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문제 정의
- MEM-a 배지에 투과성 및 비투과성 첨가제를 이용해 동결보존에서 생존율을 높이는 실험을 진행하는 것과 동시에 상용화된 무혈청 배지와 무혈청 동결보존제를 이용한 동결보존이 혈청 배지를 이용한 동결보존을 대체할 수 있는지 확인하였다. 시판중인 무혈청 배지를 이용하여 CHO 세포를 각각의 무혈청 배지에 적응시킨 후, 각각의 배지에 10% DMSO를 첨가하여 동결 및 해동 후 생존율을 측정하였다.
- 또한 해동용액의 혈청 첨가여부가 세포의 생존율에 어떠한 영향을 미치는지 알아보기 위한 실험을 동시에 진행하였다. Brockett의 실험에서 해동용액의 조성이나 해동 온도가 동결된 세포의 생존율에 영향을 주는 것으로 나타났으며(40), 본 실험에서는 혈청 배지와 무혈청 배지의 해동 능력을 평가하였다.
- 그러나 무혈청 환경에서 배 양되는 세포주를 이용하여 생물의 약품을 생산하는 공정에 사용되는 세포주의 경우는 교차오염 방지를 위해 동결보존 역시 혈청을 제거한 상태에서 실시되어야 한다. 본 실험은 무혈청 동결보존이 CHO 세포에 어떠한 영향을 미치는지 알아보기 위하여 실시되었다. 우선, 무혈청 동결보존에서 세포 생존율을 높이기 위해 투과성 및 비투과성 첨가제를 배지에 첨가하는 방법으로 동결보존 및 해동하여 생존율을 측정하였다.
- 세포주의 종류에 따라 달라지는 배지의 종류나 배양 방법처럼 무혈청 배지를 이용한 동결보존 역시 기존의 동결보존 방법과는 다른 조건으로 진행해야 하고, 그 안정성이 검증되어야 할 것이다. 위와같은 이유로본실험은무혈청 배지를 이용한 CHO 세포동결보존의 세포주 보존능력과 유전자 안정성을 확인하여, 무혈청 배지를 이용한 동결보존방법을 확립하고 안정성을 검증하기 위하여 진행하였다. 혈청은 동결보존에 있어 비투과성 동결보존제로 사용되고, 급속한 삼투압 변화를 완충시키 는 역할을 하는데(11), 실험의 첫 단계로 혈청이 제거된 상태의 동결보존이 CHO 세포의 생존율에 미치는 영향을 확인하기 위해 혈청 농도에 따른 동결보존을 통해 생존율을 확인하였다.
- 이는 cGMP의 개념에 맞지 않으며, 문제가 될 수도 있는 부분이기도 하다(44). 이에 본 실험은무혈청 배지를 이용한 동결보존이 세포주의 안정성에 어떠한 영향을 미치는지 알아보기 위해 진행되었다. 무혈청배지를 이용한 동결보존의 다양한 실험 결과, 약 2년간의 동결보존에는 무혈청 배지를 사용하는 방법이 혈청을 사용하는 동결보존을 대체할 수 있을 것으로 판단되고, 무혈청 환경의 생물공정에서 사용되는 세포주 동결보존에서 혈청에 의한 교차오염 방지할 수 있을 것으로 생각된다.
제안 방법
- 또한 해동용액의 혈청 첨가여부가 세포의 생존율에 어떠한 영향을 미치는지 알아보기 위한 실험을 동시에 진행하였다. Brockett의 실험에서 해동용액의 조성이나 해동 온도가 동결된 세포의 생존율에 영향을 주는 것으로 나타났으며(40), 본 실험에서는 혈청 배지와 무혈청 배지의 해동 능력을 평가하였다. 동결 및 해동 조건에 대한 실험 결과, 모든 조건의 과정에서 기존의 배양배지를 이용한 동결보존의 경우와 거의 차이가 없는 약 90% 이상의 생존율을 보였다.
- 비교하였다. CHO Protein-free Medium (Sigma, C5467), CHO Medium, Chemically-defined, Animal Component-free (Sigma, C4726), CHO Serum-free Medium (Sigma, C1707), Protein-free CHO Medium (JBI, PF486), Serum-free CHO Medium (JBI, SF486) 등의 무혈청 배지를 사용하여 동결보존 실험을 진행하였으며(33), 무혈청 배지에 대한 적응과 동결 및 해동은 위 방법을 따랐다.
- 능력을 측정하였다. MEM-a 배지에 FBS를 20%, 10%, 5%, 2%, 1%, 0%로 첨가하여 동결보존하고, 7일 후 해동하여 생존율을 측정하였다.
- PCR 조건은 initial denaturation 95℃, 5분을 실시한 후, denaturation 95℃, 30초, annealing 57℃, 30초, extension 7 2℃, 30초의 cycle을 35회 실시하고, final extension 72℃, 5 분을 진행하였다. CHO DHFR primer는 NCBI database* 이용하여 PRIMER3 software 로 디자인하였으며, 모든 product의 크기는 200 bp 내외로 하였다.
- Real-time PCRe 준비된 cDNA 2 以와 2x Supennix iTaq (Bio-Rad) 25 以, 10 pm(시成 primer set (Bioneer) 1 成를 혼합하고 총 volume이 50 以가 되도록 DEPC-treated water로 조절한 후, iCycler iQ system을 이용하여 Ct 값을 측정하였다. PCR 조건은 initial denaturation 95℃, 5분을 실시한 후, denaturation 95℃, 30초, annealing 57℃, 30초, extension 7 2℃, 30초의 cycle을 35회 실시하고, final extension 72℃, 5 분을 진행하였다.
- 5 队 M-MLV reverse transcriptase 200 units, 50 pmol//z£ 이igo-dT 1 必를 혼합하고, DEPC-treated water로 총 volume0] 25 成 가 되도록 조절하였다. cDNA 증폭은 iCycler iQ system (Bio Rad) 을 이용하였으며, extension 37 ℃, 60 분, denaturation 95℃, 5분을 진행하였다.
- cDNA 합성은 total RNA 5 陽과 5x M-MLV reaction buffer 5 队 10 mM dNTP 4 队 100 mM DTT 2.5 队 M-MLV reverse transcriptase 200 units, 50 pmol//z£ 이igo-dT 1 必를 혼합하고, DEPC-treated water로 총 volume0] 25 成 가 되도록 조절하였다. cDNA 증폭은 iCycler iQ system (Bio Rad) 을 이용하였으며, extension 37 ℃, 60 분, denaturation 95℃, 5분을 진행하였다.
- 다양한 세포주에 대한 무혈청 배지의 동결보존 능력을 알아보기 위하여 CHO DG44, CHO DUKX, HDF와 B16F10 세포주를 이용하여 동결보존한 후, 혈청배지를 이용한 동결보존과 생존율을 비교하였다. 무혈 청 동결보존액으로는 C5467 배지에 10% DMSO를 첨가하여 사용하였으며, 대조군으로 기존의 5% 혈청 배지에 10% DMSO를 첨가하여 동결보존 하였다.
- 다양한 세포주에 대한 무혈청 배지의 동결보존의 능력을 비교하기 위하여 무혈청 배지에 대한 적응과정 없이 CHO DG44, CHO DUKX, HDF, B16F10 등의 세포주를 10% DMSO가 첨가된 C5467 무혈청 배지에 동결보존 하였다. 또한 해동용액의 혈청 첨가여부가 세포의 생존율에 어떠한 영향을 미치는지 알아보기 위한 실험을 동시에 진행하였다.
- 동결보존 과정에서 비투과성 동결보존제로 사용되는 혈청의 중요성을 확인하기 위하여 혈청의 농도에 따른 동결보존 능력을 측정하였다. MEM-a 배지에 FBS를 20%, 10%, 5%, 2%, 1%, 0%로 첨가하여 동결보존하고, 7일 후 해동하여 생존율을 측정하였다.
- 동결보존 방법은 5.0 X 106 cells/诫 농도의 세포를 각 농도의 FBS가 첨가된 배지에 10% DMSO를 첨가하여 동결 vial에 1 I戒씩 넣어 보존하였다. 동결 viale isopropanol0] 담긴 cryocontainer에 넣어 -70℃에서 overnight하고, 다시 -196℃ 액체질소에 보관하여, 약 -l℃/min의 속도로 온도를 낮췄다.
- 해동 방법은 질소탱크에서 vial을 꺼내어 37℃ water bath에서 녹인 후' 10배 volume의 새 배지에 loading 하여 DMSO를 희석하고, 원심분리하여 세포를 resuspension 하였다. 동결보존 후, CHO 세포의 생존율은 trypan blue를 이용해 측정하였다(12).
- 혈청은 동결보존에 있어 비투과성 동결보존제로 사용되고, 급속한 삼투압 변화를 완충시키 는 역할을 하는데(11), 실험의 첫 단계로 혈청이 제거된 상태의 동결보존이 CHO 세포의 생존율에 미치는 영향을 확인하기 위해 혈청 농도에 따른 동결보존을 통해 생존율을 확인하였다. 두 번째로 혈청을 대체하기 위한 다양한 동결보존제와 무혈청 배지를 사용한 동결보존에서 CH0 세포의 생존율을 비교하고, 무혈청 배지 자체의 동결보존 능력을 검증하기 위하여 다양한 세포주를 이용하여 동결보존 후의 생존율을 비교하였다(29). 또한, 무혈청 배지를 이용한 장기간 동결보존이 세포에 미치는 영향을 알아보기 위해 세포 생존율과 성장 회복율을 측정하였고, real-time RT-PCR을 통해 삽입 유전자에 대한 안정 성을 측정 하여, 혈청배지를 이용한 장기간 동결보존과 비교하였다(30).
- 두 번째로 혈청을 대체하기 위한 다양한 동결보존제와 무혈청 배지를 사용한 동결보존에서 CH0 세포의 생존율을 비교하고, 무혈청 배지 자체의 동결보존 능력을 검증하기 위하여 다양한 세포주를 이용하여 동결보존 후의 생존율을 비교하였다(29). 또한, 무혈청 배지를 이용한 장기간 동결보존이 세포에 미치는 영향을 알아보기 위해 세포 생존율과 성장 회복율을 측정하였고, real-time RT-PCR을 통해 삽입 유전자에 대한 안정 성을 측정 하여, 혈청배지를 이용한 장기간 동결보존과 비교하였다(30).
- 0 X 106 cells/靦 농도로 동결보존하고 3, 6, 12, 18 개월 후, 해동하여 생존율을 확인하였다. 또한, 장기간 동결보존이 유전자에 미치는 영향을 알아보기 위하여 real-time RT-PCR을 통해 삽입 DHFR 유전자의 안정성을 평가하였다. 동결보존에 사용한 배지는 무혈청 배지로 C5467을 사용하고, 대조군으로 혈청 배지와 CAN-1000을 사용하였으며, 유전자 안정성을 평가하기 위한 실험은 아래의 방법을 따랐다.
- 무혈 청 동결보존액으로는 C5467 배지에 10% DMSO를 첨가하여 사용하였으며, 대조군으로 기존의 5% 혈청 배지에 10% DMSO를 첨가하여 동결보존 하였다. 또한, 해동용액이 생존율에 미치는 영향을 비교하기 위하여 무혈청 배지와 혈청 배지를 이용하여 동결보존 한 세포주를 각각 무혈청 배지와 혈청 배지에 해동하여, 생존율을 비교하였다.
- 이는 무혈청 동결보존제의 동결보존 능력보다 우수한 결과이다. 마지막으로 무혈청 배지를 이용한 장기간 동결보존에서 CHO 세포의 안정성을 확인하기 위하여 무혈청 배지로 동결보존된 CHO 세포를 3개월 단위로 해동하여 생존율 및 성장 회복율을 측정하고, real-time RT-PCR을 통해 삽입된 CHO DHFR 유전자의 안정성을 평가하였다. 혈청배지와 비교할 때, 생존율과 성장 회복율, 유전자 안정성 측면에서 모두 동일한 결과를 보여, 무혈청 배지를 이용한 18개월 이상의 동결보존이 안정적임을 검증할 수 있었다.
- 생존율을 비교하였다. 무혈 청 동결보존액으로는 C5467 배지에 10% DMSO를 첨가하여 사용하였으며, 대조군으로 기존의 5% 혈청 배지에 10% DMSO를 첨가하여 동결보존 하였다. 또한, 해동용액이 생존율에 미치는 영향을 비교하기 위하여 무혈청 배지와 혈청 배지를 이용하여 동결보존 한 세포주를 각각 무혈청 배지와 혈청 배지에 해동하여, 생존율을 비교하였다.
- 무혈청 배지 종류에 따른 동결보존 능력과 안정성을 비교하기 위해 시판중인 무혈청 배지를 이용하여 생존율과 회복율을 비교하였다. CHO Protein-free Medium (Sigma, C5467), CHO Medium, Chemically-defined, Animal Component-free (Sigma, C4726), CHO Serum-free Medium (Sigma, C1707), Protein-free CHO Medium (JBI, PF486), Serum-free CHO Medium (JBI, SF486) 등의 무혈청 배지를 사용하여 동결보존 실험을 진행하였으며(33), 무혈청 배지에 대한 적응과 동결 및 해동은 위 방법을 따랐다.
- 무혈청 배지를 이용한 장기간 동결보존이 CHO 세포에 미치는 영향을 알아보기 위해 세포를 5.0 X 106 cells/靦 농도로 동결보존하고 3, 6, 12, 18 개월 후, 해동하여 생존율을 확인하였다. 또한, 장기간 동결보존이 유전자에 미치는 영향을 알아보기 위하여 real-time RT-PCR을 통해 삽입 DHFR 유전자의 안정성을 평가하였다.
- 무혈청 배지에 대한 세포주의 적응은 2.0 X 105 cells/畝 농도의 세포에 기존의 5% fetal bovine serum (FBS, GibcoBRL), 2.2% sodium bicarbonate, 320 nM MTX를 첨가한 MEM-a (GibcoBRL) 배지와 무혈청 배지가 1 : 1로 혼합된 배지를 사용하여 1.0 X io6 cells/畝 농도가 되도록 배양하였고, 배지를 각각 1 : 3, 1 : 7의 비율로 혼합하여 순차적으로 적응시켰다. 적응된 CHO 세포의 배양에는 320 nM MTX 가 첨가된 CHO Protein-free Medium (Sigma, C5467)을 사용하였고, 대조군으로 기존의 혈청 배지를 사용하여 37℃, 5% CO2 습윤 배양기에서 배양하였다.
- 무혈청 배지의 동결보존 능력을 확인한 후, 장기간 동결보존에 있어서의 유전적 안정성을 평가하기 위하여 10% DMS0가 첨가된 무혈청 배지로 동결보존된 세포주를 3개월 단위로 해동하여 생존율과 성장 회복율을 확인하고, real-time RT-PCR을 통해 유전적 안정성을 확인하였다. 우선, 장기간 동결보존에 따른 생존율의 변화에 대한 실험의 경우, 무혈청 배지나 혈청 배지를 사용한 동결보존에서 18 개월 동안 90% 이상의 생존율을 유지하고 있음을 확인할 수 있었다.
- 확인하였다. 시판중인 무혈청 배지를 이용하여 CHO 세포를 각각의 무혈청 배지에 적응시킨 후, 각각의 배지에 10% DMSO를 첨가하여 동결 및 해동 후 생존율을 측정하였다. 그 결과 무혈청 배지를 이용한 동결보존에서 모두 94% 이상의 우수한 동결보존 능력을 보였으며, C5467이나 SF486, PF486을 이용한 경우에는 10% 혈청을 이용한 동결보존과 거의 동일한 97% 이상의 생존율을 나타냈다.
- 본 실험은 무혈청 동결보존이 CHO 세포에 어떠한 영향을 미치는지 알아보기 위하여 실시되었다. 우선, 무혈청 동결보존에서 세포 생존율을 높이기 위해 투과성 및 비투과성 첨가제를 배지에 첨가하는 방법으로 동결보존 및 해동하여 생존율을 측정하였다. 그 결과, 10% DMSO와 0.
- 이처럼 혈청은 동결보존에 있어 비투과성 동결보존제, heat shock protein 전구체, 항산화제 등의 기능을 함으로써 세포의 저온손상을 최소화하는 등 중요한 역할을 한다. 이러한 결과를 바탕으로 혈청을 대체할 수 있는 첨가제를 선별하고, 혈청을 제거한 상태에서 이를 첨가하는 방법으로 무혈청 동결보존에 대한 실험을 진행하였다.
- 0 X io6 cells/畝 농도가 되도록 배양하였고, 배지를 각각 1 : 3, 1 : 7의 비율로 혼합하여 순차적으로 적응시켰다. 적응된 CHO 세포의 배양에는 320 nM MTX 가 첨가된 CHO Protein-free Medium (Sigma, C5467)을 사용하였고, 대조군으로 기존의 혈청 배지를 사용하여 37℃, 5% CO2 습윤 배양기에서 배양하였다.
- 첨가제를 선택하기 위한 실험에 사용된 동결보존 용액은 MEM-a 배지를 기본으로 세포막 투과성인 DMSO, glycerol, methanol과 비 투과성 인 sucrose, lactose, raffinose, trehalose, sorbitol을 동시에 첨가하여 동결보존 및 해동 후 생존율을 비교하였다. 비투과성 첨가제는 70℃에서 녹인 후, 0.
- 또한, 무혈청 배지를 이용한 동결보존의 경우, 3 년 후의 동결보존 안정성에 대한 실험이 진행되었지만, 30% 이하의 생존율을 보이는 결과가 나타났다(43). 하지만, 동결보존 기간에 따른 장기간 동결보존에 대한 검증이 진행되지 않았으므로, 무혈청 배지로 동결보존된 CHO 세포의 생존율 및 성장 회복율을 측정하고, 유전적 안정성을 확인하는 실험을 진행하였다.
- (23-27). 하지만, 이러한 결과만으로는 무혈청 배지가 지니고 있는 동결보존제로서의 능력을 평가할 수 없으므로, 다양한 세포주에 대한 동결보존 및 해동 실험을 추가적으로 진행하였다.
- 위와같은 이유로본실험은무혈청 배지를 이용한 CHO 세포동결보존의 세포주 보존능력과 유전자 안정성을 확인하여, 무혈청 배지를 이용한 동결보존방법을 확립하고 안정성을 검증하기 위하여 진행하였다. 혈청은 동결보존에 있어 비투과성 동결보존제로 사용되고, 급속한 삼투압 변화를 완충시키 는 역할을 하는데(11), 실험의 첫 단계로 혈청이 제거된 상태의 동결보존이 CHO 세포의 생존율에 미치는 영향을 확인하기 위해 혈청 농도에 따른 동결보존을 통해 생존율을 확인하였다. 두 번째로 혈청을 대체하기 위한 다양한 동결보존제와 무혈청 배지를 사용한 동결보존에서 CH0 세포의 생존율을 비교하고, 무혈청 배지 자체의 동결보존 능력을 검증하기 위하여 다양한 세포주를 이용하여 동결보존 후의 생존율을 비교하였다(29).
- 혈청을 대체하기 위한 각종 투과성, 비투과성 동결보존첨가제와 무혈청 동결보존 용액, 무혈청 배지가 세포의 생존율에 미치는 영향을 비교하여 최적화된 조건을 설정하였다(32). 실험에 사용된 첨가제는 FDA의 21CFR610을 고려하여 USP에 수록된 물질을 중심으로 선택하였다.
- 혈청을 제거한 상태의 동결보존에서 생존율을 확보하기 위해 우선 세포농도에 따른 생존율을 비교하여 최적의 세포 농도를 결정하고, 다양한 투과성, 비투과성 동결보존제를 첨가하여 동결보존 후의 생존율을 비교하였다.
대상 데이터
- 다양한 동물세포에 대한 무혈청 배지의 동결보존 능력을 알아보기 위한 실험에 사용된 human dermal fibroblast (HDF)와 mouse melanocyte (B16F10)는 10% FBS가 첨가된 DMEM에서 배양하였고, CHO DG44와 CHO DUKX 세포주는 5% FBS가 첨가된 MEM-a 배지에서 위의 조건으로 배양하였다.
- 또한, 장기간 동결보존이 유전자에 미치는 영향을 알아보기 위하여 real-time RT-PCR을 통해 삽입 DHFR 유전자의 안정성을 평가하였다. 동결보존에 사용한 배지는 무혈청 배지로 C5467을 사용하고, 대조군으로 혈청 배지와 CAN-1000을 사용하였으며, 유전자 안정성을 평가하기 위한 실험은 아래의 방법을 따랐다.
- 무혈청 동결보존 용액을 이용한 동결보존은 시판중인 CAN-1000 (Genemed) 제품을 사용하였으며, 동결방법은 제품의 사용방법을 따랐다. 즉, 5.
- 본 실험에서는 CHO DG44 세포주에 dihydrofolate reductase (DHFR) selection system을 적용하여 재조합한 S/CHO hu-17 A3 세포주를 한양대학교에서 분양받아 사용하였다. 이 세포주에는 DHFR 유전자가 벡터와 함께 삽입되어 있어, methotrexate (MTX) 농도 증가 방법으로 DHFR 발현 세포주를 선별할 수 있다(31).
- 실험에 사용된 첨가제는 FDA의 21CFR610을 고려하여 USP에 수록된 물질을 중심으로 선택하였다.
이론/모형
- 배양된 세포는 TRIzol® kit (Invitrogen)를 이용하여 total RNA를 분리하였으며, 분리방법은 제품의 사용법을 따랐다.
성능/효과
- 이는 DMSO와 이ycerol이 투과성 동결보존제로 작용하여 일차적으로 생존율을 유지할 수 있는 것을 나타내며, 첨가제 농도에 따른 세포독성은 Nelson의 실험에 의해 이미 확인되었다(38). DMSO와 glycerol 등의 투과성 동결보존제만을 사용한 경우에, 비투과성 첨가제를 사용하지 않더라도 40-50% 정도의 생존율을 확보할 수 있었지만, 기존의 혈청을 이용한 동결보존 방법으로는 95% 이상의 생존율을 유지할 수 있으며, 실제 동결보존에 적용하기 위한 방법으로는 85% 이상의 생존율을 확보할 수 있어야 한다. 이 차이를 극복하기 위해 두 종류의 투과성 첨가제에 다양한 비투과성 첨가제를 혼합 사용하여 동결 및 해동 후의 생존율을 측정한 결과, 10% DMSO 와 0.
- Real-time RT-PCR을 통해 CHO DHFR 유전자의 mRNA에 대한 Ct 값을 확인한 결과, 무혈청 배지를 이용하여 장기간 동결보존된 CHO 세포의 삽입 유전자가 혈청 배지의 경우와 동일한 Ct 값을 나타냈으며, control 인 GAPDH mRNA의 RT-PCR 결과로 data를 검증할 수 있었다(Fig. 7).
- 시판중인 무혈청 배지를 이용하여 CHO 세포를 각각의 무혈청 배지에 적응시킨 후, 각각의 배지에 10% DMSO를 첨가하여 동결 및 해동 후 생존율을 측정하였다. 그 결과 무혈청 배지를 이용한 동결보존에서 모두 94% 이상의 우수한 동결보존 능력을 보였으며, C5467이나 SF486, PF486을 이용한 경우에는 10% 혈청을 이용한 동결보존과 거의 동일한 97% 이상의 생존율을 나타냈다. 이는무혈청 동결보존제인 CAN-1000을 이용한 동결보존의 경우에 관찰되는 생존율보다 약 10% 가량 높은 생존율이며, 무혈청 배지를 이용한 동결보존이 혈청을 이용한 경우만큼 우수한 동결보존 능력을 갖고 있음을 나타낸다(Fig.
- 우선, 무혈청 동결보존에서 세포 생존율을 높이기 위해 투과성 및 비투과성 첨가제를 배지에 첨가하는 방법으로 동결보존 및 해동하여 생존율을 측정하였다. 그 결과, 10% DMSO와 0.03 M raffinose를 동시에 첨가한 경우에 76%의 생존율을 확보할 수 있었지만 기존의 혈청을 이용하는 동결보존에는 미치지 못하였다. 두 번째로 무혈청 배지의 동결보존 능력을 알아보기 위해 시판 중인 무혈청 배지와 무혈청 동결보존제를 사용하여 동결보존 후의 생존율을 비교한 결과, 무혈청 배지를 이용한 실험에서는 혈청 배지를 이용한 동결보존과 유사한 95% 이상의 생존율을 확인할 수 있었다.
- Brockett의 실험에서 해동용액의 조성이나 해동 온도가 동결된 세포의 생존율에 영향을 주는 것으로 나타났으며(40), 본 실험에서는 혈청 배지와 무혈청 배지의 해동 능력을 평가하였다. 동결 및 해동 조건에 대한 실험 결과, 모든 조건의 과정에서 기존의 배양배지를 이용한 동결보존의 경우와 거의 차이가 없는 약 90% 이상의 생존율을 보였다. 이는 무혈청 배지를 이용한 동결보존 및 해동이무혈청 배지에 적응되지 않은 세포주의 생존율에도 거의 영향을 주지 않는 것으로 볼 수 있으며, 무혈청 배지 자체에 혈청을 대체할만한 동결보존제로서의 능력이 있음을 짐작할 수 있다(Fig.
- 동결보존에서 비투과성 첨가제로서 혈청의 중요성을 확인하기 위하여 혈청의 농도에 따른 동결-해동 후의 생존율을 측정한 결과, 5% 이하의 혈청 농도에서부터 생존율이 80% 이하로 급격히 감소하는 것을 관찰할 수 있었고, 혈청이 없는 상태에서는 50% 정도의 세포가 사멸하는 것을 확인할 수 있었다(Fig. 1). 이는 Trounson의 실험에서 비투과성 첨가제인 단백질의 농도가 동결보존에 미치는 영향을 관찰한 것과 유사한 결과를 보였고, 동물세포를 동결보존 하는 과정에 있어 혈청이 비투과성 동결보존제로 작용한다는 것을 확인할 수 있었다(35).
- 03 M raffinose를 동시에 첨가한 경우에 76%의 생존율을 확보할 수 있었지만 기존의 혈청을 이용하는 동결보존에는 미치지 못하였다. 두 번째로 무혈청 배지의 동결보존 능력을 알아보기 위해 시판 중인 무혈청 배지와 무혈청 동결보존제를 사용하여 동결보존 후의 생존율을 비교한 결과, 무혈청 배지를 이용한 실험에서는 혈청 배지를 이용한 동결보존과 유사한 95% 이상의 생존율을 확인할 수 있었다. 이는 무혈청 동결보존제의 동결보존 능력보다 우수한 결과이다.
- 5). 또한, 해동 후의 성장 회복율을 평가한 결과, 혈청 배지와 무혈청 배지를 이용한 동결보존의 경우에는 보존 기간에 따른 성장률의 변화가 거의 없었지만, 무혈청 동결보존제의 경우는 성장곡선의 유도기가 조금씩 길어지는 것을 확인할 수 있었다(Fig. 6). 이는 무혈청 동결보존제를 이용한 장기간 동결보존이 생존율에는 거의 영향을 주지 않지만, 성장 회복율은 동결보존 기간에 영향을 받는 것으로 해석할 수 있다.
- 마지막으로 무혈청 배지를 이용한 장기간 동결보존이 삽입 유전자의 안정성에 미치는 영향을 평가한 결과, 혈청 배지와 동일한 유전적 안정성을 나타내는 것을 확인할 수 있었다. Real-time RT-PCR을 통해 CHO DHFR 유전자의 mRNA에 대한 Ct 값을 확인한 결과, 무혈청 배지를 이용하여 장기간 동결보존된 CHO 세포의 삽입 유전자가 혈청 배지의 경우와 동일한 Ct 값을 나타냈으며, control 인 GAPDH mRNA의 RT-PCR 결과로 data를 검증할 수 있었다(Fig.
- 무혈청배지를 이용한 동결보존의 다양한 실험 결과, 약 2년간의 동결보존에는 무혈청 배지를 사용하는 방법이 혈청을 사용하는 동결보존을 대체할 수 있을 것으로 판단되고, 무혈청 환경의 생물공정에서 사용되는 세포주 동결보존에서 혈청에 의한 교차오염 방지할 수 있을 것으로 생각된다. 무혈청 배지를 이용한 동결보존이 CHO 세포의 생존율 및 안정성을 유지할 수 있는 것으로 확인되었고, 기존의 혈청 배지를 이용한 동결보존 방법을 대체할 수 있을 것으로 생각된다. 현재 무혈청 배지를 이용한 2년 이상 장기간 동결보존 후의 생존율 및 회복율, 유전자 안정성에 대한 실험이 진행 중이며, 생물공정에 있어 무혈청 배지를 이용한 동결보존 방법이 확립될 것으로 기대된다.
- 이에 본 실험은무혈청 배지를 이용한 동결보존이 세포주의 안정성에 어떠한 영향을 미치는지 알아보기 위해 진행되었다. 무혈청배지를 이용한 동결보존의 다양한 실험 결과, 약 2년간의 동결보존에는 무혈청 배지를 사용하는 방법이 혈청을 사용하는 동결보존을 대체할 수 있을 것으로 판단되고, 무혈청 환경의 생물공정에서 사용되는 세포주 동결보존에서 혈청에 의한 교차오염 방지할 수 있을 것으로 생각된다. 무혈청 배지를 이용한 동결보존이 CHO 세포의 생존율 및 안정성을 유지할 수 있는 것으로 확인되었고, 기존의 혈청 배지를 이용한 동결보존 방법을 대체할 수 있을 것으로 생각된다.
- 우선, 장기간 동결보존에 따른 생존율의 변화에 대한 실험의 경우, 무혈청 배지나 혈청 배지를 사용한 동결보존에서 18 개월 동안 90% 이상의 생존율을 유지하고 있음을 확인할 수 있었다. 이 결과는 CAN-1000을 이용한 동결보존의 경우보다 5% 이상 높은 생존율이었으며, 세 가지 동결보존 방법 모두 보존기간에 따른 생존율의 변화는 거의 없었다 (Fig.
- 우선, 혈청을 대체하기 위한 다양한 동결보존 첨가제를 이용한 생존율의 비교결과를 보면 투과성 동결보존제로 10% DMSO와 20% 이ycerol 만을 첨가한 경우, 비투과성 동결보존제가 없는 상황에서도 동결보존제로서의 능력을 보였으며, methanol을 사용한 경우는 동결보존 과정에서 거의 모든 세포가 사멸하였다. 이는 DMSO와 이ycerol이 투과성 동결보존제로 작용하여 일차적으로 생존율을 유지할 수 있는 것을 나타내며, 첨가제 농도에 따른 세포독성은 Nelson의 실험에 의해 이미 확인되었다(38).
- 우선, 장기간 동결보존에 따른 생존율의 변화에 대한 실험의 경우, 무혈청 배지나 혈청 배지를 사용한 동결보존에서 18 개월 동안 90% 이상의 생존율을 유지하고 있음을 확인할 수 있었다. 이 결과는 CAN-1000을 이용한 동결보존의 경우보다 5% 이상 높은 생존율이었으며, 세 가지 동결보존 방법 모두 보존기간에 따른 생존율의 변화는 거의 없었다 (Fig. 5). 또한, 해동 후의 성장 회복율을 평가한 결과, 혈청 배지와 무혈청 배지를 이용한 동결보존의 경우에는 보존 기간에 따른 성장률의 변화가 거의 없었지만, 무혈청 동결보존제의 경우는 성장곡선의 유도기가 조금씩 길어지는 것을 확인할 수 있었다(Fig.
- DMSO와 glycerol 등의 투과성 동결보존제만을 사용한 경우에, 비투과성 첨가제를 사용하지 않더라도 40-50% 정도의 생존율을 확보할 수 있었지만, 기존의 혈청을 이용한 동결보존 방법으로는 95% 이상의 생존율을 유지할 수 있으며, 실제 동결보존에 적용하기 위한 방법으로는 85% 이상의 생존율을 확보할 수 있어야 한다. 이 차이를 극복하기 위해 두 종류의 투과성 첨가제에 다양한 비투과성 첨가제를 혼합 사용하여 동결 및 해동 후의 생존율을 측정한 결과, 10% DMSO 와 0.03M raffinose를 동시에 처리할 경우, 76%의 가장 높은 생존율을 보였다. 하지만, 이 역시 기존의 혈청을 이용한 동결보존 효과에는 미치지 못하였다(Fig.
- 그 결과 무혈청 배지를 이용한 동결보존에서 모두 94% 이상의 우수한 동결보존 능력을 보였으며, C5467이나 SF486, PF486을 이용한 경우에는 10% 혈청을 이용한 동결보존과 거의 동일한 97% 이상의 생존율을 나타냈다. 이는무혈청 동결보존제인 CAN-1000을 이용한 동결보존의 경우에 관찰되는 생존율보다 약 10% 가량 높은 생존율이며, 무혈청 배지를 이용한 동결보존이 혈청을 이용한 경우만큼 우수한 동결보존 능력을 갖고 있음을 나타낸다(Fig. 3). 시판중인 무혈청 배지의 경우 그 조성이 공개되어 있지 않아 동결보존제 기능을 하는 물질이 첨가되었는지 알 수 없으나, 위에서 언급한 것처럼 혈청의 기능을 대체하기 위해 기본적으로 첨가되는 단백질이나 각종 성장인자, 항산화제 등이 동결보존제의 역할을 하는 것으로 생각된다.
- 마지막으로 무혈청 배지를 이용한 장기간 동결보존에서 CHO 세포의 안정성을 확인하기 위하여 무혈청 배지로 동결보존된 CHO 세포를 3개월 단위로 해동하여 생존율 및 성장 회복율을 측정하고, real-time RT-PCR을 통해 삽입된 CHO DHFR 유전자의 안정성을 평가하였다. 혈청배지와 비교할 때, 생존율과 성장 회복율, 유전자 안정성 측면에서 모두 동일한 결과를 보여, 무혈청 배지를 이용한 18개월 이상의 동결보존이 안정적임을 검증할 수 있었다. 결과적으로 생물의 약품 공정에서 무혈청 배지를 이용한 동결보존이 혈청을 이용한 동결보존을 대체할 수 있을 것으로 생각된다.
후속연구
- 혈청배지와 비교할 때, 생존율과 성장 회복율, 유전자 안정성 측면에서 모두 동일한 결과를 보여, 무혈청 배지를 이용한 18개월 이상의 동결보존이 안정적임을 검증할 수 있었다. 결과적으로 생물의 약품 공정에서 무혈청 배지를 이용한 동결보존이 혈청을 이용한 동결보존을 대체할 수 있을 것으로 생각된다.
- 하지만, 무혈청배지를 사용한 세포배양의 경우, 배양하는 세포의 종류에 따라 사용되는 무혈청 배지의 종류가 달라지고, 배양 방법이 달라지는 등의 단점을 갖기도 한다. 세포주의 종류에 따라 달라지는 배지의 종류나 배양 방법처럼 무혈청 배지를 이용한 동결보존 역시 기존의 동결보존 방법과는 다른 조건으로 진행해야 하고, 그 안정성이 검증되어야 할 것이다. 위와같은 이유로본실험은무혈청 배지를 이용한 CHO 세포동결보존의 세포주 보존능력과 유전자 안정성을 확인하여, 무혈청 배지를 이용한 동결보존방법을 확립하고 안정성을 검증하기 위하여 진행하였다.
- Glycerol을 이용한 동결보존의 경우, osmotic stress# 받는 것으로 알려져 있는데(39), 투과성 첨가제만을 사용할 경우에는 20% glycerol을 사용하는 방법이 조금 높은 생존율을 보였지만, 투과성 첨가제와 비투과성 첨가제를 동시에 첨가할 경우는 10% DMSO와 동시에 처리한 경우가 전반적으로 우수한 생존율을 보였다. 하지만 첨가제의 조합에 따른 생존율이 투과성과 비투과성 첨가제를 각각 처리한 경우와 상반된 결과를 보이기도 하므로 투과성 및 비투과성 첨가제의 최적화된 조합을 찾을 경우, 동결보존에서 혈청을 대체할 수 있을 것으로 기대된다.
- 무혈청 배지를 이용한 동결보존이 CHO 세포의 생존율 및 안정성을 유지할 수 있는 것으로 확인되었고, 기존의 혈청 배지를 이용한 동결보존 방법을 대체할 수 있을 것으로 생각된다. 현재 무혈청 배지를 이용한 2년 이상 장기간 동결보존 후의 생존율 및 회복율, 유전자 안정성에 대한 실험이 진행 중이며, 생물공정에 있어 무혈청 배지를 이용한 동결보존 방법이 확립될 것으로 기대된다.
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