a-Lysophosphatidylcholine (LPC)는 두산바이오텍, insulin-like growth factor l(IGF-I)은 JRH bioscience 의 LongReIGF-I 을 사용하였다.
본 실험에서 사용한 세포주는 확립된 DG44 세포주에 재조합시킨 세포주 S/CHO hu-17 A3로서, DHFR (dihydrofolate reductase) selection system을 이용하여 B형 간염 바이러스의 surface antigen에 특이적으로 결합하는 항체를 생산하는 세포주이다. 발현벡터는 CMV promoter를 가지고 있으며, 항체의 heavy chain과 light chaine 각각 별도의 발현 벡터로 구성되어 있다.
세포의 배양은 5% dialyzed fetal bovine serum (dFBS, Gibco BRL), 0.22% sodium bicarbonate, 320 nM methotrexate (MTX, Sigma)> 첨가한 MEM-a (Gibco BRL) 배지를 기본 배지로 하여 37℃, 5% CO2 습윤 배양기에서 하였고 세포의 농도가 5 X 105 cells/ml 되도록 하여 계대 배양하며 실험에 사용하였다. 장기배양 실험은 계대 수를 신속히 증가시키기 위해 2일에 한번씩 계대 배양하는 방법을 사용하였다.
lipofection 법을 사용하여 벡터를 도입한 것으로, 전통적인 G418 항생제사용 선발 및 MTX 농도 증가 방법으로 유전자 증폭을 실시하면서 고발현 세포주만을 선발한 세포주이다(28). 이 세포주는 B형 간염 바이러스 중화를 위해 간염바이러스의 표면 항원인 S protein에 대한 마우스 항체를 기초로 하여 CDR grafting 방법으로 인간화된 항체를 발현하는 세포주로서, 한양대에서 분양받아 사용하였다.
성능/효과
사용되고 있다. CH0 세포가 숙주세포로 널리 사용된 주된 이유는 첫째, Polio, Herpes, Hepatitis B, HIV, Measles, Adenovirus 등의 인간에 해로운 바이러스가 CHO 세포에서는 복제가 되지 않으므로 안전하고, 둘째, 부유 배양이 가능해 대량 배양이 용이하며, 셋째, 효율적인 유전자 증폭 시스템이 있어 미생물에 비해 낮은 동물세포주의 단위 세포당 생산성을 높일 수 있다는 장점이 있다. 현재 대부분의 동물세포이용 재조합 단백질 생산은 CHO 세포를 이용하고 있으며, 국내에서 개발 중인 인간유래 치료용 단백질의 대부분 또한 CHO 세포의 현탁 배양기술을 기반으로 하고 있다(1-3).
ROS 농도를 측정한 결과 무혈청 상태에서 세포 내 ROS가 엄청난 양으로 증가하는 것을 알 수 있었다. 이것은 혈청이 항산화 능력을 갖고 있어서가 아니라 세포가 무혈청 환경에서 극심한 스트레스상태에 놓이기 때문인 것으로 생각된다.
7). 계대 횟수에 따라 ROS의 양이 증가하지는 않았고 혈청 배지에서 무혈청 배지로 처음 옮겼을 때 ROS가 가장 많이 증가하고 그 이후 일정하게 유지되는 것을 알 수 있었다. 이것은 세포가 필요한 항산화 효소를 생산하여 무혈청 배지의 환경에 적응하기 때문으로 생각되었다.
5). 그 결과 세포를 혈청 배지에서 무혈청배지로 옮기게 되면 세포 내 ROS가 약 33.5배 이상 증가하는 것으로 나타났다. 이는 급격한 배양 환경의 변화가 세포에 과도한 스트레스를 유발한다는 것을 의미한다.
10A). 그러나 장기간 배양에서 IGF-I을 첨가한 경우 더 오랫동안 계대배양이 가능했고 세포의 농도 또한 비교적 안정적으로 유지되는 것을 알 수 있었다(Fig. 10B). 즉 IGF-I의 첨가로 단기적인 증식 촉진 효과를 볼 수는 없었지만 장기적인 배양에서 세포의 증식을 안정적으로 유지시켜 준다는 것을 알 수 있었다.
측정했다. 그러나 측정 결과 혈청의 첨가가 배지에 있는 ROS의 제거에는 크게 영향을 미치지 않는 것을 알 수 있었다(Fig. 4B).
1에서와 같이 무혈청 배지에서 계대가 진행될수록 세포가 더 이상 증식하지 못하는 것을 알 수 있다. 또한 5회 이상 계대가 이어질 경우 급격한 세포 수의 감소가 나타나는 것을 알 수 있었다. 반복 실험을 통하여 비적응 CHO 세포의 경우 무혈청 배지에서 대체로 5-7회의 계대 배양이 가능함을 알 수 있었다.
이는 급격한 배양 환경의 변화가 세포에 과도한 스트레스를 유발한다는 것을 의미한다. 또한 혈청 배지 인 MEM-a와 무혈청 배지인 C5467에서 모두 혈청의 농도에 따라 ROS의 농도 역시 변하는 것을 알 수 있었다(Fig. 6). 앞선 결과에서(Fig.
무혈청 배지는 혈청대체 성분이 다량 첨가되어 있기 때문에 같은 농도의 혈청이 첨가된 경우 MEM-a와 비교했을 때 우수한 증식 능력을 보였으나, 역시 무혈청 배지에서도 혈청의 농도가 높을수록 세포의 증식이 활발히 일어나는 것을 알 수 있었다(Fig. 2).
나타났다. 무혈청 배지에 혈청을 농도별로 첨가하고 계대배양을 한 결과 혈청이 1% 이상 첨가된 경우 10회 이상 계대가 진행되는 것을 확인할 수 있었다(Fig. 3).
또한 5회 이상 계대가 이어질 경우 급격한 세포 수의 감소가 나타나는 것을 알 수 있었다. 반복 실험을 통하여 비적응 CHO 세포의 경우 무혈청 배지에서 대체로 5-7회의 계대 배양이 가능함을 알 수 있었다. 반면에 무혈청 배지에 적응된 CHO 세포의 경우에는 별다른 문제없이 장기간 배양이 가능하였다(Data not shown).
배지의 종류와 혈청의 유무에 따라 세포내에서 생성되는 ROS의 제거 속도를 비교한 결과 무혈청 배지에서 세포 내 ROS의 제거 속도가 비교적 더딘 것으로 예비 실험을 통하여 확인 됐다. 따라서 배지의 ROS 제거 능력이 세포의 증식에 미치는 영향을 좀 더 명확하게 밝히기 위해 배지의 종류와, 혈청의 첨가 여부, 계대 시간 등에 따른 세포 내 ROS의 농도를 FACS를 이용하여 측정하였다.
앞선 결과에서 세포를 무혈청 배지로 옮겨서 배양할 경우 세포 내 ROS가 급격하게 증가한다는 것을 알 수 있었다. 이러한 ROS의 증가가 세포의 DNA 손상을 유발하거나 세포사멸 (apoptosis)을 유발하는지 또한 무혈청 배지에서 세포의 증식이 멈추는 것이 세포사멸 때문인지, 아니면 단순히 세포주기 (cell cycle)가 멈추는 것인지 확인하기 위해 5회 이상 무혈청 배지에서 계대가 진행된 적응세포와 비적응세포를 대상으로 apoptosis detection을 시행하였다.
6). 앞선 결과에서(Fig. 4B) 혈청 자체가 갖는 ROS 제거 능력은 아주 미미하다는 것을 알 수 있었다. 그러나 세포 내 ROS를 측정한 결과 혈청의 농도에 따라 세포 내 ROS의 농도가 현저히 감소하는 것은 혈청이 부족 할수록 세포가 받는 스트레스가 증가하는 것을 의미하며, 이는 배지에 항산화제를 직접 첨가한 경우에도 계대 배양 횟수가 크게 증가하지 않는 것으로 미루어 볼 때(Fig.
이 결과로 미루어 볼 때 정지된 세포 주기를 다시 진행시킬 수 있는 물질을 배지에 첨가한다면 세포의 계대 횟수를 증가시키는데 효과가 있을 것으로 생각되었다.
이런 결과로 미루어 볼 때 무혈청 배지에 혈청을 대체할 수 있는 성분을 더 첨가해야만 세포의 계대 배양 횟수가 10회 이상으로 길어질 것으로 판단되었다.
10B). 즉 IGF-I의 첨가로 단기적인 증식 촉진 효과를 볼 수는 없었지만 장기적인 배양에서 세포의 증식을 안정적으로 유지시켜 준다는 것을 알 수 있었다. 이는 IGF-I。] 혈청의 부재에서 오는 증식 신호의 부족을 어느 정도 상쇄해주는 역할을 하기 때문인것으로 생각된다.
그래서 몇 가지 첨가물을 이용해 세포의 증식력에 변화가 나타나는지 알아보았다. 첨가물을 이용한 실험에서 IGF-I의 경우 장기간 배양에서 세포의 수를 안정적으로 유지하고 계대 횟수를 증가시키는 효과를 보였다. 이는 IGF-I이 어느정도 세포의 증식을 유지시켜주는 역할을 하기 때문인 것으로 생각된다.
차이가 있는지 알아봤다. 혈청 배지인 MEM-a와 무혈청 배지인 C5467의 ROS 제거속도를 측정한 결과 MEM-a가 C5467보다 ROS 제거 속도가 빨랐다(Fig. 4A) 이는 세포가 만들어내는 ROS가 MEM-a에서 더 효과적으로 제거될 수 있다는 것을 의미하고 무혈청 배지인 C5467에 ROS scavenger를 첨가하여 ROS 제거능을 강화시켜 줄 필요가 있을 것으로 생각된다(20).
후속연구
뿐만 아니라 무혈청 배지에서는 혈청을 포함한 배지에서보다 세포 사멸 및 배양 중 축적되는 독성물질에 의해서 세포 성장 속도 및 생존율 감소가 유발되고 이에 따른 생산성 저하와 숙주세포단백질의 유출로 인해 산물 생산이 안정적이지 못한 점이 보고 되고 있다(16). 그러므로 효과적으로 산업적 대량 생산을 하기 위해서는 CHO 세포의 현탁 배양 기술을 기반으로 하여 자체적으로 좀 더 개선된 무혈청 배지를 개발하며, 다양한 세포주의 무혈청 배지 적응 (adaptation) 기술, 그리고 고효율현탁 배양 기술의 기반 확보, 개발한 무혈청 배지의 검증기술의 확보 등이 필요하다. 특히 대부분의 경우 세포를 무혈청 배지에서 바로 배양할 수 없기 때문에 별도의 적응 기간을 거치게 된다.
위와 같은 현상들은 모두 혈청이 없기 때문에 발생하는 것으로 혈청을 대체할 수 있는 첨가물을 배지에 더 해주면 세포의 증식이 개선될 것이다. 그래서 몇 가지 첨가물을 이용해 세포의 증식력에 변화가 나타나는지 알아보았다.
이것은 혈청이 항산화 능력을 갖고 있어서가 아니라 세포가 무혈청 환경에서 극심한 스트레스상태에 놓이기 때문인 것으로 생각된다. 이렇듯 증가한 ROS가 세포의 증식이 멈추게 되는 원인 중 하나로 생각되고, 항산화제를 첨가한 경우에도 증식력이나 ROS의 농도에 큰 차이가 없었던 것으로 미루어 보아 근본적으로 혈청과 같은 강력하게 증식을 촉진하는 성분을 배지에 첨가해야 할 것으로 여겨진다.
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