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문제 정의
- 개발된 방법은 기존의 방법에 비해 충분히 비교할 만큼 빠른 분석시간과 고감도, 우수한 재현성을 보여주었다. 따라서 본 연구의 결과는 유전성대사이상 질환을 신속하게 스크리닝하거나 환자를 진단하고 모니터링을 하는데 매우 유용함을 보여주었기에 이를 보고하고자 한다.
- 따라서, 이 연구에서 개발한 방법은 유전성대사질환인 유기산과 아미노산 대사이상질환 환자의 진단과 환자의 follow-up 모니터링에 이용할 수 있을 것이다. 본 연구에서는 실제 유전성대사질환 환자(프로피온산뇨증, 메틸말론산뇨증)의 검체를 적용해 봄으로써 이 방법의 유용함을 제시하였다.
- 본 연구에서는 임상적 스크리닝 및 진단을 목적으로 GC-MS를 사용하여 기존의 방법보다 신속, 간편하게 유기산과 아미노산을 정량분석하는 방법을 개발하였다. 분석의 전처리 시간면을 살펴보면 twostep 유도체화를 함으로서 기존의 유도체화 방법보다 시간을 대폭 단축하였으며, 소변여지의 사용을 통해 이동의 편이성을 도모하였고, 시료의 matrix interference를 최소화 하였다.
- 이 연구는 임상적으로 유기산과 아미노산 대사이상질환을 진단하기위한 간단하고 편리한 스크리닝 방법을 개발하는데 주안점을 두었다. 또한 소변여지로부터 유기산과 아미노산을 추출한 후 TMS-TFA유도체화를 만든후 분석함으로써 실제적으로 본 방법의 효율성을 다음과 같이 보여주었다.
제안 방법
- GC/MS의 scanning mode에서 얻어진 크로마토그램으로부터 각 아미노산과 유기산 표준품의 머무름 시간과 일치하는 피크를 확인 동정하여 질량스펙트럼을 얻었다. 선택이온 모드(selective ion mode, SIM)를 수행하기위한 최적 이온 선택을 위해 유도체화 한 아미노산과 유기산의 분자량(Formula weight, FW), 분자피크(M+), 머무름 시간(retention time, RT), 상대 머무름 시간(relative retention time, RRT), 상대감응인자(relative response factor, RRF)를 조사하였다.
- 시료주입시의 split 비율은 1:10으로 하였다. m/z 50-550까지 full scan mode로 스캔하여 유도체화한 분열양상을 확인하였다. 정량에 이용된 이온은 Table 1에 나타내었다.
- 본 연구에서는 첫째, 소변여지를 사용하여 임상검체의 이동과 분석이 용이하도록 하였으며, 소변여지를 이용한 유기산과 아미노산 분석법을 통하여 시료 중의 matrix effect를 최소화 하였다. 둘째, 앞에서 언급한 TMS 유도체법의 단점을 개선하면서 유기산과 아미노산이 동시에 유도체화시킬 수 있는 two-step TMS(trimethylsilylation)와 TFA(trifluoroacetylation) 동시 유도체화법을 개발하였다(Fig. 1). 셋째, 개발된 방법을 실제 대사이상질환 환자시료에 적용하여 정확한 진단이 가능한지 실용성의 유무를 검증하였다.
- 이 연구는 임상적으로 유기산과 아미노산 대사이상질환을 진단하기위한 간단하고 편리한 스크리닝 방법을 개발하는데 주안점을 두었다. 또한 소변여지로부터 유기산과 아미노산을 추출한 후 TMS-TFA유도체화를 만든후 분석함으로써 실제적으로 본 방법의 효율성을 다음과 같이 보여주었다.
- 본 연구에서는 첫째, 소변여지를 사용하여 임상검체의 이동과 분석이 용이하도록 하였으며, 소변여지를 이용한 유기산과 아미노산 분석법을 통하여 시료 중의 matrix effect를 최소화 하였다. 둘째, 앞에서 언급한 TMS 유도체법의 단점을 개선하면서 유기산과 아미노산이 동시에 유도체화시킬 수 있는 two-step TMS(trimethylsilylation)와 TFA(trifluoroacetylation) 동시 유도체화법을 개발하였다(Fig.
- 앞의 조사를 근거로 분자량 100 이상으로 다른 성분 피크의 영향을 받지 않는 이온을 정량이온(quantification ion, QI)으로 정하였고, 유도체화한 분자피크로서 피크 이온의 상대 강도가 20% 이상인 피크를 검토한 결과, TMS 유도체화된 분자이온(M＋), 혹은 분자이온에서 CH3기가 떨어진 M-15 이온이 확인 이온으로 적합하였다(Table 1). 선정된 선택이온과 확인이온, 각각의 이온이 나타나는 아미노산과 유기산 피크의 머무름 시간을 근거로 하여 SIM 모드의 한 구간 당 2-3개의 화합물을 설정하여 SIM 프로그램을 완성시켰다. 국내에서 발생하는 메틸말론산뇨증, 프로피온산뇨증, 이소발레릴산뇨증의 3가지 대사이상질환 진단을 본 방법으로 임상적용하기 위해 각 질환의 마커에 해당하는 유기산과 아미노산의 동시분석을 위한 target compound를 선정하였다(Table 2) target compound의 직선성을 보이는 범위는 0.
- GC/MS의 scanning mode에서 얻어진 크로마토그램으로부터 각 아미노산과 유기산 표준품의 머무름 시간과 일치하는 피크를 확인 동정하여 질량스펙트럼을 얻었다. 선택이온 모드(selective ion mode, SIM)를 수행하기위한 최적 이온 선택을 위해 유도체화 한 아미노산과 유기산의 분자량(Formula weight, FW), 분자피크(M+), 머무름 시간(retention time, RT), 상대 머무름 시간(relative retention time, RRT), 상대감응인자(relative response factor, RRF)를 조사하였다. 앞의 조사를 근거로 분자량 100 이상으로 다른 성분 피크의 영향을 받지 않는 이온을 정량이온(quantification ion, QI)으로 정하였고, 유도체화한 분자피크로서 피크 이온의 상대 강도가 20% 이상인 피크를 검토한 결과, TMS 유도체화된 분자이온(M＋), 혹은 분자이온에서 CH3기가 떨어진 M-15 이온이 확인 이온으로 적합하였다(Table 1).
- 1). 셋째, 개발된 방법을 실제 대사이상질환 환자시료에 적용하여 정확한 진단이 가능한지 실용성의 유무를 검증하였다. 개발된 방법은 기존의 방법에 비해 충분히 비교할 만큼 빠른 분석시간과 고감도, 우수한 재현성을 보여주었다.
- 농축을 위해 Thermo vap(PIERCE Model 18780)을 사용하였다. 시료 전처리 과정을 위해 TAITEC(Tokyo, JAPAN)사의 incubator/shaker를 이용하여 증발 농축 및 유도체화 반응을하였다.
- 아미노산과 유기산 각각의 표준원액과 내부표준액의 원액 제조시, 아미노산은 2차 증류수에 녹였고, 유기산은 메탄올에 녹여서 stock solution의 농도를 10 mmol/L로 제조하였다. 실험용 표준용액과 내부표준용액은 40배 희석한 250 μmol/L의 농도로 제조하여 사용하였다.
- 선택이온 모드(selective ion mode, SIM)를 수행하기위한 최적 이온 선택을 위해 유도체화 한 아미노산과 유기산의 분자량(Formula weight, FW), 분자피크(M+), 머무름 시간(retention time, RT), 상대 머무름 시간(relative retention time, RRT), 상대감응인자(relative response factor, RRF)를 조사하였다. 앞의 조사를 근거로 분자량 100 이상으로 다른 성분 피크의 영향을 받지 않는 이온을 정량이온(quantification ion, QI)으로 정하였고, 유도체화한 분자피크로서 피크 이온의 상대 강도가 20% 이상인 피크를 검토한 결과, TMS 유도체화된 분자이온(M＋), 혹은 분자이온에서 CH3기가 떨어진 M-15 이온이 확인 이온으로 적합하였다(Table 1). 선정된 선택이온과 확인이온, 각각의 이온이 나타나는 아미노산과 유기산 피크의 머무름 시간을 근거로 하여 SIM 모드의 한 구간 당 2-3개의 화합물을 설정하여 SIM 프로그램을 완성시켰다.
- 회수율 및 정밀도 실험결과는 Table 5와 같다. 정량 가능한 농도 중 낮은 농도(정량한계(LOQ)를 포함하는 농도), 중간농도, 높은 농도를 포함하는 0.5, 5, 50 ng/mL을 뇨시료에 첨가한 뒤 회수율을 구하였다. 0.
- 정밀도 측정은 낮은 농도, 중간농도, 높은 농도인 0.5, 5, 50 ng/mL 첨가하여 between-day assay로 5일 동안 매일 3회씩 측정하였다. 낮은 농도인 0.
- 소변여지의 추출액 중 100 μL씩을 반응 용기에 취하여 질소로 증발 건고 하였다. 증발건고한 액에 지시약으로 메틸오렌지를 넣고 마개를 닫은 다음, 메틸오렌지가 적색이 될 때까지 MSTFA를 넣고 60℃에서 10분 간 반응시켜 카르복시기에만 trimethylsilylation(TMS)하였다. 계속하여 60℃에서 15분 간 MBTFA를 넣고 반응시킴으로서 아미노기에 trifluoroacetylation 하였다.
대상 데이터
- GC-MSD 시스템은 Hewlett-Packard 6890 Gas chromatgraphy와 HP 5973 Mass selective detector를 이용하였다. 컬럼으로는 Hewlett-Packard의 fused silica capillary column Ultra 2(5% Phenyl methyl siloxane, 25 m×0.
- 지시약인 methyl orange와 유도체화 시약인 N-Methyl-N-(trimethylsilyl)-trifluoroacetamide(MSTFA) 및 N-Methyl-bis(trifluoro acetamide(MBTFA)를 Sigma 사(MA, USA)로부터 구입하였다. HPLC grade인 아세토니트릴, trifluoroacetic acid, sulfosalicylic acid (SSA)를 Merck(Germany)사에서 구입하였다. 직경이 6 mm인 소변여지는 Schleicher and Schunel사(S&S #900; Dassel, Germany)로부터 공급받았다.
- 선정된 선택이온과 확인이온, 각각의 이온이 나타나는 아미노산과 유기산 피크의 머무름 시간을 근거로 하여 SIM 모드의 한 구간 당 2-3개의 화합물을 설정하여 SIM 프로그램을 완성시켰다. 국내에서 발생하는 메틸말론산뇨증, 프로피온산뇨증, 이소발레릴산뇨증의 3가지 대사이상질환 진단을 본 방법으로 임상적용하기 위해 각 질환의 마커에 해당하는 유기산과 아미노산의 동시분석을 위한 target compound를 선정하였다(Table 2) target compound의 직선성을 보이는 범위는 0.0001-50 mg으로 매우 넓었으며 검출한계(S/N=5)(limit of detection)는 8-200 ng의 범위에 있었고, 정량한계(limit of quantitation)는 80-900 ng의 범위에 있었다. 모든 대사이상 환자는 소변으로 비정상적인 대사물을 정상인에 비해 다량 배출하므로 본 연구에서 확인된 검출한계 및 정량한계가 유용하게 진단에 응용될 수 있다(Table 3).
- 내부표준물질인 tropic acid는 Sigma-Aldrich사(MA, USA)에서 구입하였고, 표준물질인 아미노산 표준품 (glycine 및 propionylglycine, isobutyrylglycine, isovalerylglycine, tiglylglycine), 유기산 표준품 (3-hydroxy propionic acid, Methylmalonic acid, Glutaric acid, Methylcitric acid)도 Sigma-Aldrich사(MA, USA)에서 구입하였다. 지시약인 methyl orange와 유도체화 시약인 N-Methyl-N-(trimethylsilyl)-trifluoroacetamide(MSTFA) 및 N-Methyl-bis(trifluoro acetamide(MBTFA)를 Sigma 사(MA, USA)로부터 구입하였다.
- (Tokyo, JAPAN)를 통해 제조하여 사용하였다. 농축을 위해 Thermo vap(PIERCE Model 18780)을 사용하였다. 시료 전처리 과정을 위해 TAITEC(Tokyo, JAPAN)사의 incubator/shaker를 이용하여 증발 농축 및 유도체화 반응을하였다.
- 내부표준물질인 tropic acid는 Sigma-Aldrich사(MA, USA)에서 구입하였고, 표준물질인 아미노산 표준품 (glycine 및 propionylglycine, isobutyrylglycine, isovalerylglycine, tiglylglycine), 유기산 표준품 (3-hydroxy propionic acid, Methylmalonic acid, Glutaric acid, Methylcitric acid)도 Sigma-Aldrich사(MA, USA)에서 구입하였다. 지시약인 methyl orange와 유도체화 시약인 N-Methyl-N-(trimethylsilyl)-trifluoroacetamide(MSTFA) 및 N-Methyl-bis(trifluoro acetamide(MBTFA)를 Sigma 사(MA, USA)로부터 구입하였다. HPLC grade인 아세토니트릴, trifluoroacetic acid, sulfosalicylic acid (SSA)를 Merck(Germany)사에서 구입하였다.
- HPLC grade인 아세토니트릴, trifluoroacetic acid, sulfosalicylic acid (SSA)를 Merck(Germany)사에서 구입하였다. 직경이 6 mm인 소변여지는 Schleicher and Schunel사(S&S #900; Dassel, Germany)로부터 공급받았다.
- GC-MSD 시스템은 Hewlett-Packard 6890 Gas chromatgraphy와 HP 5973 Mass selective detector를 이용하였다. 컬럼으로는 Hewlett-Packard의 fused silica capillary column Ultra 2(5% Phenyl methyl siloxane, 25 m×0.2 mm, film thickness 0.33 μm)를 사용하였다. 오븐 온도는 80℃에서 2분간 유지하고 80℃에서 290℃까지 분당 5℃씩 증가시켰으며, 290℃에서 5분간 유지시켰다.
성능/효과
- 5, 5, 50 ng/mL을 뇨시료에 첨가한 뒤 회수율을 구하였다. 0.5 ng/mL의 회수율의 평균은 0.43 ng/mL이 회수되어 84.9%, 5 ng/mL의 회수율은 4.42 ng/mL로 회수되어 88.3%, 50 ng/mL의 회수율은 46.9 ng/mL 회수되어 93.8%의 회수율을 보여, 전체 농도범위에서 회수율 실험결과가 매우 양호함을 보여주었다. 소변여지의 회수율을 살펴보면 아미노산인 글리신류는 여지에서 유기산보다는 시간이 갈수록 회수율이 낮아짐을 볼 수 있었다.
- 2%로 낮은 농도에서 between-day assay의 표준편차가 다소 높았다. 각기 다른 농도에서의 재현성을 고찰하기위해 첨가한 전체 농도범위에서 정밀도는 20% 내외로 안정적이었으므로, 본 실험결과의 재현성이 양호함을 보여주었다(Table 5).
- 셋째, 개발된 방법을 실제 대사이상질환 환자시료에 적용하여 정확한 진단이 가능한지 실용성의 유무를 검증하였다. 개발된 방법은 기존의 방법에 비해 충분히 비교할 만큼 빠른 분석시간과 고감도, 우수한 재현성을 보여주었다. 따라서 본 연구의 결과는 유전성대사이상 질환을 신속하게 스크리닝하거나 환자를 진단하고 모니터링을 하는데 매우 유용함을 보여주었기에 이를 보고하고자 한다.
- 소변여지의 회수율을 살펴보면 아미노산인 글리신류는 여지에서 유기산보다는 시간이 갈수록 회수율이 낮아짐을 볼 수 있었다. 메틸말론산뇨증과 프로피온산뇨증에서 현저히 증가하는 유기산인 metylcitric acid는 유기산들 중가장 회수율이 낮았다(Table 5).
- 본 연구에서는 임상적 스크리닝 및 진단을 목적으로 GC-MS를 사용하여 기존의 방법보다 신속, 간편하게 유기산과 아미노산을 정량분석하는 방법을 개발하였다. 분석의 전처리 시간면을 살펴보면 twostep 유도체화를 함으로서 기존의 유도체화 방법보다 시간을 대폭 단축하였으며, 소변여지의 사용을 통해 이동의 편이성을 도모하였고, 시료의 matrix interference를 최소화 하였다. 유기산과 아미노산의 동시분석은 GC-MS selective ion monitoring mode에서 수행하였으며, 양호한 회수율과 직선성, 재현성을 보였다.
- 8%의 회수율을 보여, 전체 농도범위에서 회수율 실험결과가 매우 양호함을 보여주었다. 소변여지의 회수율을 살펴보면 아미노산인 글리신류는 여지에서 유기산보다는 시간이 갈수록 회수율이 낮아짐을 볼 수 있었다. 메틸말론산뇨증과 프로피온산뇨증에서 현저히 증가하는 유기산인 metylcitric acid는 유기산들 중가장 회수율이 낮았다(Table 5).
- 분석의 전처리 시간면을 살펴보면 twostep 유도체화를 함으로서 기존의 유도체화 방법보다 시간을 대폭 단축하였으며, 소변여지의 사용을 통해 이동의 편이성을 도모하였고, 시료의 matrix interference를 최소화 하였다. 유기산과 아미노산의 동시분석은 GC-MS selective ion monitoring mode에서 수행하였으며, 양호한 회수율과 직선성, 재현성을 보였다.
- 모든 대사이상 환자는 소변으로 비정상적인 대사물을 정상인에 비해 다량 배출하므로 본 연구에서 확인된 검출한계 및 정량한계가 유용하게 진단에 응용될 수 있다(Table 3). 유기산과 아미노산의 직선성은 Table 4에서 보는 바와 같이 tiglylglycine만 제외하고 직선성을 나타내는 농도범위에서의 화합물의 상관계수(r2)는 0.994이상을 보였고, glycine의 경우 회귀식은 Y=0.1192X + 0.037 이고, glycine의 상관계수(r2)는 0.9972로 매우 양호한 상관관계를 보였다. Fig.
- 프로피온산뇨증 환자는 propionyl-Co A carboxylase 효소 결핍으로 propionyl-Co A에서 D-methylmalonylCo A로 대사되지 못하여, 비정상적인 대사물인 3-hydroxy propinic acid가 만들어지며 그 외에도 현저히 증가된 propionic acid 나 tiglic acid와 같은 비정상적인 대사물이 glycine과 결합하여 정상인에게서는 전혀 존재하지 않는 tiglylglycine, proppionylglycine의 대사물들의 소변 중으로의 배설이 증가하였다. 특히 프로피온산뇨증은 biomarker인 methylcitric acid(두 개의 isomer)(Fig. 3, peak 10-1, 10-2)가 3-hydroxy propionic acid(Fig. 3, peak 2), proppionylglycine(Fig. 3, peak 7), tiglylglycine(Fig. 3, peak 9)과 함께 비정상적으로 증가함을 볼 수 있었다(Fig. 3).
후속연구
- 따라서, 이 연구에서 개발한 방법은 유전성대사질환인 유기산과 아미노산 대사이상질환 환자의 진단과 환자의 follow-up 모니터링에 이용할 수 있을 것이다. 본 연구에서는 실제 유전성대사질환 환자(프로피온산뇨증, 메틸말론산뇨증)의 검체를 적용해 봄으로써 이 방법의 유용함을 제시하였다.
- 0001-50 mg으로 매우 넓었으며 검출한계(S/N=5)(limit of detection)는 8-200 ng의 범위에 있었고, 정량한계(limit of quantitation)는 80-900 ng의 범위에 있었다. 모든 대사이상 환자는 소변으로 비정상적인 대사물을 정상인에 비해 다량 배출하므로 본 연구에서 확인된 검출한계 및 정량한계가 유용하게 진단에 응용될 수 있다(Table 3). 유기산과 아미노산의 직선성은 Table 4에서 보는 바와 같이 tiglylglycine만 제외하고 직선성을 나타내는 농도범위에서의 화합물의 상관계수(r2)는 0.
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