선택한 단어 수는 입니다.
최소 단어 이상 선택하여야 합니다.
최소 단어 이상 선택하여야 합니다.
선택한 단어 수는 30입니다.
최대 10 단어까지만 선택 가능합니다.
최대 10 단어까지만 선택 가능합니다.
문제 정의
- Trehalos는 세포를 보호하는 antifreezing agent로서 효과[2] 뿐만 아니라 단백질에 대한 열보호 작용도 있다[3, 11]. 본 연구는 trehalose의 열보호 작용이 열 불안정성을 나타내는 AYS를 안정화 시킬 수 있을 것인지를 검토하였다.
제안 방법
- AYS(Anti-yeast substance)는 열에 의해 항효모 활성이 쉽게 약화되는 물질로서 trehalose의 사용이 AYS의 열에 대한 불안정성을 어느 정도 극복할 수 있을 것인지를 조사하기 위해 trehalose가 첨가된 AYS와 trehalose가 첨가되지 않은 AYS에 대한 항효모 활성을 비교 측정하였다. 그 결과 trehalose가 첨가된 AYS는 고온(50-70℃)에서 단시간(2 hr)동안 열처리한 경우에 trehalose가 함유되지 않은 AYS에 비해 그 활성이 비교적 잘 유지되었다.
- AYS의 열처리를 50℃에서 시간 별로 행하여 잔존하는 항효모 활성을 측정하였다. 즉, trehalose(0.
- 한편 trehalose는 세포를 보호하는 antifreezing agent로서 효과[2] 뿐만 아니라 단백질에 대한 열보호 작용도 있다[3, 11]. 따라서 AYS의 열에 대한 불안정성을 trehalose를 사용함으로서 안정화 시킬 수 있을 것인지를 알아보기 위하여 trehalose를 AYS와 혼합하여 열처리(50℃, 2 hr)를 행하였다. 그 결과 Table 1에서 보는바와 같이 trehalose를 함유하지 않은 AYS의 경우는 항효모 활성이 크게 약화되었으나, trehalose(0.
- 이때 효모의 수는 Hemacytometer를 사용하여 현미경 상에서 계측하였고, 항효모 활성측정은 MTT방법[4]으로 행하였으며, 효모가 배양된 microplate는 ELISA Reader로 흡광도(A540 nm)를 측정하였다. 또한 AYS의 최소생육저해농도(Minimal Inhibitory Concentration, MIC)는 NCCLS[10]에서 기술한 바와 같이 효모생육이 전혀 일어나지 않는 가장 낮은 농도로 나타내었으며, 대조구로는 amphotericin B가 사용되었다.
- 상기에서 기술한 바와 같이 trehalose가 AYS의 항효모 활성을 열처리로부터 보호하는데 trehalose의 적정농도를 측정하기 위해 AYS에 첨가한 trehalose의 농도를 달리하여 AYS를 열처리(50℃, 2 hr)시킨 후 그 잔존 활성을 측정하였다. 그 결과 Fig.
- 상기에서 기술한 바와 같이0.6M trehalose가 첨가된 AYS는 열처리를 50℃에서 70℃까지 행한 후 잔존하는 AYS의 활성을 측정하였다. 그 결과 Fig.
- 즉, 상기에서 기술한 isopropanol로 침전시킨 조정제AYS시료(dry weight 20 mg)를 평량하여 멸균된 증류수(1 mL)에 용해시키고, 별도로 trehalose도 각각 알맞은 농도가 되도록 멸균된 증류수(1 mL)에 용해시켰다. 이들 두 용액을 동량(1:1)으로 혼합시킨 후 그 혼합액을 각 온도에서 2시간 동안 열처리를 행한 다음 잔존하는 AYS의 S. cerevisiae에 대한 항효모 활성을 측정하였다.
- 원심분리 후에 침전된 세포는 제거하고 AYS가 함유된 상층액은 모은 후 상층액에 2배량(V/V)의 미리 냉각된 isopropanol을 가하여 4℃에서 침전시킨 후 형성된 침전물은 곧 바로 다시 냉각원심분리(8000 rpm, 5 min)를 행하였다. 이때 모여진 침전물은 미리 냉각된 증류수(4℃)에 적당히 녹인 다음 혼입된 isopropanol을 제거하기 위해 투석(SPECTRA/POR; MW cutoff 6,000-8,000, 4℃)을 행하고, 투석된 용액은 진공 동결 건조시켜서 -20℃에서 보관하면서 시료(AYS)로 사용하였다.
- 즉, tetracycline(Tc) 5 μg/mL가 함유되도록 미리 멸균된 YM배지(2배 농축배지)를 조제하여 96-well microplate의 각 well에 100 μL씩 넣고, 처리된 AYS 시료용액(dry weight 10 mg/mg) 100 μL를 잘 혼합시킨 후 미리 일정한 농도로 조제된 AYS 용액을 단계별로 2배씩 희석시켰다.
- AYS의 열처리를 50℃에서 시간 별로 행하여 잔존하는 항효모 활성을 측정하였다. 즉, trehalose(0.6 M)가 첨가된 AYS와 trehalose가 첨가되지 않은 AYS를 각각 50℃에서 1-3시간까지 시간 별로 열처리를 행한 후 잔존하는 AYS의 활성을 측정하였다. 그 결과 Table 2에서 보는 바와 같이 trehalose가 함유되지 않은 AYS의 MIC값이 trehalose가 함유된 AYS에 비해 높게 나타났음으로 trehalose는 AYS에 열보호 작용을 나타낸다고 생각된다.
- aquatilis AY2000균주에서 AYS를 생산하기 위한 배양법은 Kang 등[7]이 기술한 바와 같다. 즉, 먼저 MYCS 액체배지에 AY2000균주를 접종하고, 25℃에서 하룻밤 동안 전 배양시킨 후 전배양액을 다시 새로 조제한 MYCS 액체 배지에 1% 농도로 접종하였다. 접종된 균주는 25℃에서 24시간 동안 진탕 배양하고, 배양된 액은 원심분리(12000 rpm, 10 min, 4℃)를 행하였다.
- AYS의 열처리는 전보[6]에서 기술한 바와 같이 고온(50-70℃)에서 2시간 동안 행하였다. 즉, 상기에서 기술한 isopropanol로 침전시킨 조정제AYS시료(dry weight 20 mg)를 평량하여 멸균된 증류수(1 mL)에 용해시키고, 별도로 trehalose도 각각 알맞은 농도가 되도록 멸균된 증류수(1 mL)에 용해시켰다. 이들 두 용액을 동량(1:1)으로 혼합시킨 후 그 혼합액을 각 온도에서 2시간 동안 열처리를 행한 다음 잔존하는 AYS의 S.
대상 데이터
- Trehalose(α-D-glucopyranosyl α-D-glucopyranoside)는 Sigma사(Cat# Lot No. T9531)에서 구입하여 사용하였다.
- aquatilis AY2000균주 [9]가 항효모성 물질(Anti-yeast substance; AYS)의 생산균주로 사용되었으며, AYS생산을 위해서는 MYCS 배지[7]가 사용되었다. 또한 AYS의 활성을 측정하기 위한 균주는 본 연구실에 보관중인 S. cerevisiae ATCC2120균주가 사용되었으며, 이때 사용된 배지는 YM배지[7]였다. Trehalose(α-D-glucopyranosyl α-D-glucopyranoside)는 Sigma사(Cat# Lot No.
- 본 연구실에서 분리한 R. aquatilis AY2000균주 [9]가 항효모성 물질(Anti-yeast substance; AYS)의 생산균주로 사용되었으며, AYS생산을 위해서는 MYCS 배지[7]가 사용되었다. 또한 AYS의 활성을 측정하기 위한 균주는 본 연구실에 보관중인 S.
이론/모형
- AYS의 활성측정은 National Committee for Clinical Laboratory Standards(NCCLS)에서 기술된 Micro-dilution법[10]으로 행하였다. 즉, tetracycline(Tc) 5 μg/mL가 함유되도록 미리 멸균된 YM배지(2배 농축배지)를 조제하여 96-well microplate의 각 well에 100 μL씩 넣고, 처리된 AYS 시료용액(dry weight 10 mg/mg) 100 μL를 잘 혼합시킨 후 미리 일정한 농도로 조제된 AYS 용액을 단계별로 2배씩 희석시켰다.
- cerevisiae효모(105 cells/mL)를 10 μL씩 접종하여 28℃에서 24시간 동안 배양시켰다. 이때 효모의 수는 Hemacytometer를 사용하여 현미경 상에서 계측하였고, 항효모 활성측정은 MTT방법[4]으로 행하였으며, 효모가 배양된 microplate는 ELISA Reader로 흡광도(A540 nm)를 측정하였다. 또한 AYS의 최소생육저해농도(Minimal Inhibitory Concentration, MIC)는 NCCLS[10]에서 기술한 바와 같이 효모생육이 전혀 일어나지 않는 가장 낮은 농도로 나타내었으며, 대조구로는 amphotericin B가 사용되었다.
성능/효과
- 6 M trehalose를 열에 불안정한 효소에 사용한 결과 열에 안정한 효소로 작용하였다고 기술하고 있다. 전보[6]에서 기술한 바와 같이 AYS는 1) 열에 불안정하며, 2) thiol reagent에 의한 활성실 및 3) 이온교환수지에 의한 glycan 다량 함유부분과 단백질 다량 함유부분의 분리에 의한 항효모 활성의 소실 등의 특징을 가지고 있다. 또한 AYS는 Sephacryl S400 gel filtration을 행하면 항효모 활성을 나타내는 분획이 곧 바로 용출되었으며 당과 단백질이 약 3:1로 구성된 일종의 proteoglycan 으로 추정되었다[6].
- 특히 50℃ 열처리에서 trehalose 함유AYS는 고농도에서 보다 저농도에서 AYS의 잔존활성이 trehalose를 함유하지 않은 AYS 에 비해 크게 차이를 나타내었으며(약 30%의 차이), 60℃ 이상에서도 trehalose 함유 AYS의 항효모 활성에 대한 잔존활성이 trehalose를 함유하지 않은 AYS의 잔존 활성 보다 비교적 높게 나타나는 경향이 있었다. 결론적으로 AYS의 열처리에서 trehalsoe가 함유된 AYS는 trehalose가 함유되지 않은 AYS에 비해 항효모 활성이 높았음으로 AYS에 trehalose의 첨가는 열에 대한AYS의 항효모 활성을 유지하는데 효과가 있다고 생각된다. 장차 본인 등은 AYS를 완전히 정제하여 AYS의 항효모 활성과 관련되는 성분을 더욱 명확히 조사하고, AYS의 효모에 대한 메커니즘도 규명해야 할 과제라고 생각한다.
- 그 결과 Fig. 1에서 보는 바와 같이 trehalose를 첨가하지 않은 AYS에 비해 trehalose가 첨가된AYS의 저농도(7.8 μg/mL-31.3 μg/mL)에서 뚜렷한 활성의 차이를 나타내었으나, trehalose 농도(0.3-0.9 M)에 따른 AYS의 활성차이는 뚜렷하게 나타나지 않는 경향을 나타내었다.
- 6M trehalose가 첨가된 AYS는 열처리를 50℃에서 70℃까지 행한 후 잔존하는 AYS의 활성을 측정하였다. 그 결과 Fig. 2에서 보는 바와 같이 70℃ 열처리에서도 trehalose 함유 AYS는 trehalose를 함유하지 않은 AYS에 비해 S. cerevisiae에 대한 항효모 활성이 남아 있음을 확인하였다. 특히 50℃ 열처리에서 trehalose 함유AYS는 고농도에서 보다 저농도에서 AYS의 잔존활성이 trehalose를 함유하지 않은 AYS 에 비해 크게 차이를 나타내었으며(약 30%의 차이), 60℃ 이상에서도 trehalose 함유 AYS의 항효모 활성에 대한 잔존활성이 trehalose를 함유하지 않은 AYS의 잔존 활성 보다 비교적 높게 나타나는 경향이 있었다.
- 따라서 AYS의 열에 대한 불안정성을 trehalose를 사용함으로서 안정화 시킬 수 있을 것인지를 알아보기 위하여 trehalose를 AYS와 혼합하여 열처리(50℃, 2 hr)를 행하였다. 그 결과 Table 1에서 보는바와 같이 trehalose를 함유하지 않은 AYS의 경우는 항효모 활성이 크게 약화되었으나, trehalose(0.6 M)가 함유된 AYS의 경우에는 열처리(50℃, 2 hr)를 행하였어도 항효모 활성이 잘 유지되었으며, trehalose(0.13 M)과 0.1% BSA가 함유된 AYS의 경우에도 AYS만 열처리한 그룹 보다 항효모 활성이 높게 나타났다. 또한 대조구로 amphotericin B에 대한 MIC는 0.
- 6 M)가 첨가된 AYS와 trehalose가 첨가되지 않은 AYS를 각각 50℃에서 1-3시간까지 시간 별로 열처리를 행한 후 잔존하는 AYS의 활성을 측정하였다. 그 결과 Table 2에서 보는 바와 같이 trehalose가 함유되지 않은 AYS의 MIC값이 trehalose가 함유된 AYS에 비해 높게 나타났음으로 trehalose는 AYS에 열보호 작용을 나타낸다고 생각된다.
- AYS(Anti-yeast substance)는 열에 의해 항효모 활성이 쉽게 약화되는 물질로서 trehalose의 사용이 AYS의 열에 대한 불안정성을 어느 정도 극복할 수 있을 것인지를 조사하기 위해 trehalose가 첨가된 AYS와 trehalose가 첨가되지 않은 AYS에 대한 항효모 활성을 비교 측정하였다. 그 결과 trehalose가 첨가된 AYS는 고온(50-70℃)에서 단시간(2 hr)동안 열처리한 경우에 trehalose가 함유되지 않은 AYS에 비해 그 활성이 비교적 잘 유지되었다. 따라서 trehalose를 AYS에 첨가하면 열처리 후에도 AYS의 항효모 활성을 다소 보호할 수 있다.
- cerevisiae에 대한 항효모 활성이 남아 있음을 확인하였다. 특히 50℃ 열처리에서 trehalose 함유AYS는 고농도에서 보다 저농도에서 AYS의 잔존활성이 trehalose를 함유하지 않은 AYS 에 비해 크게 차이를 나타내었으며(약 30%의 차이), 60℃ 이상에서도 trehalose 함유 AYS의 항효모 활성에 대한 잔존활성이 trehalose를 함유하지 않은 AYS의 잔존 활성 보다 비교적 높게 나타나는 경향이 있었다. 결론적으로 AYS의 열처리에서 trehalsoe가 함유된 AYS는 trehalose가 함유되지 않은 AYS에 비해 항효모 활성이 높았음으로 AYS에 trehalose의 첨가는 열에 대한AYS의 항효모 활성을 유지하는데 효과가 있다고 생각된다.
- 특히, trehalose를 첨가하지 않은 AYS경우는 AYS의 농도가 31.3 μg/mL 이하에서 모두 항효모 활성이 나타나지 않았지만, trehalose를 첨가한 AYS 경우는 AYS의 농도가 7.8-31.3 μg/mL에서도 AYS에 의한 항효모 활성이 농도 의존적이었다.
※ AI-Helper는 부적절한 답변을 할 수 있습니다.