[논문]재조합 내열성 트레할로스 합성효소의 생산

최재열; 차월석; 신현재

재조합 내열성 트레할로스 합성효소의 생산
Production of Recombinant Trehalose Synthase from Thermus caldophilus GK24 원문보기

한국생물공학회지 = Korean journal of biotechnology and bioengineering, v.21 no.4, 2006년, pp.298 - 301

최재열 (한국생명공학연구원 바이오벤처센터 (주)엔지뱅크) , 차월석 (조선대학교 생명화학공학과) , 신현재 (조선대학교 생명화학공학과)

초록
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트레할로스 합성효소(trehalose synthase)의 효율적인 생산을 위하여, 5 종류의 plasmid를 형질전환 시킨 재조합 E. coli를 이용하여 균체생산량과 효소발현량을 비교하였다. Trehalose synthase의 활성은 fusion partner를 이용한 system 에서는 활성이 나타나지 않았으며, IPTG 유도 발현 시스템보다 항시적 발현 시스템을 사용하는 E. coli K12/pHCETS에서 가장 높은 활성을 나타내었다. 선별된 재조합 E. coli K12/pHCETS를 사용하여 회분식 및 유가배양을 수행하였으며, 유가식 배양의 경우 균체논도는 20 g/L, 최종 trehalose synthase 활성은 13.7 U/ml을 나타내었다. 이러한 결과는 트레할로스 생산을 위한 trehalose synthase가 재조합 E. coli의 발효에 의해 경제적으로 생산되어질 수 있다는 가능성을 보여 주었다.

Abstract ▼ AI-Helper

A gene(GeneBank AF 135796) coding for a trehalose synthase from Thermus caldophilus GK24 was cloned into Escherichia coli K12 using five vector systems. The constitutive expression system(pHCETS) which shows the highest trehalose synthase activity from flask culture of recombinant E. coli was selected for the production of trehalose from maltose. For the shake flask culture, the final dry cell weight was 0.9 g/L and the trehalose synthase activity was 25 U/mL. Fed-batch culture of recombinant E. coli harboring plasmid pHCETS which uses the glycerolas a carbon source was performed in jar fermentor: the dry cell weight of 20 g/L and the trehalose synthase activity of 13.7 U/mL were attained in 48 h.

주제어

AI 본문요약
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문제 정의

본 연구에서는 다양한 벡터시스템을 이용하여 식품용 효소생산용 숙주로서 적합한 Escherichia coli K12 내에서 trehalose synthase 의 발현을 확인하였다. 또한 선별된 plasmid 시스템을 이용해 고가의 유도기질이 없이 제조 가능한 재조합 트레할로스 전환효소의 유가식 발효공정에 의한 트레할로스 생산의 기초자료를 제시하고자 한다.
그러나 이때 사용한 효소는 isopropyl-U-D-thiogalactopyranoside (IPTG)를 유도물질 로 사용하여 발현된 것으로 산업적 생산에는 무리가 있었다. 본 연구에서는 다양한 벡터시스템을 이용하여 식품용 효소생산용 숙주로서 적합한 Escherichia coli K12 내에서 trehalose synthase 의 발현을 확인하였다. 또한 선별된 plasmid 시스템을 이용해 고가의 유도기질이 없이 제조 가능한 재조합 트레할로스 전환효소의 유가식 발효공정에 의한 트레할로스 생산의 기초자료를 제시하고자 한다.
본 연구팀은 지난 보고에서 맥아당을 기질로써 T. caldophilus GK24유래의 trehalose synthase를 이용한 trehalose 생산 조건의 최적화를 제시하였다(14). 그러나 이때 사용한 효소는 isopropyl-U-D-thiogalactopyranoside (IPTG)를 유도물질 로 사용하여 발현된 것으로 산업적 생산에는 무리가 있었다.

제안 방법

Vortexing을 2분 수행 후, 얼음물에 1분 보관하는 과정을 3회 반복하였다. Vortexing 완료 후 micro tube를 70℃의 항 온수조에서 20분 동안 열처리하여 변성된 단백질을 원심 분리로 제거 후 그 상층액을 부분 정제된 효소 시료로 사 용하였匸" SDS-PAGE 분석은 12% acrylamide gel을 이용해 단백질 농도가 30 呢이 되도록 각각의 시료를 로딩하였으며, 전기영동 밴드는 Coomassie staining으로 확인하였다.
EcoRI과 S瓦I의 양 말단을 가지는 trehalose synthase 유전자 로 구축된 plasmid인 pTrcTS(14)를 이용하여, 동일 제한효소 들로 절단된 plasmids 를 ligation 하여 pGEXTS, pKKTS, pHCETS를 구축하였다(Table 1). Zhang 등 (15)은 Shine- Dalgamo (SD) sequence 와 downstream box (DB) sequence를 사용하여 E.
Trehalose synthase의 효율적인 대량생산을 위해 flask culture에서 가장 좋은 활성을 보인 항시적 발현 시스템을 사용하는 재조합 E. coli K12/pHCETS를 이용하여 유가배 양을 시도하였다. pHCE 시스템에서의 높은 생산성을 위하여 Poo 등(18)에서와 동일하게 trehalose synthase의 생산을 위한 탄소원으로 이ycerol을 사용하였다.
균체농도는 UV spectrophotometer (Ultraspec 3100pro: Amersham Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden.)를 사용하여 600 nm에서 흡광도와 건조균체량으로 결정하였고, 흡광도 와 건조균체량의 표준곡선에 의해서 흡광도 (OD) 1.0에서 건조균체량은 0.363 g/L 로 환산하였다. Glycerol 정량 및 효 소활성측정은 CarboPacTM PA-1 분석용 컬럼 (Dionex, 250 X 4 mm)과 guard 컬럼 (Dionex, 50 x 4 mm)을 사용하여 25 ℃ 에서 electrochemical detector (ED40) 와 함께 Bio-LC (Dionex) system으로 수행하였다, 이동상 용매는200 mM NaOH, 300 mM NaOAc + 100 mM NaOH, 压0의 세가지 혼합용액으로 분당 0.
유가배양의 탄소원인 glycerole 농도가 최소 10 g/1 이하로 떨어지지 않도록 공급하였다. 배 지 공급에 따라 세포의 성장은 점차 증가하였으며 48 시 간까지 조업하였다. 유가배양 완료 후 최종 건조 세포량은 21.
트레할로스 합성효소 (trehalose synt如e) 의 활성은 1% (w/v) 맥아당 1 ml을 기질로 10 X 효소 시료를 첨가하여 70℃에서 15분간 반응하고 100℃에서 1。분간 끓여서 반응을 정지시킨 후 Bio-LC (Bio-liquid chromatography, Dionex CO., USA) 분석을 통해 확인하였고, 효소 1 U는 1분당 맥아당으로부터 전환 되는 트레할로스 1.0 pmol 수로 정하였다.
9 에 도달하였을 때 배지 내에 유도물질인 isopropyl-P -D-thiogalactopyranoside (IPTG)를 최종 1 mM 농도로 첨가 하였다. 서로 다른 시스템의 plasmid가 형질전환된 E. coli 의 24시간 배양한 샘플을 회수하여 SDS-PAGE와 효소활성을 비교하였다. 동일 단백질 농도로 로딩한 SDS-PAGE에서 pKKTS, pTrcTS, pHCETS만이 trehalose synthase 밴드 (약 110 kDa)가 확인되었다.
세포 파쇄후 부분 정제된 효소액의 단백질양은 BCA protein assay kit (Pierce Biot©산mology, Inc., USA)를 이용해 UV spectrophotometer (Ultraspec 3100pro: Amersham Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden.)로 수치화 하였다. 표준물질로는 kit 내 포함된 bovine serum albun血을 사용해 미리 구한 검 량선으로부터 시료의 단백질 농도를 구하였다.
coli 와 유의적 차이를 보이지 않았다. 유도물질의 첨가가 필요 없는 high-level constitute expression system (HCE) promoter 를 사용하는 항시적 발현 시스템(18)인 pHCETS를 제외한 나머지 유도 시스템을 사용하는 plasmid가 형질전환된 E. co〃에서는 세포성장이 600 nm에서 흡광도가 0.7 내지 0.9 에 도달하였을 때 배지 내에 유도물질인 isopropyl-P -D-thiogalactopyranoside (IPTG)를 최종 1 mM 농도로 첨가 하였다. 서로 다른 시스템의 plasmid가 형질전환된 E.
pHCE 시스템에서의 높은 생산성을 위하여 Poo 등(18)에서와 동일하게 trehalose synthase의 생산을 위한 탄소원으로 이ycerol을 사용하였다. 전배양 배지에서 충분히 배양된 E. c湖K12/pHCETS를 발효조에 접종 후 우선 12시간 동안 회분배양을 수행하였다. 회분배양 시 최종 세포성장은 건조 세포량으로 2.
트레할로스 합성효소 (trehalose synthase)의 효율적인 생 산을 위하여, 5 종류의 plasmid를 형질전환 시킨 재조합 E. c湖를 이용하여 균체생산량과 효소발현량을 비교하였다. Trehalose synthase의 활성은 fusion partner를 이용한 system 에서는 활성이 나타나지 않았으며, IPTG 유도 발현 시스템 보다 항시적 발현 시스템을 사용하는 E.
)로 수치화 하였다. 표준물질로는 kit 내 포함된 bovine serum albun血을 사용해 미리 구한 검 량선으로부터 시료의 단백질 농도를 구하였다.
Table 2는 본 연구에 사용된 99 bp로 구성된 SD, DB, His6 tag의 nucleotide sequence를 나타낸다. 합성제조된 oligonucleotide 단편은 X如I과 EcoRI의 양 말단을 가지며, EcoR[과 &讥의 말단을 가지는 trehalose synthase 유전자와 동시에 Xbal 과 Sall 으로 절단된 pKK223-3에 ligatioir하여 pKKHis6TS를 구축하였다(Table 1).

대상 데이터

본 연구에 사용된 균주와 plasmids를 Table 1에 표시하였다. E. coli DH₅a는 plasmid 제작을 위한 균주로 사용되었 으며, 유전자 조작을 위한 배양은 Luria-Bertani 배지 (10 g/1 bacto-tryptone, 5 g/1 yeast extract, 10 g/1 NaCl)를 사용하였다.
회분 및 유가배양은 5 1 발효조 (KoBiotech Co. Korea)] 사용하였으며, 발효조내 본배양 배지 2.3 1에 전배양 배지 0.2 1를 더하여 2.5 1의 working volume으로 가동하였다. 가 동 조건은 37℃, 통기량 0.
, 1 g/1 citric acid)를 사용하여 37℃ 에서 150 rpm으로 24시간 진탕배양 하였다. 회분배양 (batch fermentation)^- 5 N HC₁ 에 용해된 trace metal 용액 (10 g/1 FeSO₄ 7H₂O, 2 g/1 CaC₁₂, 1.5 g/1 MgSO₄₇H₂O, 1.5 g/1 (NH₄)2SO₄, 2.2 g/1 ZnSO₄₇H₂O, 0.5 g/1 MnSO₄ 4H₂O, 1 g/1 CuSO₄ 5H₂O, 0.1 g/1 (NH₄)6Mo7O₂ 4H₂O, 0.02 g/1 Na2B4O₇ 10H₂O)[ 1 ml/1 로 첨가한 CPGY 배지를 사용하였으며, 유가배양 (fed-batch fermemation)을 위한 첨가 배지는 500 이L glycerol, 200 g/L yeast extract, 1.5 g/1 MgSO₄ 7H₂O, 1.5 g/1 (NHeSQ를 사용하였다.

성능/효과

Trehalose synthase의 유가발효는 shaking flask 배양에 비해 균체량에서는 2Q배 이상의 큰 증가를 보여주었으나 효 소의 발현량에서는 1/2의 감소를 나타내었다. 현재 균체량 의 증가로 인한 효소발현의 억제를 감소시키기 위한 연구가 진행 중이다.
c湖를 이용하여 균체생산량과 효소발현량을 비교하였다. Trehalose synthase의 활성은 fusion partner를 이용한 system 에서는 활성이 나타나지 않았으며, IPTG 유도 발현 시스템 보다 항시적 발현 시스템을 사용하는 E. coli K12/pHCETS 에서 가장 높은 활성을 나타내었다. 선별된 재조합 E.
coli 의 24시간 배양한 샘플을 회수하여 SDS-PAGE와 효소활성을 비교하였다. 동일 단백질 농도로 로딩한 SDS-PAGE에서 pKKTS, pTrcTS, pHCETS만이 trehalose synthase 밴드 (약 110 kDa)가 확인되었다. 용해도 증가와 분리, 정제의 용이성을 위한 fusion partner 가 결합된 pKKHis6TS 와 pGEXTS에서는 trehalose synthase 밴드가 보이지 않았다.
c[折의 성장곡선을 나타낸 것이다. 세포의 성장은 24시간 내에서 완료하였으며, plasmid가 형질전환 되지 않는 표 준 균주와 5 종류의 plasmid가 형질전환된 각각의 E. coli 와 유의적 차이를 보이지 않았다. 유도물질의 첨가가 필요 없는 high-level constitute expression system (HCE) promoter 를 사용하는 항시적 발현 시스템(18)인 pHCETS를 제외한 나머지 유도 시스템을 사용하는 plasmid가 형질전환된 E.
배 지 공급에 따라 세포의 성장은 점차 증가하였으며 48 시 간까지 조업하였다. 유가배양 완료 후 최종 건조 세포량은 21.6 g/1 이었으며, trehalose synthase 활성은 세포 성장에 따라 증가하는 모습을 보여 최종 13.7 U/ml에 이르렀다.
7 U/ml을 나타내었다. 이러한 결과는 트레할로스 생산을 위한 trehalose synthase가 재조 합 E. 의 발효에 의해 경제적으로 생산되어질 수 있다는 가능성을 보여 주었다.

후속연구

그러나, pKKHis6TS와 pGEXTS에서는 효소 활성이 확인되 지 않았다. 이는 안정성, 소수성 등의 목적 단백질 자체의 특성으로 인한 fusion 시스템에서의 단백질 발현의 어려움 이 보고된 바(16-17)와 같이 trehalose synthase 또한 높은 GC 함량, 큰 분자량 등의 구조적인 문제로 기인한다고 유 추되며, 추후에 이 문제의 해결을 위한 연구가 필요할 것으로 사료된다.

참고문헌 (18)

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저자의 다른 논문 :

표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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