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문제 정의
- 특징이다. 항암치료 중 발생하는 빈혈 증상의 예방 및 치료에 적합한 한약 치료제를 개발하기 위하여 항암제인 cyclophosphamide로 빈혈을 유발시킨 흰쥐에 當歸補血湯이 빈혈 회복에 미치는 영향을 연구한 바, 유의한 결과를 얻었기에 이에 보고하는 바이다.
제안 방법
- Cyclophosphamide로 골수부전상태틀 유발한 후 당귀보혈탕을 일정기간 투여하고 체중과 식이 섭취량, 혈액검사 및 혈액 생화학적 분석을 시행하여 이들의 변화로 당귀보혈탕이 조혈작용에 미치는 영향과 골수의 조혈상태를 관찰하였다.
- EDTA tube에 담은 전혈 (whole blood)은 적혈구 수 (red blood cell, RBC)Z 백혈구 수 (white blood cell, WBC), 혈색소 (hemoglobin/ Hgb) 농도, 적혈구 용적 (hematocrit Het), 평균적 혈구 용적 (mean corpuscular volume, MCV), 평균적혈구 혈색소량 (mean corpuscular hemoglobin, MCH), 평균적혈구 혈색소 농도 (mean corpuscular hemoglobin concentration, MCHC)Z 혈소판 수 (playlet count)를 ADIVATM 120 hematology system (Bayer co. U.S.A.) 기기를 사용하여 측정하였다.
- PCR에 사용한 rat EPO gene primer는 forward 5-GTACATCTTGGAGGCCAAGG-3 reverse 5-GTATCGGCTTGAAGTGTTCG-3이 사용되었다. PCR 은 Peltier Thermal Cycler (MJ Research, U.S.A.)를 사용하여 수행되었다. 365 bp PCR 산물은 1.
- 각각의 실험군 신장에서 발현되는 EPO 유전자의 발현을 확인하기 위해 RT-PCR를 시행하였다.
- 실험군의 빈혈유발은 cyclophosphamide를 30㎎/㎏ BW/day로 3회 복강 투여하였다. 당귀보혈탕 추출물을 l000㎎/㎏ BW/day로 14일동안 경구 투여하였다. 양성대조 약물로서 erythropoietin 투여군은 l, 000IU/kg BW/day로 1주일 동안 3회씩 피하 주사로 14일 동안 투여하였다.
- 조직당 적량의 Trizol을 가하여 vortexting으로 분쇄한 후 실온에 5분간 방치한 후 1/5 분량의 c미oroform을 넣고 섞었다. 소형 원심분리기 (Eppendorf, U.S.A.)를 이용하여 4℃, 12z000xg 에서 15 분간 원심분리 하여 상층액을 수거하고 동량의 isopropan이을 가하여 RNA를 침전시켰다. 얻어진 RNA 침전물을 DEPC (diethyl pyrocarbonate)가 처리된 멸균수에 녹였다,
- 실험 기간 동안 섭취량은 매일 측정하였고, 체중은 2일 간격으로 측정하였다. 식이 효율 (food efficiency ratio: FER)은 실험 시작일부터 희생일까지를 총 실험기간으로 하여 실험 기간 동안의 체중 증가량을 실험기간 동안의 식이 섭취량으로 나누어 산출하였다. FER = weigh gain (g/day) / food intake (g/day)
- 실험 기간 동안 섭취량은 매일 측정하였고, 체중은 2일 간격으로 측정하였다. 식이 효율 (food efficiency ratio: FER)은 실험 시작일부터 희생일까지를 총 실험기간으로 하여 실험 기간 동안의 체중 증가량을 실험기간 동안의 식이 섭취량으로 나누어 산출하였다.
- 나누었다. 실험군의 빈혈유발은 cyclophosphamide를 30㎎/㎏ BW/day로 3회 복강 투여하였다. 당귀보혈탕 추출물을 l000㎎/㎏ BW/day로 14일동안 경구 투여하였다.
- 당귀보혈탕 추출물을 l000㎎/㎏ BW/day로 14일동안 경구 투여하였다. 양성대조 약물로서 erythropoietin 투여군은 l, 000IU/kg BW/day로 1주일 동안 3회씩 피하 주사로 14일 동안 투여하였다. 실험시작 14일 후에 희생하여 혈액을 채취하였다.
- 99℃에서 5분간 가열하여 MMLV reverse transcriptase의 활성을 제거하고 얼음에서 급냉시켰다. 위의 과정에서 생성된 단일가닥의 cDNA 5 ill를 주형으로 하여 lOxPCR-buffer 2.5 pl, 25 mM MgCh 1 皿 dNTPs 1 μ1, Taq DNA polymerase (2.5U) 0.5 μ 1, 유전자의 고유한 primer을 사용하여 PCR을 수행하였다. PCR 수행조건은 95℃에서 5분 반응시킨 후 95℃에서 30 초 54℃에서 1 분, 72C에서 1 분을 30cycle 실시하였고 마지막에 72℃에서 10분간 반응시켰다.
- 정상군 (Normal, 8마리), 빈혈유발-정상식이-식염수군 (Control, 8마리), 빈혈유발-정상식이-당귀보혈탕추출물 투여군 (DBT, 8마리), 빈혈유발-정상식이- erythropoietin 투여군(EPO, 8 마리)으로 나누었다. 실험군의 빈혈유발은 cyclophosphamide를 30㎎/㎏ BW/day로 3회 복강 투여하였다.
- 혈액은 희생시에 heart puncture방법으로 5ml을 채취하였고, 1mle ethylenediamine tetraacetic acid (EDTA) 처리된 blood collection tube (BD vacutainer, USA)에 균등질이 되도록 잘 흔들어 4 ℃ 에 보관해 48시간이내에 compete blood count (CBC) 등을 측정하였다. 나머지 혈액은 생화학적 측정을 위하여 EDTA free tube에 담아 tabletop centrifuge vs-5000n (Vision scientific Co.
- 혈중 AST(GOT) 및 혈중 ALT(GPT) 함량과 혈중 iron 함량 및 혈중 철결합 능력(total iron binding capacity, TIBC)은 ADIVA 1650 (Bayer, Germany) 기기를 사용하여 측정하였다 Transferrin 포화도(TS)는 Cobas integra (Roche, Germany) 기기로 측정하였으며, 혈중 비타민 B12 함량은 gamma counter (Hewlett Packard, U.S.A.) 기기로 측정하였다.
대상 데이터
- , Korea)으로 사용하였다. CLNM Fe (Wako, Japan) 시약, Cobas integra transferrin (Roche, Germany), simul TRAC-SNB radioassay (Icn, USA.)를사용하였으며, 그 외 실험에 사용한 시약은 Bayer사(Germany) 제품을 사용하였다.
- , Korea) 을, recombinant human erythropoietin (rHuEPO)은 recormon inj. PFS lz000IU (Choongwae Pharma Co., Korea)으로 사용하였다. CLNM Fe (Wako, Japan) 시약, Cobas integra transferrin (Roche, Germany), simul TRAC-SNB radioassay (Icn, USA.
- 실험 약재인 當歸는 강원도 평창군 진부면에서 구입하였고, 黃民는 경동한약재 시장에서 구입하였다. Cyclophosphamide는 alkyroxan 500mg (Choongwae Pharma Co.
- 실험동물은 4주령의 Sprague-Dawley계 수컷 흰쥐(샘타코, 한국)를 고형사료(삼양 배합사료 실험동물용, 삼양유지사료, 한국)와 물을 충분히 공급하면서 1주 이상 실험실 환경(온도 22± 2℃, 습도 55+5%, light/dark 12h)에 적응시킨 후 사용하였다.
데이터처리
- 실험성적은 평균치 士 표준오차 (Mean土SD) 로 나타내었으며, 대조군과 실험군과의 평균의 차이를 검정할 때에는 Students t-test로 검정하여 P값이 0.05 미만일 때 통계적으로 유의한 차이가 있는 것으로 판정하였다.
이론/모형
- 모든 실험동물의 식이는 자유섭취방법으로 공급하였다. 실험 기간 동안 섭취량은 매일 측정하였고, 체중은 2일 간격으로 측정하였다.
성능/효과
- TIBC는 트렌스페린에 있는 free iron binding site의 수와 관련된 것으로 철결핍시에 빠르게 증가하게 되는데 정상군의 혈중 TIBC 함량 454.6+27.7 ug/dl에 비하여 대조군은 488.1±29.3 p g/dl으로 유의한 상승을 보였고 (p<0.05), 당귀보혈탕 투여군에서는 473.5±23.8 μ"시으로 회복 효과를 관찰할 수 있었고, erythropoietin 투여군에서는 449.3±14, 4 μg/di으로 유의성 있게 회복되었음을 관찰할 수 있었다 (p<0.01).
- 1%로 관찰되었다. 당귀보혈탕 투여군 및 erythropoietin 투여군에서는 각각 31.7% 및 25.1%의 순서로 나타났다 (Table 1).
- 01). 당귀보혈탕 투여군은 79.6%로 감소하였으나, erythropoietin 투여군은 53.9%로 대조군에 비하여 EPO 유전자의 발현이 현저하게 감소하였다 (Table 3).
- 당귀보혈탕 투여군은 MCV 및 MCH 감소와 MCHC 정상의 소견이 관찰되어 cyclophosphamide에 의해 유발된 재생불량성빈혈, 용혈성빈혈, 비타민 B12의 결핍 등의 증상 치료에 효과가 있을 것으로 사려되었다. 양성대조약물로서 erythropoietin 투여군에서는 MCV의 과도한 상승을 초래하여 혈액질환의 치료 중에 발생하는 망상적혈구의 증가 소견이 관찰되었으며, 이는 erythropoietin이 혈색소의 강력한 회복 작용의 기전에 밀접한 연관이 있음을 알 수 있다.
- 9%로서 현저하게 감소하였다. 당귀보혈탕 투여군의 erythropoietin 유전자의 발현은 79.6 %로서 대조군에 비하여 정상 수준으로 회복되지 않았으나 erythropoietin 투여군과 비교하여 완만하게 감소하였으며, 이는 당귀보혈탕이 골수에서 조혈 세포의 감소를 완화시키는 작용에 관여하는 것으로 기대된다. 이상의 결과를 종합하면 당귀보혈탕은 현재 조혈제로 널리 사용되고 있는 erythropoietin과 비교할 때 혈색소 농도, 적혈구 수의 회복에서 일정한 회복효과가 있음이 증명되었고, 전신적인 건강 상태의 지표인 체중회복에 대해서는 더욱 우수한 회복 효과가 있어, 항암제 투여로 인한 빈혈 발생의 부작용 증상에 대하여 기존의 빈혈 치료제를 대체할 수 있는 한약 치료제로의 개발 가능성이 있음이 확인되었다.
- 당귀보혈탕이 조혈작용에 미치는 영향을 관찰한 결과, 정상군에 비하여 대조군은 유의한 적혈구 수의 감소가 유발되었으며, 양성대 조약물로서 erythropoietin 투여 군에서 는 정 상군과 비 교하여 176.8 % 및 당귀보혈탕 투여군은 정상군과 비교하여 64.6 %의회복효과를 나타내었다. 조혈제인 erythropoietine 투여 후 정상군의 적혈구 수보다 지나치게 증가하였으나 당귀보혈탕은 정상군과 비교하여 64.
- 6 %로 우수한 회복 효과가 있음이 증명되었다. 대조군은 유의한 백혈구 수의 감소가 유발되었으며, 양성대조 약물로서 erythropoietin 투여군에서는 정상군과 비교하여 73.7 %로 유의성있는 회복 효과를 관찰할 수 있었고, 당귀보혈탕 투여군은 정상군과 비교하여 30.3 %로 유의성있는 회복 효과를 관찰할 수 있었다.
- 대조군은 유의한 혈소판 수의 감소가 유발되었으며, 骁대조약물로서 erythropoietin 투여군에서는 정상군과 비교하여 113.6 %로 유의성있는 우수한 회복 효과를 관찰할 수 있었고, 당귀보혈탕 투여군은 정상군과 비교하여 69.9 %로 유의성있는 우수한 감소 효과를 관찰할 수 있었다.
- 대조군의 박혈구수는 유의한 감소를 보였고 (9.7±1.6 (xlO2 3) vs 4.0±1.3 (xlO3), p<0.001)z 당귀보혈탕 투여군에서는 5.7+0.4 (灯0)으로 유의성있는 회복 효과가 , 관찰되었으며 (p<©05), erythropoietin 투여군에서는 8.2±1.2 (妇厅)으로 유의성있게 회복되었다 (p<0.001)(Fig. 1).
- 대조군의 적혈구 용적은 유의한 감소를 보였고 (39.5±1.7 % vs 37.2±0.8 %, p<0.05)z 당귀보혈탕 투여군에서는 38.6±0.9 %로 유의성 있는 회복 효과가 관찰되었으며 (pO.05), erythropoietin 투여군에서는 45.5±1.6 %로 유의성 있게 회복되었다 (p<0.01)(Fig. 1).
- 대조군의 혈색소 농도는 유의한 감소를 보였고 (12.9±0.5 g/dl vs 11.9±0.8 g/dl, p<0.05)f 당귀보혈탕 투여군에서는 12.7+0.3 g/dl으로 유의성있는 회복 효과가 관찰되었으며 (pv0.05), erythropoietin 투여군에서는 14.0±0.8 g/dl으로 유의성 있게 회복되었다 (p<0.001)(Fig. 1).
- 혈색소 농도는 적혈구 수와 함께 임상적으로 중요한 빈혈의 지표이다0 조혈제인 erythropoietine- 특히 적혈구 수와 혈색소 농도에 있어 정상군에 비하여 약 2배 정도의 강력한 증가 효과가 있음이 확인되었으며, 당귀보혈탕 역시 우수한 적혈구 수의 증가 효과와 함께 80%의 혈색소 농도를 회복시키는 우수한 효과가 관찰되었다. 따라서 당귀보혈탕은 혈액검사 소견에서 우수한 회복 효과가 있을 뿐 아니라 체중의 회복을 통한 전신적인 건강 상태의 개선에도 효과가 있는 우수한 빈혈 치료제로서의 개발 가능성을 확인하였다.
- erythropoietin는 골수에서 조혈세포의 증식을 촉진시키는 호르몬으로 erythropoietin 유전자 발현의 증가는 혈청 erythropoietin 수치의 증가를 반영한다. 본 연구에서는 cyclophosphamide에 의해 빈혈이 유도된 대조군은 정상군에 비하여 erythropoietin 유전자의 발현이 감소하였으며, 양성대조 약물인 erythropoietin 투여군에서는 erythropoietin 유전자의 발현이 53.9%로서 현저하게 감소하였다. 당귀보혈탕 투여군의 erythropoietin 유전자의 발현은 79.
- 양성대조약물로서 erythropoietin 투여군은 대조군에 비해 체중이 회복되지 않았다. 식이효율은 정상군과 대조군에서 각각 31.6%와 28.1%로 관찰되었다. 당귀보혈탕 투여군 및 erythropoietin 투여군에서는 각각 31.
- 실험기간 최종체중은 CYP를 투여한 대조군이 정상군에 비해 유의적으로 낮았고, CYP 투여 후 당귀보혈탕 투여군은 대조군에 비해 체중이 유의적으로 높았다. 양성대조약물로서 erythropoietin 투여군은 대조군에 비해 체중이 회복되지 않았다.
- 이상의 cyclophosphamide에 의하여 유발된 빈혈에 대한 혈액검사에서 당귀보혈탕 투여군은 혈색소 농도에 대하여 가장 우수한 회복 효과를 나타내었으며, 혈소판 수, 적혈구 수, 적혈구 용적 (hematocrit, Het) 등의 항목에 대하여 우수한 회복 효과를 나타내었다. 당귀보혈탕 투여군이 대조군에 비해 유의성 있는 회복 효과를 보이는 것으로 보아 조혈모세포 수준의 증식이나 분화를 촉진시키는 물질을 함유하였을 가능성을 추정해 볼 수 있다.
- 6 %로서 대조군에 비하여 정상 수준으로 회복되지 않았으나 erythropoietin 투여군과 비교하여 완만하게 감소하였으며, 이는 당귀보혈탕이 골수에서 조혈 세포의 감소를 완화시키는 작용에 관여하는 것으로 기대된다. 이상의 결과를 종합하면 당귀보혈탕은 현재 조혈제로 널리 사용되고 있는 erythropoietin과 비교할 때 혈색소 농도, 적혈구 수의 회복에서 일정한 회복효과가 있음이 증명되었고, 전신적인 건강 상태의 지표인 체중회복에 대해서는 더욱 우수한 회복 효과가 있어, 항암제 투여로 인한 빈혈 발생의 부작용 증상에 대하여 기존의 빈혈 치료제를 대체할 수 있는 한약 치료제로의 개발 가능성이 있음이 확인되었다.
- 정상군에 비하여 대조군은 유의한 혈색소 농도의 감소가 유발되었으며 , 양성대 조약물로서 erythropoietin 투여 군에서 는 정상군과 비교하여 206.3 %로 유의성있는 강력한 회복 효과를 관찰할 수 있었고, 당귀보혈탕 투여군은 정상군과 비교하여 81.0 % 로 유의성있는 우수한 회복 효과를 관찰할 수 있었다. 혈색소 농도는 적혈구 수와 함께 임상적으로 중요한 빈혈의 지표이다0 조혈제인 erythropoietine- 특히 적혈구 수와 혈색소 농도에 있어 정상군에 비하여 약 2배 정도의 강력한 증가 효과가 있음이 확인되었으며, 당귀보혈탕 역시 우수한 적혈구 수의 증가 효과와 함께 80%의 혈색소 농도를 회복시키는 우수한 효과가 관찰되었다.
- 정상군의 평균적혈구 용적은 61.4±2.1 fL에 비하여 대조군은 64.0+2.0 fL로 유의성있는 증가를 보였고 (p<0.05)z 당귀보혈탕 투여군에서는 62.6H.3 fL 토 감소 효과가 관찰되었으며, erythropoi바in 투여군에서는 67.0±1.4 fL로 유의성 있게 증가되었다 (p<0.01)(Fig. 1).
- 정상군의 평균적혈구 혈색소 농도 33.3±0.4 %에 비하여 대조군은 33.2±0.5 %로 감소를 보였고, 당귀보혈탕 투여군에서는 33.0+0.5 %로 감소 효과가 관찰되었으며, erythropoietin 투여군에서는 30.810.7 %로 유의성 있게 감소되었다 (p<0.001)(Fig. 1).
- 정상군의 평균적혈구 혈색소량 20.5±0.6 pg에 비하여 대조군은 21.4±0.7 pg로 유의성있는 증가를 보였고 (p<0.05)z 당귀보혈탕 투여군에서는 20.6+0.4 pg로 유의성있는 감소 효과가 관찰되었으며 (p<0.05)z erythropoietin 투여군에서는 20.7+0.5 pg로 감소되었다.
- 정상군의 혈소판 수 1027.4±74.4 (灯。3)에 비하여 대조군은 741.3+54.5 (对。3 * * * * * * *)으로 유의성있는 감소를 보였고 (p<0.001), 당귀보혈탕 투여군에서는 941.3±98.8 (Xi©으로 유의성있는 회복 효과가 관찰되었으며 (pO.05), erythropoietin 투여군에서는 1066.2±74.3 (xl©으로 유의성 있게 회복되었다 (p<0.001)(Fig. 1).
- 정상군의 혈중 ALT 함량 44.7±5.8 U/I에 비하여 대조군은 46.9±4.1 U/I으로 유의한 상승을 보였고 (p<0.05)z 당귀보혈탕 투여군군에서는 40.6+4.0 U/I으로 유의한 회복 효과를 관찰할 수 있었고 (p<0.01)/ erythropoietin 투여군에서는 48.1±5.8 U/I으로상승되었음을 관찰할 수 있었다.
- 정상군의 혈중 비타민 B12 함량 1680.6H6L9 pg/ml에 비하여 대조군은 1427.9±74.7 pg/ml으로 유의한 감소를 보였고 (p<0-01), 당귀보혈탕 투여군에서는 1576.2±157.9 pg/ml으로 유의성 있는 우수한 회복 효과를 관찰할 수 있었고 (pvO.05), erythropoietin 투여군에서는 1509.2±59.3 pg/ml으로 유의성 있는 회복 효과를 관찰할 수 있었다 (pv0.05).
- 정상군의 혈중 철분 함량 203.9±25.7 μg/dl에 비하여 대조군은 167.0±34.0 ng/dl으로 유의한 감소를 보였으나 (p<0.05), 당귀보혈탕 투여군에서는 200.6±39.7 μg/dl으로 회복 효과를 관찰할 수 있었고, erythropoietin 투여군에서는 233.5±39.3 Hg/dl으로유의성있게 상승되었음을 관찰할 수 있었다 (p<0.05).
- 6 %의회복효과를 나타내었다. 조혈제인 erythropoietine 투여 후 정상군의 적혈구 수보다 지나치게 증가하였으나 당귀보혈탕은 정상군과 비교하여 64.6 %로 우수한 회복 효과가 있음이 증명되었다. 대조군은 유의한 백혈구 수의 감소가 유발되었으며, 양성대조 약물로서 erythropoietin 투여군에서는 정상군과 비교하여 73.
- 당귀보혈탕 투여군이 대조군에 비해 유의성 있는 회복 효과를 보이는 것으로 보아 조혈모세포 수준의 증식이나 분화를 촉진시키는 물질을 함유하였을 가능성을 추정해 볼 수 있다. 혈액 생화학적 분석 지표로서 혈중 ALT(GPT), iron, transferrin 포화도 등의 항목에 대해서도 유의성 있는 회복 효과를 나타내었다. 혈중 ALT(GPT)에 대해 당귀보혈탕 투여군이 유의성 있는 회복효과를 나타낸 것에 비하여 양성대조약물로서 erythropoietin 투여군에서는 상승되었음이 관찰되었다.
- 혈중 ferritin 농도에서 정상군의 혈중 ferritin 함량 0.16±0.21 ng/ml에 비하여 대조군은 0.30±0.16 ng/ml로 상승을 보였고, 당귀보혈탕 투여군에서는 0.23+0.18 ng/ml로 회복 효과를 관찰할 수 있었고, erythropoietin 투여군에서는 0.13+0.15 ng/ml로 유의성 있게 회복되었음을 관찰할 수 있었다 (p<0.05)(Table 2).
후속연구
- 혈중 ALT(GPT)에 대해 당귀보혈탕 투여군이 유의성 있는 회복효과를 나타낸 것에 비하여 양성대조약물로서 erythropoietin 투여군에서는 상승되었음이 관찰되었다. 따라서 당귀보혈탕의 투여는 cyclophosphamide의 부작용으로 인한 간 기능 장애를 개선하는데 유효할 것으로 사려된다.
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