[논문]Corynebacterium glutamicum 균주 개량 및 발효 공정 최적화에 의한 L-lysine 생산성 증진

서진미; 현형환

Corynebacterium glutamicum 균주 개량 및 발효 공정 최적화에 의한 L-lysine 생산성 증진
Enhancement of L-lysine Productivity by Strain Improvement and Optimization of Fermentation Conditions in Corynebacterium glutamicum 원문보기

한국생물공학회지 = Korean journal of biotechnology and bioengineering, v.21 no.2, 2006년, pp.79 - 84

서진미 (한국외국어대학교 생명공학과) , 현형환 (한국외국어대학교 생명공학과)

초록
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본 연구에서는 Corynebacterium glutamicum I 균주에 salt tolerance를 도입하여 L-lysine 생산량을 증가시키고자 하였다. I 균주를 이용하여 mutagenesis를 수행한 후 모균주가 생장하는 못하는 9%의 NaCl이 포함된 배지에서 빠르게 생장하는 C14-49-3-15-7-3-20 균주를 선별하였다. flask 배양으로 L-lysine 생산을 조사한 결과 모균주 I의 경우 L-lysine 농도가 53.3 g/L, 수율이 51.6%인 반면 변이주 C14-49-3-15-7-3-20의 경우에는 L-lysine 농도 61.2 g/L, 수율 61.0%로 나타났다. 그리고 5 L 발효조에서 유가식 배양법으로 배양하여 L-lysine 생산량을 조사하였다. 그 결과 모균주는 113.0 g/L의 L-lysine을 생산하였고 수율은 41.8%이었다. 하지만 변이주의 경우에는 $33^{\circ}C$로 유지하여 배양한 후 PCV가 7.5%가 되는 시점에 배양 온도를 $35^{\circ}C$로 올려주고 배양하였을 때 L-lysine 생산량이 130.6 g/L, 수율이 48.6%로 모균주보다 많은 양의 L-lysine을 생산하였다. L-lysine 생산과 균주의 생장에 대한 osmotic pressure의 영향을 조사하기 위해 변이주 C14-49-3-15-7-3-20을 고농도의 NaCl과 당이 포함되어 있는 배지에 각각 배양하여 균체 생장 및 L-lysine 생산량을 조사하였다. 그 결과 모균주는 균체 생장이 느리고 생산량도 낮은 반면 변이주 C14-49-3-15-7-3-20의 경우에는 균체 생장 정도가 높고 생산량도 모균주보다 높았다. 그리고 2%의 NaCl이 포함되어 있는 배지에 osmoprotectant 를 첨가하였을 경우 모균주는 균체 생장 및 L-lysine 생산량이 높아졌다. 하지만 C14-49-3-15-7-3-20 균주의 경우에는 proline의 영향을 받지 않았다. 이러한 결과로 Corynebacterium glutamicum 균주에 salt tolerance를 도입하면 L-lysine 생산성을 크게 향상시킬 수 있음을 확인하였다.

Abstract ▼ AI-Helper

In order to minimize the reduction of lysine productivity by accumulation of lysine and byproducts in the end of fed-batch fermentations, a salt-tolerant mutant C14-49-3-15-7-3-20, which could grow at high concentrations of NaCl was isolated through mutagenesis from the Corynebacterium glutamicum mother strain I. In the evaluation of L-lysine productivity by fed-batch fermentations using a 5 L jar fermenter, the salt-tolerant mutant strain C14-49-3-15-7-3-20 produced 130.6 g/L of L-lysine with a 48.6% of yield. The mother strain I produced L-lysine concentration only 104.9 g/L with a yield 41.8%, implying the improvement of L-lysine productivity by introduction of salt-tolerance character.

주제어

AI 본문요약
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문제 정의

5 L 발효조를 이용하여 C. glutamicum C₁₄-49-3-15-7-3-20 균주를 유가식 배양법으로 배양할 때 온도가 균체 농도 및 L-lysine 생산에 미치는 영향을 알아보고자 하였다. 모 균주의 경우 발효 초기의 온도는 33℃로 유지하여 배양하 면서, PCV가 7.
F-선별 배지의 당농도에 따른 균체 생장 및 L-lysine 생 산량을 알아보고자 하였다. 10%, 15%, 17%로 당농도를 달 리하여 배양한 결과 salt-tolerant mutant C₁₄-49-3-15-7-3-20 균주는 모든 농도에서 모균주 I보다 growth 및 L-lysine 생 산량이 높았다(Fig.
Mutant strain C₁₄-49-3-15-7-3-20을 이용하여 F-선별배지 의 NaCI 농도에 따른 균체 생장 및 L-lysine 생산량을 알아 보고자 하였다. 0%, 1%, 2%, 3%로 농도를 달리하여 배양 한 결과 모균주 I의 경우에는 NaCI 농도가 증가함에 따라 L-lysine 생산량이 급격히 감소되는 반면 C₁₄-49-3-15-7-3-20
만약 mutagenesis를 통하여 osmotolerant mutants를 개발한 다면 substrate 및 product의 농도가 높은 배지에서도 배양 이 가능하고 이러한 균주를 유가식 배양 적용해 더 높은 L-lysine 농도 및 수율을 얻을 수 있을 것이다, 따라서 본 연구는 salt-tolerant mutant를 개발하여 L-lysine 생산성을 증 대시키고 또한 salt-tolerant mutant를 characterization 하고자 하는데 목적이 있다.
선별한 salt-tolerant mutant C₁₄-49-3-15-7-3-20의 특성을 알아보고자 하였다. C₁₄-49-3-15-7-3-20 균주와 모균주 I를 이용하여 SA broth 배지 내의 NaCI 농도에 따른 균체 생 장 정도를 비교하였다(Fig.

가설 설정

9 g/L 의 proline이 포함되어 있는 high salt medium에서 배양하였 다(Table 2). 모균주 I는 고농도의 salt가 포함되어 있는 배 지에 osmoprotectant 를 첨가하였을 경우 첨가하지 않은 경 우보다 더 잘 자라고 L-lysine 생산량도 높을 것이다. 하지만 salt-tolerant mutants의 경우에는 salt-tolerance를 가지고 있기 때문에 proline이 포함되어 있는 배지와 포함되어 있지 않은 배지에서의 growth 및 L-lysine 생산량이 비슷할 것이다.

제안 방법

5 L 발효조를 이용하여 C. glutamicum I 와 salt-tolerant mutant strain C₁₄-49-3-15-7-3-20 균주를 유가식 배양법으로 배양하여 균의 생장 및 L-lysine 생산량을 알아보았다. 배 양시 초기 발효조의 온도를 33℃로 유지하여 배양하면서, PCV가 7.
SA 배지에서 자란 균을 8%, 9%의 NaCI이 포함되어 있는 SA agar 배지에 도말하여 배양하였다. 8%의 NaCI이 포함된 배지에서 생장이 빠 른 mutant colony와 모균주가 생장하지 않는 9%의 NaCI이 포함된 배지에서 자라는 colony를 선별하여 flask 배양으로 L-lysine 생산량을 알아보았다.
-49-3-15-7-3-20의 특성을 알아보고자 하였다. C₁₄-49-3-15-7-3-20 균주와 모균주 I를 이용하여 SA broth 배지 내의 NaCI 농도에 따른 균체 생 장 정도를 비교하였다(Fig. 1). control0.
L-lysine 생산량을 알아보기 위해 SA 배지 (glucose 10 g/L, urea 1 g/L, polypeptone 10 g/L, yeast extract 5 g/L, beef extract 5 g/L, NaCI 2.5 g/L, Agar 22 g/L)에 접종하여 30℃에서 36-40시간 계대 배양한 뒤 5 ml의 전배양 배지 PS (sucrose 50 g/L, KH₂PO₄ 1 g/L, Urea 1 g/L, CSL 12 ml/L, polypeptone 10 g/L, yeast extract 10 g/L, nicotinic acid 3 mg/L, thiamine HC₁ 1 mg/L, d-biotin 50 ug/L, f-alanine 5 mg/L)를 포함한 50 ml 삼각플라스크에 1 loop 접종한다. 진탕배양기 (30℃, 250 rpm)로 8-12시간 배양하여 균체 농 도 (ODm)가 5-6 일 때, 10 ml의 F-선별 배지 (sucrose 70 g/L, 당밀 30 g/L, (NHQ2SO₄ 50 g/L, CaCO₃ 50 g/L, KH₂PO₄ 0.
8-10%의 NaCI이 포함되어 있는 SA broth 배지에 접종하여 30℃에서 3-5일 배양하 면서 enrichment를 수행하였다. SA 배지에서 자란 균을 8%, 9%의 NaCI이 포함되어 있는 SA agar 배지에 도말하여 배양하였다. 8%의 NaCI이 포함된 배지에서 생장이 빠 른 mutant colony와 모균주가 생장하지 않는 9%의 NaCI이 포함된 배지에서 자라는 colony를 선별하여 flask 배양으로 L-lysine 생산량을 알아보았다.
Salt-tolerant mutant를 분리하기 위해 C. glutamicum I 균 주를 NTG (N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine) 로 처리한 후 saline으로 세번 wasl血g하였다. 8-10%의 NaCI이 포함되어 있는 SA broth 배지에 접종하여 30℃에서 3-5일 배양하 면서 enrichment를 수행하였다.
Salt-tolerant mutant를 분리하기 위해 먼저 모균주 I에 NTG를 처리하여 인공 돌연 변이를 수행한 후 9%의 NaCI 이 포함된 SA 액체 배지에서 emichment시켰다. 배양 중 모균주 17} 생장하지 않는 9%의 NaClo] 포함된 SA 배지 에 도말하여 빠르게 생장한 균주를 선별하였다.
유가식 배양에서는 사면 배지인 SA 고체배지에 접종하여 30℃에서 36-40시간 계대 배양 한 뒤 50 ml의 전배양 배지 PS를 포함한 500 ml 삼각플라스크에 1 loop 접종하여 진탕 배양기 (30℃, 200 rpm)로 14-16시간 배양하였다. 균 체 농도 (ODmo) 5-6일 때, 1 L의 종배양 배지 S (sucrose 36 g/L, 당밀 24 g/L, (NHQ2SO₄ 10 g/L, MgSO₄-7H₂O 0.5 g/L, KH₂PO₄ 2 g/L, Urea 1 g/L, CSL 36.5 ml/L, nicotinic acid 5.25 mg/L, thiamine HC₁ 2 mg/L, 0-alanine 5 mg/L, FeSO₄-7H₂O 5.5 mg/L , CuSO₄ 1 mg/L, AZ-20R 0.25 ml/L) 가 포함된 2.5 L 발효조 (코바이오텍)에 5% (v/v) 되도록 식균하였다. 배양온도는 31.
5%가 되는 시점에 온도를 37℃로 올려줌으 로서 균체 농도로 가는 탄소의 흐름을 줄이고 L-lysine 생 산을 높이고자 하였다. 그리고 mutant strain의 경우에는 배 양 온도를 33 ℃ 로 유지하여 배양한 것과 초기 발효조의 배양 온도를 33℃로 유지하여 배양하면서 PCV가 7.5%가 되는 시점에 배양 온도를 35笆로 올려 주고 배양한 것을 비교하였다. Fig.
glutamicum C₁₄-49-3-15-7-3-20 균주를 유가식 배양법으로 배양할 때 온도가 균체 농도 및 L-lysine 생산에 미치는 영향을 알아보고자 하였다. 모 균주의 경우 발효 초기의 온도는 33℃로 유지하여 배양하 면서, PCV가 7.5%가 되는 시점에 온도를 37℃로 올려줌으 로서 균체 농도로 가는 탄소의 흐름을 줄이고 L-lysine 생 산을 높이고자 하였다. 그리고 mutant strain의 경우에는 배 양 온도를 33 ℃ 로 유지하여 배양한 것과 초기 발효조의 배양 온도를 33℃로 유지하여 배양하면서 PCV가 7.
glutamicum I 와 salt-tolerant mutant strain C₁₄-49-3-15-7-3-20 균주를 유가식 배양법으로 배양하여 균의 생장 및 L-lysine 생산량을 알아보았다. 배 양시 초기 발효조의 온도를 33℃로 유지하여 배양하면서, PCV가 7.5%가 되는 시점에 온도를 37℃로 올려줌으로서 균체 농도로 가는 탄소의 흐름을 줄이고 L-lysine 생산을 높이고자 하였다. 그 결과 salt-tolerant mutant strain C₁₄-49-3-15-7-3-20의 경우 균체 농도가 (ODm) 91.
9로 조절하여 종배양하여 균체 농도 (OD6io) 35-40 정도까지 배양한 다음 본배양 배지 LM에 접종하였다. 본배양은 1.3 L의 본배양 배지 LM (sucrose 18 g/L, 당 밀 12 g/L, (NH₄)2SO₄ 40 g/L, MgSO₄-7H₂O 0.6 g/L, KH₂PO₄ 0.6 g/L, CSL 20 ml/L, nicotinic acid 1.5 mg/L, thiamine HQ 2.3 mg/L, d-biotin 200 ug/L, FeSO-7H₂O₄ 11 mg/L, AZ-20R 0.2 ml/L)이 포함된 5 L 발효조 (코바이오텍)에 18% (v/v) 가 되도록 식균하였다. 발효 기간 동안 NHQH를 이용하여 pH 6.
5 g/L, Agar 22 g/L)에 접종하여 30℃에서 36-40시간 계대 배양한 뒤 5 ml의 전배양 배지 PS (sucrose 50 g/L, KH₂PO₄ 1 g/L, Urea 1 g/L, CSL 12 ml/L, polypeptone 10 g/L, yeast extract 10 g/L, nicotinic acid 3 mg/L, thiamine HC₁ 1 mg/L, d-biotin 50 ug/L, f-alanine 5 mg/L)를 포함한 50 ml 삼각플라스크에 1 loop 접종한다. 진탕배양기 (30℃, 250 rpm)로 8-12시간 배양하여 균체 농 도 (ODm)가 5-6 일 때, 10 ml의 F-선별 배지 (sucrose 70 g/L, 당밀 30 g/L, (NHQ2SO₄ 50 g/L, CaCO₃ 50 g/L, KH₂PO₄ 0.5 g/L, MgSO<7H₂O 0.5 g/L, CSL 14 ml/L, thiamine HC₁ 0.3 mg/L, MnSO, 2 mg/L, FeSOWHQ 2 mg/L, d-biotin 1 mg/L)가 포함된 100 ml 삼각플라스크에 5%를 접종하여 진탕 배양기 (30℃, 200 rpm)로 5-6일 배양 하였다.
8%이었다(Data not shown). 하지만 mutant strain C₁₄-49-3-15-7-3-20의 경우 온 도를 37℃로 올려주었을 때 균의 생장 속도가 느려지는 것으로 보아 temperature- sensitive mutant인 것으로 사료되어 다음과 같은 실험을 수행하였다.

대상 데이터

본 연구에서는 Corynebacterium glutamicum I [S-aminoethyl- L-cystein (AEC)r, a-amino-P-hydroxyvaleric acid (AHV)r, temperature1, fmoropynwate(F-pyr)"]를 이용하였다.
모균주 I와 salt-tolerant mutant를 osmoprotectant인 0.9 g/L 의 proline이 포함되어 있는 high salt medium에서 배양하였 다(Table 2). 모균주 I는 고농도의 salt가 포함되어 있는 배 지에 osmoprotectant 를 첨가하였을 경우 첨가하지 않은 경 우보다 더 잘 자라고 L-lysine 생산량도 높을 것이다.
Salt-tolerant mutant를 분리하기 위해 먼저 모균주 I에 NTG를 처리하여 인공 돌연 변이를 수행한 후 9%의 NaCI 이 포함된 SA 액체 배지에서 emichment시켰다. 배양 중 모균주 17} 생장하지 않는 9%의 NaClo] 포함된 SA 배지 에 도말하여 빠르게 생장한 균주를 선별하였다. Flask 배양 을 수행한 후 L-lysine 생산량을 정량한 결과 모균주 I는 53.

이론/모형

균체 농도 측정은 optical density (O.D.)와 pack cell volume (PCV) 방법을 이용하였다. O.
의 경우 균체 배양 액을 증류수로 적절히 희석하여 spectrophotometer 를 측정하였고, PCV는 균체 배양액 10 mL을 4000 rpm에서 10분간 원심분리한 후 상등액을 이용하여 측정하였다. 배양액의 당 농도 분석은 Bertrand method 법을 이용하여 total carbohydrate를 측정하였으며 환원당 정량은 glucose (Sigma)를 표준시료로 사용하여 DNS (Aldrich) 방법으로 측 정하였다 (10).

성능/효과

F-선별 배지의 당농도에 따른 균체 생장 및 L-lysine 생 산량을 알아보고자 하였다. 10%, 15%, 17%로 당농도를 달 리하여 배양한 결과 salt-tolerant mutant C₁₄-49-3-15-7-3-20 균주는 모든 농도에서 모균주 I보다 growth 및 L-lysine 생 산량이 높았다(Fig. 2). 모균주 I의 경우에는 당농도가 높아 짐에 따라 L-lysine 생산량이 낮아지는 반면 salt-tolerant mutant strain C₁₄-49-3-15-7-3-20은 10%와 15%의 당농도에서 60.
배양 중 모균주 17} 생장하지 않는 9%의 NaClo] 포함된 SA 배지 에 도말하여 빠르게 생장한 균주를 선별하였다. Flask 배양 을 수행한 후 L-lysine 생산량을 정량한 결과 모균주 I는 53.3 이L의 I시ysine을 생산하였고 수율이 51.6%로 나타났다. 반면 salt-tolerant mutant C₁₄-49-3-15-7-3-20 균주는 61.
1). control0.25%와 8%, 9%, 10%의 NaCI이 포함된 배지에서 배양한 결과 mutant들은 8 %, 9 %, 10 %의 NaCI이 포함되어 있는 배지에서 모균주 인 I보다 OD 값이 높았고 growth rate도 높았다. 10%의 NaCI이 포함되어 있는 배지에서 모균주 I의 균체 생장이 94% 정도 inhibition 받은 반면 salt-tolerant mutant strain C₁₄-49-3-15-7-3-20의 경우에는 약 78% 정도 inhibition 받았 다.
5%가 되는 시점에 온도를 37℃로 올려줌으로서 균체 농도로 가는 탄소의 흐름을 줄이고 L-lysine 생산을 높이고자 하였다. 그 결과 salt-tolerant mutant strain C₁₄-49-3-15-7-3-20의 경우 균체 농도가 (ODm) 91.0, L-lysine 농도 113 g/L, L-lysine 수율 41.8%이었다(Data not shown). 하지만 mutant strain C₁₄-49-3-15-7-3-20의 경우 온 도를 37℃로 올려주었을 때 균의 생장 속도가 느려지는 것으로 보아 temperature- sensitive mutant인 것으로 사료되어 다음과 같은 실험을 수행하였다.
5%를 나타내었다. 그러므로 NaCl에 내성을 가진 C. glutamicum C₁₄-49-3-15-7-3 균주의 배양 온 도에 따른 L-lysine 생산 양상을 살펴본 결과 초기 발효 온 도는 33℃로 유지하여 배양하면서, PCV가 6-8%가 되는 시 점에 배양 온도를 35 ℃ 로 배양하는 것이 L-lysine의 생산에 적합한 것으로 사료된다.
2). 모균주 I의 경우에는 당농도가 높아 짐에 따라 L-lysine 생산량이 낮아지는 반면 salt-tolerant mutant strain C₁₄-49-3-15-7-3-20은 10%와 15%의 당농도에서 60.3 g/L, 59.6 g/L로 생산량이 거의 비슷하였고 17%일 때 균체 농도가 (ODsio) 23.2, L-lysine 47.4g/L로 growth와 생산량이 감소하였다.
하지만 salt-tolerant mutants의 경우에는 salt-tolerance를 가지고 있기 때문에 proline이 포함되어 있는 배지와 포함되어 있지 않은 배지에서의 growth 및 L-lysine 생산량이 비슷할 것이다. 실험을 수행한 결과 I 균주의 경우 2%의 salt만 포 함되어 있는 배지에서 균체 농도 (OD610) 25.0, 생산량이 43.5 g/L인 반면 proline이 첨가된 배지에서는 균체 농도 (ODjio) 31.0 g/L, 생산량이 50.1g/L로 증가하였다. 그러나 mutant strain C₁₄-49-3-15-7-3-20의 경우에는 2%의 NaCIe 첨가하고 proline 을 첨가하지 않았을 경우 균체 농도 (ODmo) 는 33.
3). 이러한 결과를 바탕으로 하여 C₁₄-49-3-15-7-3-20 균주는 salt-tolerance를 가지고 있어서 배지 내에 고농도의 당과 salt를 첨가하여 osmolality가 높은 환경에서도 잘 견딜 수 있는 것으로 사료된다.

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표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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