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문제 정의
- 따라서 본 연구는 C. glutamicum의 유가식 배양과 연속 배 양에 의한 L-lysine 생산성을 알아보고 L-lysine 생산성을 증대시키기 위한 2단계 연속 발효 공정을 확립하고자 하는데 목적 이 있다.
제안 방법
- L-lysinedml 생산을 Corynebacterium glutamicum SH35을 이용하여 유가식 배양법과 연속 배양법으로 수행하였다. 유가 식 배양에 의한 lysine 생산을 조사한 결과 최종 발효액 중의 lysine 농도는 1292 g/L, lysine 수율 및 productivity는 각각 47%, 3.
- 균 배양 시 질소원의 농도가 낮으면, celle 잉여 탄소 원을 세포 내의 reserve material들의 형태로 축적하게 되므로(16) 연속배양에 의한 lysine 생산에서 reservoir 내의 질소원 농도가 균의 생장 및 lysine 생산에 미치는 영향을 조사하였다. :질소 원인 ammonium s마fate 의 농도가 15 g/L, 20 g/L, 25 g/L으 로 높아질수록 균체 농도(ODm)는 각각 48, 62, 68로 증가하였다.
- 이러한 문제점을 개선하고 자 first stage는 균이 생장하는 조건으로 하고 second stage는 product를 생산하는 조건으로 하여 생산성을 향상시킬 수 있는 two-stage 연속배양을 수행하였다. 균의 생장을 위한 first stage는 탄소 원이 결핍 요소인 single-stage 연속배양과 동일하게 수행하였으며 product 생산을 위한 second stage는 온도를 37 ℃ 로 높여 균의 생장으로 가는 탄소 원의 흐름을 낮추어줌으로써 lysine 생산으로 가는 탄소 원의 양을 증대 시켜 lysine 농도 및 lysine 수율을 높이고자 하였다. Lysine 생산을 위한 two-stage 연속배양에서 second stage의 dilution rate에 따른 균의 생장, 당의 소모량과 lysine 생산량을 관찰한 결과 dilution rate이 0.
- 균주 C. glutamicum SH 35에 의한 lysine 생산을 5 L 발효 조를 이용하여 유가식 배양으로 수행하였다. 초기 당 농도에 의해 균의 생장이 저해되는 것을 방지하기 위해 발효 초기 당 농도는 30 g/L로 하였으며 당이 고갈될 즈음에 추가 배지 F를 첨가해 당의 농도가 10 g/L 이하가 되지 않도록 조절하면서 배양하였다(3, 14, 15).
- 균주 C. glutamicum SH 35의 single-stage 연속배양에 의한 최적 lysine 생산 조건을 확립하기 위해 연속배양에서 Reservoir 내의 탄 소원 농도가 균의 생장 및 lysine 생산에 미치는 영향을 조사하였다(Table 1). 연속배양에서는 결핍 요소(limited nutrient)의 농도에 의해 steady-state에서의 균체 농도가 조절되므로(15, 16), 당의 농도를 60 g/L에서 116 g/L로 높였을 때, 균체 농도(ODg)는 30에서 61로 증가하였고, lysine 농도, lysine 수율 및 lysine productivity 역시 당의 농도가 높아질 수 록 증가되었다.
- 9로 조절하여 배양하였다. 본 배양은 종 배양에서 균체 농도(ODso) 35-40 정도까지 배양한 뒤 LM 배지가 포함된 5 L 발효조(코바이오텍)에 18%(v/v)가 되도록 식균하여, 통 기량은 1 vvm, 교반 속도는 850 rpm 그리고 NHQH를 이용하여 pH 6.9로 조절하여 배양하였다. 초기 발효조의 온도 는 33℃로 유지하여 배양하면서, packed cell volume(PCV)이 8%가 되었을 때 37笆로 올려주어 배양하였다.
- 4배 정도 증가하였다. 연속 발효 공정을 통해 생산 역가의 향상은 있었으나, lysine 농도와 수율이 낮아 이에 대한 해결책으로 two-stage 연속 배양 방법을 수행하였다. 그 결과, 연속 배양 발효 수행 시보다 lysine 농도는 2배 정도 증가하였으며, lysine 수율은 46%로서 유가식 배양과 비슷한 정도로 얻어졌다.
- 연속배양의 경우 product 생성 비율은 dilution rate에 따라 달라지므로(2, 15), 탄소 원이 결핍 요소인 single-stage 연속배양에서 dilution rate이 균의 생장 및 lysine 생산에 미치는 영향을 조사하였다(Figure 3). Dilution rate이 0.
- Single-stage 연속배양을 수행한 결과 유가식 배양에 의한 lysine 생산보다 productivity의 향상은 있었으나 lysine의 농도 및 수율이 낮은 문제점이 있었다. 이러한 문제점을 개선하고 자 first stage는 균이 생장하는 조건으로 하고 second stage는 product를 생산하는 조건으로 하여 생산성을 향상시킬 수 있는 two-stage 연속배양을 수행하였다. 균의 생장을 위한 first stage는 탄소 원이 결핍 요소인 single-stage 연속배양과 동일하게 수행하였으며 product 생산을 위한 second stage는 온도를 37 ℃ 로 높여 균의 생장으로 가는 탄소 원의 흐름을 낮추어줌으로써 lysine 생산으로 가는 탄소 원의 양을 증대 시켜 lysine 농도 및 lysine 수율을 높이고자 하였다.
- 초기 당 농도에 의해 균의 생장이 저해되는 것을 방지하기 위해 발효 초기 당 농도는 30 g/L로 하였으며 당이 고갈될 즈음에 추가 배지 F를 첨가해 당의 농도가 10 g/L 이하가 되지 않도록 조절하면서 배양하였다(3, 14, 15). 초기 발효조의 온도는 생장 최적 온도인 33T로 유지하여 배양하였으며 균체 농도(PCV)가 8%가 되는 시점에 온도를 37℃로 올려줌으로써 균체로 가는 탄소 원의 흐름을 줄여 lysine 생산 수율을 높이고자 하였다. L-Lysine의 생산은 균의 생장과 함께 lysine 농도가 증가하는 양상을 나타내었으며, 균의 생장이 정지기에 도달한 21시간 이후에도 lysine의 농도는 계속 증가하다가 38시간 후에 최대 농도를 나타내었다(Figure 2).
대상 데이터
- Single-stage 연속배양에서는 첨가 배지로 LM 배지에서 sucrose 64.8 g/L, 당밀 43.2 g/L, (NH4)2SO4 30 g/L로 농도를 바꾸어준 R1 배지를 사용하였다. Two-stage 연속배양에서는 second stage의 첨가 배지로 LM 배지에서 sucrose 300 g/L, 당 밀 200 g/L, (NH4)2SO4 100 g/L의 농도로 바꾸어준 R2 배지를 사용하였다.
- 2 g/L, (NH4)2SO4 30 g/L로 농도를 바꾸어준 R1 배지를 사용하였다. Two-stage 연속배양에서는 second stage의 첨가 배지로 LM 배지에서 sucrose 300 g/L, 당 밀 200 g/L, (NH4)2SO4 100 g/L의 농도로 바꾸어준 R2 배지를 사용하였다.
- 본 연구에서는 Corynebacterium ghttandcum SH 35 [S-aninoethyl- L-cystein(AEC)r, a-amino- -hydroxy valeric acid(AHV)r, temperature1, fluoropyruvate(F-pyr)8 ] 를 이용하였다.
이론/모형
- 균체 농도 측정은 optical density(OD)와 pack cell volume (PCV) 방법을 이용하였다. OD의 경우 균체 배양액을 증류수로 적절히 희석하여 spectrophotometer(Spectronic 20+, Milton Roy)를 이용해 610 nm에서 흡광도를 측정하였고, PCV는 균체 배양액 10 mL을 2000 rpm에서 10분 동안 원심분리한 뒤 상등액을 이용하여 측정하였다.
- 배양액의 당 농도 분석은 glucose(sigma)를 표준시료로 사용한 DNS 방법(17)으로 측정하였다.
성능/효과
- 을 이용하여 유가식 배양법과 연속 배양법으로 수행하였다. 유가 식 배양에 의한 lysine 생산을 조사한 결과 최종 발효액 중의 lysine 농도는 1292 g/L, lysine 수율 및 productivity는 각각 47%, 3.08 g・L」・h」이였다, Single-stage 연속 배양에서 dilution rate에 따른 균의 생장 및 lysine 생산을 조사한 결과, critical dilution ratee 0.100 "으로 이때 균체 농도(OEkio)는 67, lysine 농도는 44.0 g/L 그리고 lysine 수율 및 productivity 는 41%, 4.39 厂1「审'이고 lysine 연속배양 시 최적의 dilution rate 이였다, 또한 lysine 생산을 위한 medium reservoir 내의 최적 탄 소원 농도, 최적 질소원(ammonium sulfate) 농도 및 최적 pH는 각각 108 입L, 25 g/L 및 6.9이었다 유가식 배양법과 single-sta응e 연속 배양법에 의한 lysine 생산에서, productivity는 유가식 배양의 경우 3.08 g인 반면, 연속 배양에서는 4.39로 유가식 배양법에서보다 약 1.4배 정도 증가하였다. 연속 발효 공정을 통해 생산 역가의 향상은 있었으나, lysine 농도와 수율이 낮아 이에 대한 해결책으로 two-stage 연속 배양 방법을 수행하였다.
- L-Lysine의 생산은 균의 생장과 함께 lysine 농도가 증가하는 양상을 나타내었으며, 균의 생장이 정지기에 도달한 21시간 이후에도 lysine의 농도는 계속 증가하다가 38시간 후에 최대 농도를 나타내었다(Figure 2). 유가식 배양에 의한 lysine 생산 결과 최종 발효액 중의 균체 농도(ODg)는 108, lysine 농도는 129.2 g/L, lysine 수율은 47%이었으며, productivity는 3.08 g "「였다.
- 균 배양 시 질소원의 농도가 낮으면, celle 잉여 탄소 원을 세포 내의 reserve material들의 형태로 축적하게 되므로(16) 연속배양에 의한 lysine 생산에서 reservoir 내의 질소원 농도가 균의 생장 및 lysine 생산에 미치는 영향을 조사하였다. :질소 원인 ammonium s마fate 의 농도가 15 g/L, 20 g/L, 25 g/L으 로 높아질수록 균체 농도(ODm)는 각각 48, 62, 68로 증가하였다. Ammonium sulfate의 농도를 20 g/L, 25 g/L로 연속배양을 수행하였을 때 소모된 당량은 거의 차이를 보이지 않았으나, 균체 농도(ODm)는 각각 62, 68로 ammonium sulfate 농도가 25 g/L일 때 높게 나타났다.
- :질소 원인 ammonium s마fate 의 농도가 15 g/L, 20 g/L, 25 g/L으 로 높아질수록 균체 농도(ODm)는 각각 48, 62, 68로 증가하였다. Ammonium sulfate의 농도를 20 g/L, 25 g/L로 연속배양을 수행하였을 때 소모된 당량은 거의 차이를 보이지 않았으나, 균체 농도(ODm)는 각각 62, 68로 ammonium sulfate 농도가 25 g/L일 때 높게 나타났다. 그러나 lysine 농도는 각각 47.
- 균의 생장을 위한 first stage는 탄소 원이 결핍 요소인 single-stage 연속배양과 동일하게 수행하였으며 product 생산을 위한 second stage는 온도를 37 ℃ 로 높여 균의 생장으로 가는 탄소 원의 흐름을 낮추어줌으로써 lysine 생산으로 가는 탄소 원의 양을 증대 시켜 lysine 농도 및 lysine 수율을 높이고자 하였다. Lysine 생산을 위한 two-stage 연속배양에서 second stage의 dilution rate에 따른 균의 생장, 당의 소모량과 lysine 생산량을 관찰한 결과 dilution rate이 0.5 h」에서 0.075 h」로 낮아질수록 균체 농도, lysine 농도 및 수율이 증가하는 것으로 나타났다. Second stage의 dilution rate을 0.
- Single-stage 연속배양에 의한 lysine 생산을 유가식 배양에 의한 lysine 생산과 비교해 보았을 때 유가식 배양의 경우 lysine 수율이 47%로 연속배양에 의한 lysine 수율 41%보다 6% 정도 높게 나타났다. 그러나 lysine productivity-2] 경우 유가식 배양의 의한 경우에는 3.
- Single-stage 연속배양을 수행한 결과 유가식 배양에 의한 lysine 생산보다 productivity의 향상은 있었으나 lysine의 농도 및 수율이 낮은 문제점이 있었다. 이러한 문제점을 개선하고 자 first stage는 균이 생장하는 조건으로 하고 second stage는 product를 생산하는 조건으로 하여 생산성을 향상시킬 수 있는 two-stage 연속배양을 수행하였다.
- Tow-stage 연속배양으로 lysine을 생산하였을 경우 lysine 농도는 single-stage 연속배양(44 g/L)에서보다 약 2배 증가하였으며, 수율 역시 single-stage 연속배양의 41%보다 약 4-5% 가 증가된 45-46%로 나타났다 이 결과로 two-stage 연속배양을 통해 single-stage 연속배양에서 lysine 농도 및 수율이 낮을 점을 보완할 수 있으며 산업적인 이용 가능성도 있을 것으로 사료된다.
- 연속 발효 공정을 통해 생산 역가의 향상은 있었으나, lysine 농도와 수율이 낮아 이에 대한 해결책으로 two-stage 연속 배양 방법을 수행하였다. 그 결과, 연속 배양 발효 수행 시보다 lysine 농도는 2배 정도 증가하였으며, lysine 수율은 46%로서 유가식 배양과 비슷한 정도로 얻어졌다. 이러한 실험 결과로 미루어 lysine 생산 역가 향상을 위한 방법으로 two-stage 연속배양의 산업적인 이용 가능성이 있을 것으로 사료된다.
- Single-stage 연속배양에 의한 lysine 생산을 유가식 배양에 의한 lysine 생산과 비교해 보았을 때 유가식 배양의 경우 lysine 수율이 47%로 연속배양에 의한 lysine 수율 41%보다 6% 정도 높게 나타났다. 그러나 lysine productivity-2] 경우 유가식 배양의 의한 경우에는 3.08 g-Ll -hl인 반면 연속 배양의 경우에는 42%가 높은 4.39 g・L」・h」가 얻어졌다, 따라서 lysine 생산을 위한 연속배양은 유가식 배양에 비해 lysine 수율이 낮으나, 높은 productivhy를 유지하면서 장시간 lysine 생산이 가능하므로 lysine 생산성 향상을 가져올 수 있을 것으로 사료된다.
- 발효에 의한 lysine 생산에서 pH는 lysine 유출에 영향을 주는 요소 중의 하나로 알려져 있으므로(3), single-stage 연속 배양에서 pH가 균의 생장 및 lysine 생산에 미치는 영향을 조사하였다' pH를 6.0 - 8.0으로 조절하여 연속배양을 수행하였을 때 균체 농도는 pH의 변화에 관계없이 일정하였으나, lysine 농도, lysine 수율 및 lysine productivity는 pH에 따라 변화되는 것으로 나타났다(Table 2). pH 6Q으로 조절하여 연속배양을 수행한 결과 lysine 농도, lysine 수율 및 lysine prod나cHvity는 각각 35.
- glutamicum SH 35의 single-stage 연속배양에 의한 최적 lysine 생산 조건을 확립하기 위해 연속배양에서 Reservoir 내의 탄 소원 농도가 균의 생장 및 lysine 생산에 미치는 영향을 조사하였다(Table 1). 연속배양에서는 결핍 요소(limited nutrient)의 농도에 의해 steady-state에서의 균체 농도가 조절되므로(15, 16), 당의 농도를 60 g/L에서 116 g/L로 높였을 때, 균체 농도(ODg)는 30에서 61로 증가하였고, lysine 농도, lysine 수율 및 lysine productivity 역시 당의 농도가 높아질 수 록 증가되었다. 당 농도가 108 g/L일 때 균체 농도(ODmo)는 61로 당 농도를 60 잉L로 하였을 때 보다 균체 농도가 1.
후속연구
- 그 결과, 연속 배양 발효 수행 시보다 lysine 농도는 2배 정도 증가하였으며, lysine 수율은 46%로서 유가식 배양과 비슷한 정도로 얻어졌다. 이러한 실험 결과로 미루어 lysine 생산 역가 향상을 위한 방법으로 two-stage 연속배양의 산업적인 이용 가능성이 있을 것으로 사료된다.
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