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문제 정의
- 본 연구에서는 케톤혈증을 초래하는 다양한 질환 중에서 특히, 일반적인 당뇨성 케톤증이나 소아에서의 케톤산혈증을 보이는 다양한 유전성대사이상 질환의 경우에 GC-MS/SIM을 이용하여 혈장 중에서 케톤체를 기존의 효소법보다 감도 높게 동시 정량할 수 있는 분석법을 개발하고자 하였다. 혈장 중 케톤체의 정량을 위하여 oximation-trimethylsilylation 유도체화 (Fig.
- 본 연구에서는 혈액에서 다양한 원인에 의한 케톤증이 발생하였을 때 임상증상만으로는 진단이 어려우므로 재빨리 감별할 수 있는지 GC-MS를 이용하여 분석하였고 β-hydroxy butyrate와 acetoacetate의 비율을 계산하여 기존의 방법보다 간편하게 정상인과 케톤증을 감별 진단하는 방법을 개발하였다. 단계적인 유도 체화인 옥심화와 실릴화는 케토기를 차단하여 휘발성을 높이기 위해 사용되었다.
제안 방법
- GC/MS의 scanning mode에서 얻어진 크로마토그램으로부터 케톤체 표준품의 머무름 시간과 일치하는 피크를 확인 동정하여 질량스펙트럼을 얻었다. SIM을 수행하기 위한 최적 이온 선택을 위해 유도체화 한 화합물의 분자량(Formula weight, FW), 분자피크 (M+), 머무름 시간(retention time, RT), 상대 머무름 시간 (relative retention time, RRT), 상대감응인자(relative response factor, RRF)를 조사하였다.
- SIM을 수행하기 위한 최적 이온 선택을 위해 유도체화 한 화합물의 분자량(Formula weight, FW), 분자피크 (M+), 머무름 시간(retention time, RT), 상대 머무름 시간 (relative retention time, RRT), 상대감응인자(relative response factor, RRF)를 조사하였다. 앞의 조사를 근거로 분자량 100 이상으로 다른 성분 피크의 영향을 받지 않는 이온을 정량이온(quantification ion, QI)으로정하였고, 유도체화한 분자피크로서 피크 이온의 상대 강도가 20% 이상인 피크를 검토한 결과, TMS 유도 체화된 분자이온(M+), 혹은 분자이온에서 CH3기가 떨어진 M-15 이온이 확인 이온으로 적합하였다(Table 1).
- 공시료(분석물질을 넣지 않은 시료)에는 내부표준액을 첨가하여 방해물질의 존재유무를 확인하였다. 정확도는 명목 표준 농도와 일간분석(n=3)으로부터 계산된 피크 면적의 % CV로써의 정밀도에 대한 역산된 값의 비율에의해 결정되었다.
- 계산함으로써 결정하였다. 분석상에서의 불순물의 잔류 정도는 고농도의 케톤체를 측정한 후에 6 개의 공시료 검체를 측정하여 불순물이 없음으로 평가하였다(데이터는 본 논문에 넣지 않았음).
- 8 mL/min였고 시료는 비분할 주입하였고 주입량은 1 µL였다 (split 비율은 1:10). 스캔 범위는 m/z 50-550까지 full scan mode로 스캔하여 oximation-TMS로 유도체화한 후 케톤체의 분열 양상을 확인하였다.
- 단계적인 유도 체화인 옥심화와 실릴화는 케토기를 차단하여 휘발성을 높이기 위해 사용되었다. 신속 간편 정확함을 장점으로 한 분석방법은 케토시스 환자 검체를 적용해 봄으로써 이 방법의 유용함을 제시하였다. 미토콘드리아의 지방산 대사이상질환을 포함한 다양한 유전성 대사질환 중 케토시스를 유발할 수 있는 환자 및 당뇨병과 같은 케토시스 유발하는 일반적인 질환자의 진단이나 환자의 치료후 추적관찰 및 모니터링에 이용할 수 있을 것으로 사료된다.
- 이 액을 vortex mix로 30초 잘 섞은 후 위의 시료 전처리와 동일한 oximation-TMS 유도 체화를 하여 GC-MS로 분석하였다. 여기서 얻은 내부표준물질의 피크면적에 대한 각 분석물질의 피크 면적 비를 가지고 검량선을 작성하였다.
- 25 µm df)은 Agilent Technologies에서 구입하였다. 오븐온도는 80oC에서 4분간 유지하고 180 oC까지 분당 5 oC씩 증가시켰고 그 이후 300 oC 까지 분당 3 oC씩 증가시켰으며 총 19 분 동안 분석하였다. 주입구 온도는 260 oC였고, 이온소스의 온도는 230 oC, 인터페이스 온도는 300 oC였다.
- 서로 3-hydroxybutyric acid, acetoacetic acid를 위의 조제 농도가 되도록 공혈장 100 µL를 각각의 유리튜브에 넣고 여기에 내부표준물질인 2-ketocaproic acid 5 µL를 (10 µg/mL)을 가하고 희석 용매인 메탄올을 가하여 최종부피를 1 mL 로 하였다. 이 액을 vortex mix로 30초 잘 섞은 후 위의 시료 전처리와 동일한 oximation-TMS 유도 체화를 하여 GC-MS로 분석하였다. 여기서 얻은 내부표준물질의 피크면적에 대한 각 분석물질의 피크 면적 비를 가지고 검량선을 작성하였다.
- 앞의 조사를 근거로 분자량 100 이상으로 다른 성분 피크의 영향을 받지 않는 이온을 정량이온(quantification ion, QI)으로정하였고, 유도체화한 분자피크로서 피크 이온의 상대 강도가 20% 이상인 피크를 검토한 결과, TMS 유도 체화된 분자이온(M+), 혹은 분자이온에서 CH3기가 떨어진 M-15 이온이 확인 이온으로 적합하였다(Table 1). 제공받은 혈장과 정상혈장으로 본 방법의 임상적 적용을 하기 위해 케톤체를 동시분석을 위한 각 화합물에 대한 머무름 시간과 정량이온을 선정하였다(Table 1).
- 카보닐그룹의 유도체화로는 oximation이나 methoxymation등이 사용될 수 있으며 본 연구에서는 oximation 후 trimethylsilylation함으로서 카보닐그룹과 하이드록시 그룹을 동시에 유도체화하는 방법을 사용하였다.
- 통합 혈장에 표준액과 내부표준액을 첨가하여 공인된 밸리데이션 절차에 따라 처리하였다. 공시료(분석물질을 넣지 않은 시료)에는 내부표준액을 첨가하여 방해물질의 존재유무를 확인하였다.
- 2% 구연산염이 포함된 sodium citrate tube(덕산, 서울, 대한민국)에 채취하였다. 통합 혈장은 본 연구에서 사용된 동일한 시설에 서동 일한 시료 전처리 과정을 거쳐서 분석하였다. 임상검체의 구성은 소아과 환자 검체로 유기산 분석 결과가 ketosis를 보이는 검체를 수집하였다.
- 표준액 (100 µg/mL)은 공혈장 및 메탄올로 희석하여 최종용액 1 mL 중 β-hydroxybutyric acid, acetoacetic acid의 농도가 각각 0, 1, 2, 10, 20, 및 50 µg/mL 이 되도록 조제하였고 내부표준액 (10 µg/mL)을 첨가하여 검량선의 용액을 조제하였다. 서로 3-hydroxybutyric acid, acetoacetic acid를 위의 조제 농도가 되도록 공혈장 100 µL를 각각의 유리튜브에 넣고 여기에 내부표준물질인 2-ketocaproic acid 5 µL를 (10 µg/mL)을 가하고 희석 용매인 메탄올을 가하여 최종부피를 1 mL 로 하였다.
- 혈장 중 GC/MS로 분석법은 선택이온 모드 (selective ion mode, SIM)를 사용하였고, Table 1과 Fig. 2에서 보는 바와 같이 같이 oximation-TMS의 각 성분의 매우 특징적인 이온을 보였으므로 감도 높은 이온과 분자이온의 두 이온을 정량이온으로 선택하여 분석을 하였다.
- 개발하고자 하였다. 혈장 중 케톤체의 정량을 위하여 oximation-trimethylsilylation 유도체화 (Fig. 1)를사용하여 비교적 m/z 100 이상의 높은 분자량을 선택 이온으로 하여 고체상 추출과 같은 전처리 없이 액체-액체 추출법만으로 전 처리한 후 GC-MS/SIM으로 신속하고 정확한 정량 분석 방법을 개발하였다.
- 회수율은 저농도와 중간 농도(1 µL/mL와 10 µL/ mL)의 표준용액을 혈장에 첨가한 후 추출과정을 거친 표준물질 농도와 추출과정을 거치지 않은 표준물질의 농도를 계산함으로써 결정하였다. 분석상에서의 불순물의 잔류 정도는 고농도의 케톤체를 측정한 후에 6 개의 공시료 검체를 측정하여 불순물이 없음으로 평가하였다(데이터는 본 논문에 넣지 않았음).
대상 데이터
- 내부표준액인 2-ketocaproic acide Sigma사 (MO, USA)로부터 구입하였다. Ba(OH)2, ZnSO4, 에틸아세테이트는 HPLC급 시약인 용매로 Sigma-aldrich사 (MA, USA) 및 Tedia사 (OH, USA)에서 구입하였다. 유도체화 시약인 N, O-Bis(trimethylsilyl) trifluoroacetamide(BSTFA) 와 hydroxylamine HCle Sigma-aldrich사 (MA, USA) 로부터 구입하였다.
- GC-MSD 시스템은 Hewlett-Packard 6890N 기체 크로마토그래피와 HP 5973N 질량분석기를(a HP Hewlett-Packard 3365 MSD Chemstation) 사용하였다. 그리고 Model 7683 series injector로 구성된 Hewlett-Packard 6890 Series II GC-MS 시스템(PA, USA)을 이용하였다.
- 2 µm)로 여과한 후 10 분간 탈기하여 사용하였다. HP-5 MS 칼럼은 Hewlett packard 사(CA, USA)로부터 구입하였다.
- 그리고 Model 7683 series injector로 구성된 Hewlett-Packard 6890 Series II GC-MS 시스템(PA, USA)을 이용하였다. HP-5 컬럼(30 m ×0.25 mm I.D., 0.25 µm df)은 Agilent Technologies에서 구입하였다. 오븐온도는 80oC에서 4분간 유지하고 180 oC까지 분당 5 oC씩 증가시켰고 그 이후 300 oC 까지 분당 3 oC씩 증가시켰으며 총 19 분 동안 분석하였다.
- 내부표준액인 2-ketocaproic acide Sigma사 (MO, USA)로부터 구입하였다. Ba(OH)2, ZnSO4, 에틸아세테이트는 HPLC급 시약인 용매로 Sigma-aldrich사 (MA, USA) 및 Tedia사 (OH, USA)에서 구입하였다.
- 분석물질 β-hydroxybutyric acid와 acetoacetic acid는 Sigma-aldrich사 (MA, USA)로부터 구입하였다. 내부표준액인 2-ketocaproic acide Sigma사 (MO, USA)로부터 구입하였다.
- Ba(OH)2, ZnSO4, 에틸아세테이트는 HPLC급 시약인 용매로 Sigma-aldrich사 (MA, USA) 및 Tedia사 (OH, USA)에서 구입하였다. 유도체화 시약인 N, O-Bis(trimethylsilyl) trifluoroacetamide(BSTFA) 와 hydroxylamine HCle Sigma-aldrich사 (MA, USA) 로부터 구입하였다. 초순수 증류수는 Millipore MilliQTM system의 표준 정제수 정제 시스템 (MA, USA)을 이용하여 정제된 18 MΩ-cm의 증류수를 사용하였다.
- 유효성 검사에 사용된 혈장 시료는 3.2% 구연산염이 포함된 sodium citrate tube(덕산, 서울, 대한민국)에 채취하였다. 통합 혈장은 본 연구에서 사용된 동일한 시설에 서동 일한 시료 전처리 과정을 거쳐서 분석하였다.
- 이 방법의 유효성을 위해 사용된 건강한 사람의 혈장 시료는 서울 의과학연구소에서 공급받았다. 유효성 검사에 사용된 혈장 시료는 3.
- 통합 혈장은 본 연구에서 사용된 동일한 시설에 서동 일한 시료 전처리 과정을 거쳐서 분석하였다. 임상검체의 구성은 소아과 환자 검체로 유기산 분석 결과가 ketosis를 보이는 검체를 수집하였다.
- 유도체화 시약인 N, O-Bis(trimethylsilyl) trifluoroacetamide(BSTFA) 와 hydroxylamine HCle Sigma-aldrich사 (MA, USA) 로부터 구입하였다. 초순수 증류수는 Millipore MilliQTM system의 표준 정제수 정제 시스템 (MA, USA)을 이용하여 정제된 18 MΩ-cm의 증류수를 사용하였다. 초순수 증류수는 Millipore membrane filter 시스템 통해 Whatman사 (Maidstone, U.
- 케톤체인 acetoacetic acid, β-hydroxy butyric acid 그리고 acetone 중 acetonee 휘발하므로 acetoacetic acid, β-hydroxy butyric acid를 분석대상으로 선정하였다. 케톤체를 분석하는 기존의 방법은 부정확하고 감도가 좋지 않아 GC-MS를 이용하였다.
- 한국인 정상인(18-55세)에 대한 혈장 중 케톤체의 참고 범위를 설정하였다. 한국인 혈장에서 얻어진 케톤체의 참고 범위는 BHB(n=18)의 경우 0.
성능/효과
- 설정하였다. LOQ는 각 분석 물질이 허용되는 정확도(<20%)와 정밀도(<20% CV)로 나타낼 수 있는 가장 낮은 농도인 것으로 실험으로 입증하였으며 검량선 범위에서 가장 낮은 농도 값 이내로 포함됨을 확인되었다.
- 범위를 구해 본 결과 0.001-250 µg/mL 사이 범위에서 직선성을 보였다(β-hydroxybutyric acid와 acetoacetic acid). 혈장에 표준용액을 첨가하여 얻은 BHA의 검량선은 y=0.
- SIM을 수행하기 위한 최적 이온 선택을 위해 유도체화 한 화합물의 분자량(Formula weight, FW), 분자피크 (M+), 머무름 시간(retention time, RT), 상대 머무름 시간 (relative retention time, RRT), 상대감응인자(relative response factor, RRF)를 조사하였다. 앞의 조사를 근거로 분자량 100 이상으로 다른 성분 피크의 영향을 받지 않는 이온을 정량이온(quantification ion, QI)으로정하였고, 유도체화한 분자피크로서 피크 이온의 상대 강도가 20% 이상인 피크를 검토한 결과, TMS 유도 체화된 분자이온(M+), 혹은 분자이온에서 CH3기가 떨어진 M-15 이온이 확인 이온으로 적합하였다(Table 1). 제공받은 혈장과 정상혈장으로 본 방법의 임상적 적용을 하기 위해 케톤체를 동시분석을 위한 각 화합물에 대한 머무름 시간과 정량이온을 선정하였다(Table 1).
- 1 pg 이었으며 정량한계는 1 pg 이었다. 추출 후 BHB의 평균 회수율은(n=3) 1 µg/mL, 10 µg/mL에서 각각 92.3, 94.8% 였고, acetoacetate의 평균 회수율은(n=3) 1 µg/mL, 10 µg/mL에서 각각 88.2, 89.5%로 양호하였다(Table 2). 일반적으로 스크리닝 목적으로 검사할 경우, 회수율의 허용 범위는 60% 이상으로 보고되고 있다.
- 있다(Table 3). 케토시스 환자의 경우 혈장 중 BHB의 농도는 3.276 mmoL/L로 정상범위(<0.015mmoL/L)를 상당히 벗어났으며 acetoacetate의 농도는 0.861 mmoL/L로 정상범위(<0.3 mmoL/L)를 살짝 벗어났으며 케톤체의 비인 BHB/acetoacetate는 3.805로 정상 범위 <1를 명확하게 벗어난 결과를 보여 케토시스가 극명하게 존재함을 확인할 수 있었다(Table 3).
후속연구
- 모든 대사이상 환자는 혈장으로 비정상적인 대사물을 정상인에 비해 다량 배출하므로 본 연구에서 확인된 검출한계 및 정량한계가 유용하게 진단에 응용될 수 있다(Table 3). 케토시스 환자의 경우 혈장 중 BHB의 농도는 3.
- 신속 간편 정확함을 장점으로 한 분석방법은 케토시스 환자 검체를 적용해 봄으로써 이 방법의 유용함을 제시하였다. 미토콘드리아의 지방산 대사이상질환을 포함한 다양한 유전성 대사질환 중 케토시스를 유발할 수 있는 환자 및 당뇨병과 같은 케토시스 유발하는 일반적인 질환자의 진단이나 환자의 치료후 추적관찰 및 모니터링에 이용할 수 있을 것으로 사료된다.
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