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문제 정의
- 따라서 본 연구에서는 대규모의 옥외 대량배양조를 시설하고 이를 이용한 Spirulina의 대량배양을 통하여 환경 조건을 모니터링하였고, 오염생물의 제거, 생산성, 수확 및 옥외 대량배양의 최적 조건에 관한 연구를 수행하였다. 특히, 본연구는 지하수를 배양에 사용하여 외부로부터 유입되는 오염생물을 최소화하고 풍부한 함량의 미네랄 성분을 활용하여 생산성의 향상을 이루고자 하였다.
- 1988), 본대량 배양에서 두드러진 광저해는 발생하지 않았을 것으로판단된다. 본 대량 배양에서는 광도가 1,500 “mol-photons- m-2-s-1 을 넘었을 경우에는 유속을 1.0 m-s-1 로 증가시켜 세포가 높은 광에 연속적으로 노출되는 시간을 줄이고자 하였다. 그러나 높은 일사량이 지속될 경우에는 급격한 수온의상승과 38℃ 이상의 수온 조건은 생산성의 저해요인으로 작용하므로 비닐하우스 시설 내에 환풍시설을 통하여 지나친수온의 상승을 방지하여 야 한다.
- 최적 조건에 관한 연구를 수행하였다. 특히, 본연구는 지하수를 배양에 사용하여 외부로부터 유입되는 오염생물을 최소화하고 풍부한 함량의 미네랄 성분을 활용하여 생산성의 향상을 이루고자 하였다.
제안 방법
- 배양 17일째에는 전일에 비하여 건중량이 감소하였는데 이는 수조의 벽면과 저면에 부착되어 있는 오염생물을 제거했기 때문이었다. 건중량은 다시 증가하기 시작하여 배양 25일째에는 건중량은 0.75 g-L"1 로 증가하여 대 량 수확하였고(Fig. 3, Harvest II) , 수확 후 17 일간 더 배양하여 40일째 0.71 g[T로 증식하였고 이를 전량 수확하였다(Fig. 3, Harvest Ⅲ). 배양 기간 동안의 조체의생산성 (productivity, gem-2/-1)은 Table 2에서와 같이 , 오염생물이 제거되고 안정적인 배양이 이루어진 14일부터 수확하기 전인 25일까지는 최고 16.
- 1996). 18S rDNA 증폭은 Thermal cycler (GeneAmp PCR system 2700, Perkin Elmer, USA)를 사용하여 수행하였다. PCR 반응조건은 전 변성 과정으로 94℃에서 4분간 수행하였고, 94℃에서 30초, 55℃ 에서 30초, 72℃ 에서 45초씩 30회 반복하고 마지막에는 72℃에서 7분간 최종 반응시켰다.
- PCR 반응조건은 전 변성 과정으로 94℃에서 4분간 수행하였고, 94℃에서 30초, 55℃ 에서 30초, 72℃ 에서 45초씩 30회 반복하고 마지막에는 72℃에서 7분간 최종 반응시켰다. PCR 산물은 agarose gel로 전기영동(elctrophoresis)하고, Gel extraction kit (Intron, Korea)를 이용하여 정제한 후, 3730XL Capillary DNA Sequencer (ABI, U.SA.)를 이용하여 증폭된 염기의 서열을 확정하였다. 확정된 염기서열은 BLAST search를 이용하여 GenBank와 EMBL database에서 가장 유사한 18S rDNA 염기서열을 갖는 종을 선택하였다.
- 배양 10일째에는 다른 오염생물인 녹조류 Chlo. minutissima의 증식이 확인되어 천일염 1%을 추가로 첨가하였다. 그 결과 Chlo.
- 수조에 형성된 거품과 벽면에 부착한오염생물을 제거하면서 배양 13일째부터 거품의 발생은 관찰되지 않았고 오염생물의 출현도 확인되지 않았다. 그러나사멸된 녹조의 덩어리들이 저면에 부분적으로 침적하는 현상도 확인되어, 체를 이용하여 제거하였다. 본 연구에서는오염생물의 혼입을 최소화하기 위하여 비닐하우스 시설 내에서 배 양하였으나 녹조류인 C.
- 3). 따라서 배양 5일째에 담수산 C. moewusiie 구제를 위하여 천일염을 0.5%가 되도록 첨가하고 탄산나트륨을 첨가하여 pH를 9.3까지 증가시켰다. 그 결과 6일째부터 배양수에 대량의 거품이 형성되면서 사멸한 녹조는 배양조의 벽면에 띠를 형성하면서 부착하였다.
- 배양 과정 동안 발생한 오염생물을 동정하기 위하여 18S rDNA의 염기서열 분석을 수행하였다. 현장에 출현한 오염생물은 SOT 고체배지에 도말하여 순수 분리하였다.
- 배양수는 매일 실험실에서 현미경으로 관찰하여 오염생물의 출현 및 조체의 상태를 확인하였다. 배양된 조체는 하루 밤 동안 수차의 가동을 중지시켜서 S. platensis의 부상하는 특징을 이용하여 수확하였다. 표층으로 부상된 조체의 덩어리를 수집하여 플랑크톤 네트(20 “m, 0)로 농축한 후 진공 동결건조하였다.
- 수차와 air stone을 이용한 폭기 이외에는 자연 조건하에서 배양하였다. 배양수는 매일 실험실에서 현미경으로 관찰하여 오염생물의 출현 및 조체의 상태를 확인하였다. 배양된 조체는 하루 밤 동안 수차의 가동을 중지시켜서 S.
- 배양수의 수온, pH, 용존산소는 YSI meters(630/100 and 95/100 FT, YSI Inc., Yellow Spring, OH)를, 광도는 조도계 (LI-100 DataLogger, LI-Cor, Inc.)를 이용하여 매일 오후 1시에 동일한 장소에서 측정하였다. 배양 조체의 생물량(biomass)은 GF/C (Whatman) 여과지를 이용하여 20 ml의 배 양수를 여과하고 40 ml의 증류수로 남아있는 염을 녹인 후 103-105℃에서 1시간 동안 건조하여 무게를 측정하였다 (g-L"1).
- 8 tons)의 수로식 배양조를 시설하여 접종물 배양을 위한 배양조로 이용하였다. 배양수의 순환(circulation)을 위하여 대량 배양조의 한쪽 수로에 수차(paddle wheel)를 설치하였고 반대쪽 수로에는 광합성 효율을 증가시키기 위하여 원통형 air stone(L 80 mm, e 30 mm)을 5열로 4개씩 설치하여 폭기하였다.
- 15일간 전배양하였다. 배지는 지하수를 SOT 배지 조성 (Zarouk 1966)으로 하여 0.6tons 규모로 배 양하였다. 배 양조건은 air stone에 의한 폭기 외에는 자연 조건으로 하였다.
- 본 연구에서는 S.platensis의 옥외 배양을 위하여 대량 배양조와 접종물 배양조를 새롭게 고안하였고 이를 비닐하우스시설에 설치하여 배양을 수행하였다. 배양수는 지하수에 SOT(Zarouk 1966)의 절반의 영양성분을 첨가하여 40일간 배양하였고, 배양기간 동안 가장 높은 증식 (건중량)에 도달했을 때의 일일 건중량은 0.
- 현장에 출현한 오염생물은 SOT 고체배지에 도말하여 순수 분리하였다. 순수 분리 된 균주로부터 G-spinTM IIpFor plant Genomic DNA Extraction Kit (Intron Biotech., Korea) 를 사용하여 genomic DNA를 분리 . 정제하였다.
- platensis의 배양수로서 가능할 것이다. 이러한 지하수의 특징을 이용하여 본 연구에서는 S. platensis의 옥외 배양을위하여 지하수를 사용하였다. 지하수를 사용함으로써 혼입되는 오염생물을 최소화하고 풍부하고 일정한 함량의 미네랄 성분은 생산성 향상에 기여한 것으로 판단된다.
- platensis의 부상하는 특징을 이용하여 수확하였다. 표층으로 부상된 조체의 덩어리를 수집하여 플랑크톤 네트(20 “m, 0)로 농축한 후 진공 동결건조하였다.
- )를 이용하여 증폭된 염기의 서열을 확정하였다. 확정된 염기서열은 BLAST search를 이용하여 GenBank와 EMBL database에서 가장 유사한 18S rDNA 염기서열을 갖는 종을 선택하였다.
대상 데이터
- 정제하였다. 18S rDNA의 증폭을 위한 primer 는 SR-6 (Voleox carteri, 891-910: GTC AGA GGT GAA ATT CTT GG)와 SR-9(Volvox carteri, 1286-1267: AAC TAA GAA CGG CAT GCA C)을사용하였다(Na&yama et al. 1996). 18S rDNA 증폭은 Thermal cycler (GeneAmp PCR system 2700, Perkin Elmer, USA)를 사용하여 수행하였다.
- 대량 배양조의 한쪽 끝에 급수 시설을하여 배양수의 공급을 용이하게 하였다. 대량 배양조의 내부에는 길이 7 m, 폭 0.3 m, 높이 0.4 m(최대 0.8 tons)의 수로식 배양조를 시설하여 접종물 배양을 위한 배양조로 이용하였다. 배양수의 순환(circulation)을 위하여 대량 배양조의 한쪽 수로에 수차(paddle wheel)를 설치하였고 반대쪽 수로에는 광합성 효율을 증가시키기 위하여 원통형 air stone(L 80 mm, e 30 mm)을 5열로 4개씩 설치하여 폭기하였다.
- platensis의 옥외 배양을 위하여 대량 배양조와 접종물 배양조를 새롭게 고안하였고 이를 비닐하우스시설에 설치하여 배양을 수행하였다. 배양수는 지하수에 SOT(Zarouk 1966)의 절반의 영양성분을 첨가하여 40일간 배양하였고, 배양기간 동안 가장 높은 증식 (건중량)에 도달했을 때의 일일 건중량은 0.75 g-L-1 (in situ productivity, 6.5 gm-2/-1)였고 총 1, 026 g-ton-1 을 수확하여 성공적인 옥외 대량배양으로 판단된다. 배양 과정 중에 출현한 오염생물을 구제하기 위한 pH의 조절과 염의 첨가는 매우 효과적이었고, Spirulna의 부상활성을 이용한 수확법은 간편하고 효율적이었다.
- 배양은 지하수에 1/2 SOT 배지 조성 (Zarouk 1966)으로 하여 5.7 tons(수심 0.2 m)의 규모로 2005년 6월 23일부터 40일간 배양하였다. 배양된 접종물은 본 배양수의 대략 1/10의 수량으로 하였다.
- 본 연구에 사용한 Spirulinaplatensis NIES 46(이하 Spirulina)균주는 일본 국립환경연구소로부터 분양받았다. 본 균주는 실험실 실온(25-30℃)에서 증류수에 SOT 배지 조성 (Table 1) (Zarouk 1966)으로 하여 계대배양하였고, 이를 200-L 광 생물반응기로 대량배양하여 옥외 배양을 위한 접종물(seed)로 사용하였다.
- 1983). 본 배양에서 출현한 오염생물의 동정은 18S rDNA 염기서열을 이용하였다. 배양 3일째부터 오염생물의 출현이 확인 되어 , 동정 한 결과 Chlamydomonas moewusii와 99%의 유사성을 가지고 있었으며 , 10일째 에 출현한 오염생물은 Chlorella minutissima와 99%의 유사성을 가진 것으로 동정되었다.
- 본 연구에 사용한 Spirulinaplatensis NIES 46(이하 Spirulina)균주는 일본 국립환경연구소로부터 분양받았다. 본 균주는 실험실 실온(25-30℃)에서 증류수에 SOT 배지 조성 (Table 1) (Zarouk 1966)으로 하여 계대배양하였고, 이를 200-L 광 생물반응기로 대량배양하여 옥외 배양을 위한 접종물(seed)로 사용하였다.
- 옥외 배양은 비닐하우스 시설 내부에 투명 아크릴을 이용하여 길이 10 m, 폭 3 m, 높이 0.4 m(최대 10 tons)의 수로식 (raceway type)으로 제작하여 설치하였다(충남 공주시 장기면 제천리 소재). 대량 배양조의 한쪽 끝에 급수 시설을하여 배양수의 공급을 용이하게 하였다.
성능/효과
- 그 결과 6일째부터 배양수에 대량의 거품이 형성되면서 사멸한 녹조는 배양조의 벽면에 띠를 형성하면서 부착하였다. C. moewusiie 사멸에 따라 배양 9일째의 건중량은 0.18 g, L-1 로감소하였다. 배양 10일째에는 다른 오염생물인 녹조류 Chlo.
- moewusiie Chlo. minutissima가 연속적으로 출현하였고, 이들을 구제하기 위하여 인위적인 pH의 증가 및 천일염의 첨가는 매우 효과적 이었다.
- 그러나 일일 측정한 건중량(in situ dry weight)을 기준으로 했을 때는 보다 높게 나타났다. 가장 높은 일일 건중량은 0.75 g-L-1(배양 25일째) 였고(Fig. 3), 이를 기준으로 한 생산성은 6.5 g-m-2-dT로 다소 낮은 값을 보였지만 대량 배양 동안 오염생물의 대발생과 지하수에 첨가한 배지 성분을 SOT 배지 조성 (Zarouk 1966)의 절반으로 한 점 등을 고려하면 높은 값으로 볼 수 있을 것이다.
- 이를 수집하여 용이 하게 수확할 수 있었다. 또한 적절한 농도의 염 (NaCl)의 첨가가 S. platensis의 부상 특성을 증가시킴으로써 (Kim etal. 2005), 본 연구에서는 오염생물의 구제를 위하여 첨가한 1.5%의 천일염이 보다 효과적인 수확을 가능하게 한 것으로 판단된다. 그러나 일시에 침강하여 덩어리를 형성한 조체는 장시간 방치할 경우 부패의 가능성이 있으므로 오전 중에 수확함이 바람직하다.
- 본 배양에서 출현한 오염생물의 동정은 18S rDNA 염기서열을 이용하였다. 배양 3일째부터 오염생물의 출현이 확인 되어 , 동정 한 결과 Chlamydomonas moewusii와 99%의 유사성을 가지고 있었으며 , 10일째 에 출현한 오염생물은 Chlorella minutissima와 99%의 유사성을 가진 것으로 동정되었다. 두 균주의 18S rDNA 염기서열의 NCBI 등재 번호는 DQ345293 (Chlamydomonas moewusii)과 DQ345294 (Chlorella minutissima)이다.
- 5 gm-2/-1)였고 총 1, 026 g-ton-1 을 수확하여 성공적인 옥외 대량배양으로 판단된다. 배양 과정 중에 출현한 오염생물을 구제하기 위한 pH의 조절과 염의 첨가는 매우 효과적이었고, Spirulna의 부상활성을 이용한 수확법은 간편하고 효율적이었다. 본 옥외 대량배양의 시도는 향후 S.
- 8 g-m-2-dT였다. 배양 기간이 길어지면서 생산성은 감소하였고, 배양수의 색은 청남색 계열에서 녹색 계열로 바뀌면서 영양성분의 소진 및 성분간 불균형에 기인한 것으로, 배양의 초기에 발생한 오염생물의 대량 증식에 의하여 탄소, 질소 및 인 성분의 상당한 량이 소비된 것이 생산성 저하의원인인 것으로 판단된다. 그러나 S.
- platensis의 최 적증식 온도 범위로 나타났다. 비닐하우스 시설을 이용할 경우 10℃ 이상의 평년기온을 보이는 5월부터 10월까지는 특별한가온 시설 없이 S. platensis의 옥외 배양이 가능할 것으로 판단된다. 광도의 경우, 116 AzmoLphotons.
- minutissima는 수조의 벽면에 대 량으로 부착하면서 사멸하였다. 수조에 형성된 거품과 벽면에 부착한오염생물을 제거하면서 배양 13일째부터 거품의 발생은 관찰되지 않았고 오염생물의 출현도 확인되지 않았다. 그러나사멸된 녹조의 덩어리들이 저면에 부분적으로 침적하는 현상도 확인되어, 체를 이용하여 제거하였다.
- 다만, 지하수에 포함되어 있는 많은 양의 칼슘이온이나 마그네슘이온은 영양성분이나 염의 첨가 시 침전물을 형성하여 조체의 생산성을 떨어뜨리는 원인으로 작용한다. 실험실에서 예비실험 한 결과, 본 연구에 사용한 지하수에 SOT 배지 성분(Zarouk 1966)을첨가하여도 염의 침전은 형성되지 않았고, 여기에 천일염을첨가했을 때에는 1.5%까지 안정한 것으로 나타났다. 따라서지하수에 SOT 배지 조성 (Zarouk 1966)으로 한 후, 적정량의천일염을 첨가한다면 Spirulina의 생산성 향상에 크게 기여할것이다.
- 지하수를 사용함으로써 혼입되는 오염생물을 최소화하고 풍부하고 일정한 함량의 미네랄 성분은 생산성 향상에 기여한 것으로 판단된다. 특히 , 낮동안의 강한 일사량으로 인한 배양수의 수온 상승에 따른 증발을 지하수(< 10℃)로 보충함으로써 Spirulina의 배양에 적절한 수온의 조절을 가능하게 하였다. 다만, 지하수에 포함되어 있는 많은 양의 칼슘이온이나 마그네슘이온은 영양성분이나 염의 첨가 시 침전물을 형성하여 조체의 생산성을 떨어뜨리는 원인으로 작용한다.
후속연구
- 25 m에서 가장 높은 결과를 보고하였다. 따라서 본 연구에서의 수심 0.2 m는 S. platensis의 대량 배양에 적절했던 것으로 판단되나, 배양의 최적화를 위하여 0.15 m, 0.25 m 등의 수심에서의 생산성에 대한 연구가 수행되어야 할 것이다.
- 5%까지 안정한 것으로 나타났다. 따라서지하수에 SOT 배지 조성 (Zarouk 1966)으로 한 후, 적정량의천일염을 첨가한다면 Spirulina의 생산성 향상에 크게 기여할것이다. 그러나 본 배양에서는 지하수로부터 유래된 C.
- 향상에 기여한 것으로 판단된다. 또한 천일염은 NaCl, CaCl2, MgSO4, K2SO4 등의 무기 염을 다량 함유하므로, SOT 배지 조성 (Zarouk 1966)에 사용되는 NaCl, CaCl2-2H2O, MgSO4-7H2O, K2SO4 등의 성분을 대신하여 사용한다면 경비절감 및 생산성의 향상을 유도할 수 있을 것이다. 오염생물은 생산된 조체의 품질의 저하의 주요 원인이므로, 미연에혼입을 방지하기 위하여, 전배양 시 조체의 상태, 오염생물의 혼입과 증식의 정도를 고려하여 pH를 10 이상으로 조절하는 것이 바람직할 것이다.
- 2003), 오염 생 물의 혼입 은 생 물량의 순도 저 하의주요 원인이 되고 있다. 반면 지하수는 수온은 비교적 낮지만 혼입된 오염생물이 적고 일정한 함량의 무기염류를 포함하여 S. platensis의 배양수로서 가능할 것이다. 이러한 지하수의 특징을 이용하여 본 연구에서는 S.
- 배양 과정 중에 출현한 오염생물을 구제하기 위한 pH의 조절과 염의 첨가는 매우 효과적이었고, Spirulna의 부상활성을 이용한 수확법은 간편하고 효율적이었다. 본 옥외 대량배양의 시도는 향후 S. platensis와 같은 유용 미세조류의 대량 배양에 필요한 기초적인 정보를 제공할 것으로 기대된다.
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