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문제 정의
- 이에 본 연구에서는 잿빛 곰팡이병을 야기하는 B. cinerea 에 대하여 강한 항진균 활성을 나타내는 균주를 분리하고 길항균 주가 생산하는 항진균 물질의 생산조건을 검토하여 잿빛 곰팡이병을 방제할 수 있는 미생물제제의 개발을 위한 기초를 마련하고자 한다.
제안 방법
- 그리고 45。0에서 180 rpm, 24시간 배양하여 생육 및 항진균 활성을 조사하였다.
- 24~72시간동안 선별한 길항균주를 배양한 후, 24시간마다 배양액을 sampling 하여 배양시간에 따른 항진균 활성을 조사하였다.
- 토양시료로부터 분리된 Bacillus sp. KMU-1011 를 이용하여 많은 작물에 잿빛 곰팡이병을 유발하는 Botrytis cinerea KACC 40573에 대한 항진균 활성을 위한 배양조건을 조사하였다.
- Bacillus sp. KMU-1011 이 생산한 항진균 물질을 조 정제하여 액체배양을 통한 B. czTjerea의 생육에 미치는 영향을 조사하기 위하여 NB를 기본배지로 하여 탄소원으로 1.0% glucose와 질소원으로 polypeptone을 첨가하고 pH를 6.0— 로 조정하여 배지를 제조한 후, 24℃, 180 rpm으로 2일간 배양하여 사용하였다. 배양액을 회수하여 0~30%와 30-60% 의 ammonium sulfate로 항진균 물질의 침전을 유도한 후, 투석하여 염을 제거하여 조정제 물질을 회수하였다.
- 0)로 현탁한 후, 4℃에서 24시간 동안 투석하여 사용하였다. 공시균주인 B. cinerea KACC 40573의 포자 현탁액을 50 ml의 PDB에 접종하고 동량의 회수한 물질을 각각 첨가하여 항진균 활성을 조사하였으며 대조구에는 동량의 Tris-HCl bufFer(pH 8.0)를 첨가하였다.
- 다양한 작물병원성 곰팡이를 대상으로 하여 선발된 균이나 타내는 항진균 활성을 조사하였다. 항진균 활성을 조사하기 위하여 앞의 실험과 동일한 조건으로 200 ml 배양한 후, 배양액을 원심분리 하여 균체를 제거하고 상등액에 2배 volume의 chloroforme- 첨가하여 항진균 물질을 용매 층으로 이행시키고 용매를 회수하여 50℃ 이하에서 감압농축한 후, 항진균 활성을 조사하였다.
- 0— 로 조정하여 배지를 제조한 후, 24℃, 180 rpm으로 2일간 배양하여 사용하였다. 배양액을 회수하여 0~30%와 30-60% 의 ammonium sulfate로 항진균 물질의 침전을 유도한 후, 투석하여 염을 제거하여 조정제 물질을 회수하였다. 50 ml 의 PDB에 회수한 물질을 동량 첨가하고 B.
- 선발된 균주의 항진균 활성을 조사하기 위하여 앞에서 조사되어진 항진균 물질생산배지 300 ml을 제조하고 선발된 균주를 앞에서 조사한 최적배양조건에서 배양한 후, 10, 000 rpm, 4℃에서 20분간 원심분리를 하여 상등액을 회수하였다. 항진균 활성을 나타내는 물질을 회수하기 위하여 회수한 배양액에 ammonium sulfate를 각각 0~30%와 30-60% 농도로 첨가한 후, 4。。에 12시간동안 정치하면서 항진균 물질의 침전을 유도하여 10, 000 rpm, 4。<2에서 20분간 원심분리 하여 회수하였다.
- cinereal] 생육을 저해하는 균주들을 일차적으로 선발하였다. 선발한 균주들을 대상으로 가장 높은 생육 저지대를 형성하는 균주를 선발하기 위히-여 작물병원성 곰팡이를 직격 6 mm 크기의 culture disc로 접종하여 24也에서 24시간 배양한 후, 3 cm 떨어진 곳에 선별한 균주를 획선접종하고 24℃에서 7일간 배양하면서 생육저지대를 조사하였다. 공시균주인 B.
- 2) 배지에 단계희석법으로 도말하여 37。(:에서 3일간 배양한 후, 증식한 균주들을 분리하였다. 증식한 균주들을 순수 분리한 후, 잿빛 곰팡이병의 원인균인 Botrytis cinerea KACC 40573을 방제할 수 있는 균주를 선발하기 위하여 PDA(potato dextrose agar, 2.0% dextrose, 0.4% potato starch, 1.5% agar, pH 5.6 ± 0.2)배지에서 대치배양(pairing culture)을 실시하여 B. cinereal] 생육을 저해하는 균주들을 일차적으로 선발하였다. 선발한 균주들을 대상으로 가장 높은 생육 저지대를 형성하는 균주를 선발하기 위히-여 작물병원성 곰팡이를 직격 6 mm 크기의 culture disc로 접종하여 24也에서 24시간 배양한 후, 3 cm 떨어진 곳에 선별한 균주를 획선접종하고 24℃에서 7일간 배양하면서 생육저지대를 조사하였다.
- 질소원의 영향을 조사하기 위하여 앞에서 조사된 탄소원 1.0%를 기본배지에 첨가한 후, 질소원으로 ammonium chloride, ammonium phosphate, ammonium sulfate, bactopeptone, bactotryptone, beef extract, com steep liquor(CSL), malt extract, polypeptone, urea, 그리고 yeast extract를 각각 1.0%씩 첨가하고 pH를 조정하여 동일한 방법으로 조사하였다.
- 초기 pH의 변화에 따른 영향을 조사하기 위하여 기본 배지의 pH를 3.0에서 10.0으로 각각 조정하여 동일한 방법으로 배양하여 조사하였다.
- 탄소 원의 첨가에 따른 항진균 물질의 생산에 대한 영향을 조사하기 위하여 arabinose, fructose, glucose, glycerol, lactose, maltose, mannitol, soluble starch, sorbitol, 그리고 sucrose를 앞에서 조사된 기본배지에 1.0% 첨가하고 앞에서 조사된 pH로 조정한 후 사용하였다.
- 토양시료로부터 분리된 균주 중에서 육안관찰, 형태 및 증식양상이 서로 구별되어지는 56 균주를 순수분리 하였다. 잿빛 곰팡이병을 야기하는 B.
- 핀란드의 Lappeenranta 지역에 위치하는 Saimaa 호수가의 토양시료 10 g을 멸균수 90 ml에 넣고 37℃ water bath 에서 10분간 진탕배양 후, 50℃ water bath에서 30분간 열처리를 하였다. LB agar(1.
- 항진균 물질의 생산을 위한 기본배지를 선택하기 위하여 LB broth(1.0% tryptone, 0.5% yeast extract, 1.0% sodium chloride, pH 7.0 ±0.2), nutrient broth(NB, 0.5% peptone from meal, 0.3% meat extract), potato dextrose broth (PDB, 2.0% dextrose, 0.4% potato starch), trypticase soybean broth(TSB, 1.7% digest of casein, 0.3% soytone, 0.5% sodium chloride, 0.25% dextrose), 그리고 yeast malt broth(YM broth, 0.3% yeast extract, 0.3% malt extract, 0.5% peptone, 1.0% dextrose)를 제조하여 pH를 7.0으로 조정한 후, 12FC에서 15분간 멸균하여 사용하였다. 전배양액은 24시간 전에 LB broth에 단일 콜로니를 접종하여 사용하였으며 각각의 삼각플라스크에 전배양액 100 μ1를접종한 후, 30℃, 180 rpm에서 24시간 배양하였다.
- 항진균 활성을 조사하였다. 항진균 활성을 조사하기 위하여 앞의 실험과 동일한 조건으로 200 ml 배양한 후, 배양액을 원심분리 하여 균체를 제거하고 상등액에 2배 volume의 chloroforme- 첨가하여 항진균 물질을 용매 층으로 이행시키고 용매를 회수하여 50℃ 이하에서 감압농축한 후, 항진균 활성을 조사하였다. 조사한 작물 병원성 곰팡이는 공시 균주로 사용한 B.
대상 데이터
- sp. radicis-lycopersici KACC 40537, 수박 덩굴쪼김병을 야기하는 Fusarium oxysporum KACC 40902, 수박 질병을 야기하는 Monosporascus cannonballus KACC 40940, 사과나무 역병을 야기하는 Phytophthora camvibora KACC 40160, 벼 잎집무늬마름병을 야기하는 Rhizoctonia solani AG-l(IA) KACC 40101, 참외 줄기썩음병을 야기하는 Rhizoctonia solani AG-4 KACC 40142, 그리고 고주 균핵병을 야기하는 Scleotinia scleotiorum KACC 41065를 사용하였다.
- 선발한 균주들을 대상으로 가장 높은 생육 저지대를 형성하는 균주를 선발하기 위히-여 작물병원성 곰팡이를 직격 6 mm 크기의 culture disc로 접종하여 24也에서 24시간 배양한 후, 3 cm 떨어진 곳에 선별한 균주를 획선접종하고 24℃에서 7일간 배양하면서 생육저지대를 조사하였다. 공시균주인 B. cinerea는 농촌진흥청 농업 생명공학연구원 한국농용미 생 물보존센터 (Korean Agricultural Culture Collection, KACC)에서 분양 받아 사용하였다.
이론/모형
- 항진균 활성을 나타내는 선발균의 분류학상 위치를 검토하기 위하여 형태학적, 배양학적, 생화학적 특성을 검토하였으며, 도줄된 결과는 Bergey's manual of systematic bacteriology] 18] 를 참고하였으며, API kit(bioMerieux, France)을 이용하여 동정하였다.
성능/효과
- 의 포자 현탁액 0.1 ml을 접종하여 24。(2, 150 rpm으로 7일간 배양한 후 건조중량을 측정한 결과, 대조구 0.34 g과 비교하여 0-30% ammonium sulfate를 처리한 경우에는 0.33 g으로회수한 물질에 의한 생육저해를 거의 나타내지 않았으나, 30-60% ammonium sulfate를 처리한 경우에 0.22 g으로 회수한 물질에 의하여 35% 정도의 생육이 저해되었다는 것을 알 수 있었다.
- Ammonium sulfate를 30-60% 첨가하여 항진균 물질을 회수하였을 때 가장 양호한 항진균 활성을 나타내었으며, chloroform을 이용하여 배양액 중에 존재하는 항진균 물질을 회수하여 다양한 작물병원성 곰팡이에 대한 spectrum을 조사한 결과, 잿빛곰팡이병, 고추 탄저병, 참외 탄저병, 수박 등의 박과작물의 덩굴마름병, 토마토 시들음병, 글라디올러스 마른썩음병, 토마토 질병, 수박 덩굴쪼김병, 수박 질병, 사과나무 역병, 벼 잎집무늬마름병, 참외 줄기썩음병, 그리고 고추 균핵병에 대하여 양호한 항진균 활성을 나타내는 것 皿 조사되었다.
- KMU- 1011의 항진균 활성 spectrum을 조사하기 위하여 chloroform 을 이용하여 항진균 물질을 회수한 후 agar diffusion method를 이용하여 조사한 결과, 다양한 작물병원성 곰팡이에 대하여 높은 항진균 활성을 나타내는 것을 확인할 수 있었다. 특히 C.
- 생육의 경우에는 전반적으로 양호한 생육을 하는 것으로 조사되었으며 com steep liquor를 첨가한 경우에 가장 양호한 생육을 하는 것으로 조사되었다. Urea의 경우에 OD 0.82로 가장 미비한 생육을 하는 것으로 조사되었으나 항진균 활성은 21 mm로 양호한 것으로 조사되었다. 이 결과로부터 균의 생육과 항진균 활성은 상호관련이 없는 것을 확인할 수 있었다.
- pH의 변화에 따른 항진균 물질의 생산과 생육을 조사한 결과, pH 6.0에서 가장 양호한 항진균 활성을 나타내었으며.(Fig.
- sp. radicis-lycopersici KACC 40537, F. oxysporum KACC 40902, M. cannonballus KACC 40940, P. cambivora KACC 40160, R. solani AG-1 KACC 40101, R. solani AG-4 KACC 40142, 그리고 S. scleotiorum KACC 41065에 대하여 양호한 항진균 활성을 나타내었다(Table 8). 이러한 결과들을 바탕으로 하여 작물병원성 곰팡이에 대한 미생물제제로 Bacillus sp.
- 질소원■으로■ polypeptone을 첨가하였을 때 25 mm3. 가장 양호한 항진균 활성을 나타내었으며 첨가한 질소원에 의하여 전반적으로 항진균 활성이 증가하는 것으로 조사되었다. 그러나 bactopeptone의 경우에는 대조구와 비교할 때 항진균 활성이 10% 감소하는 것으로 조사되었다.
- 첨가한 10종의 탄소원 중에서 glucose를 첨가하였을 때 가장 양호한 항진균 활성을 나타내었으며 fructose, glucose, maltose, mannitol, sorbitol, 그리고 sucrose를 첨가하였을 때 탄소 원을 첨가하지 않은 대조구보다 항진균 활성이 10% 증가하는 것으로 조사되었다. 그러나 glycerol, lactose, 그리고 soluble starch를 첨가하였을 때 항진균 활성이 감소하였으며이ycerol을 첨가한 경우 항진균 활성은 대조구와 비교하여 28% 그리고 glucose를 첨가한 경우와 비교하여 35% 활성이 감소한 것으로 조사되었으며 생육은 대조구와 비교할 때 30% 저해되는 것으로 조사되었다. 생육의 경우에는 sorbitol 을 첨가한 경우에 136%의 증가를 나타내었으며 glycerol과 lactose를 제외한 다른 탄소원에 의하여 생육은 증가하는 것으로 조사되었다.
- 기본배지의 선별을 위하여 LB broth, NB, PDB, TSB 그리고, YM broth를 이용흐]여 항진균 활성과 균의 생육을 조사한 결과 NB에서 13 mm로 가장 양호한 항진균 활성을 나타내었으며 다른 배지를 사용한 경우에도 전반적으로 양호한 항진균 활성을 나타내었다. 생육의 경우에는 TSB에서 가장 양호한 것으로 조사되었으며 PDB의 경우에는 OD 0.
- 배양일수에 따른 항진균 활성과 생육을 조사하기 위하여 기본 배지인 NB에 1.0% glucose와 1.0% polypeptone을 첨가한 후, pH를 6.0으로 조정하여 1~3일간 배양하면서 조사한 결과, 2일 배양하였을 때 가장 양호한 항진균 활성을 나타내었으나 배양일수에 따른 항진균 활성의 큰 차이는 나타내지 않았으며, 증식은 3일째가 가장 높게 조사되었다.
- 항진균 활성을 나타내었다. 생육의 경우에는 TSB에서 가장 양호한 것으로 조사되었으며 PDB의 경우에는 OD 0.63 으로 가장 미비하게 조사되었으나 항진균 활성은 10 mm로생육과 비교할 때 양호한 항진균 활성을 나타내는 것e로 조사되었다(Table 3).
- 그러나 glycerol, lactose, 그리고 soluble starch를 첨가하였을 때 항진균 활성이 감소하였으며이ycerol을 첨가한 경우 항진균 활성은 대조구와 비교하여 28% 그리고 glucose를 첨가한 경우와 비교하여 35% 활성이 감소한 것으로 조사되었으며 생육은 대조구와 비교할 때 30% 저해되는 것으로 조사되었다. 생육의 경우에는 sorbitol 을 첨가한 경우에 136%의 증가를 나타내었으며 glycerol과 lactose를 제외한 다른 탄소원에 의하여 생육은 증가하는 것으로 조사되었다.
- 그러나 bactopeptone의 경우에는 대조구와 비교할 때 항진균 활성이 10% 감소하는 것으로 조사되었다. 생육의 경우에는 전반적으로 양호한 생육을 하는 것으로 조사되었으며 com steep liquor를 첨가한 경우에 가장 양호한 생육을 하는 것으로 조사되었다. Urea의 경우에 OD 0.
- cinerea KACC 40573에 대 한길 항균 주를 선별하기 위하여 PDA plate에서 대치배양 하여 24。。에서 배양하면서 생육을 저해하는 것으로 판단되어지는 11 균주 일차적으로 선발하였다. 선발된 균주 중에서 B. cinereae 대하여 가장 높은 생육저지대를 나타내는 균주를 선발하여 최종적으로 KMU-1011 이라 명명하였다. KMU- 1011는 그람 양성의 rod form으로 포자를 형성하였으며 형성된 집락은 원형으로 표면은 smooth하였으며 매끈한 광택을 나타내었다.
- 82로 가장 미비한 생육을 하는 것으로 조사되었으나 항진균 활성은 21 mm로 양호한 것으로 조사되었다. 이 결과로부터 균의 생육과 항진균 활성은 상호관련이 없는 것을 확인할 수 있었다.
- 이러한 결과를 바탕으로 Bergey's manual of systematic bacteriology를 이용하여 비교한 결과, Bacillus sp로 분류되었다(Table 1). 이 결과를 바탕으로 Bacillus sp를 동정하는데 이용되어지는 API 50 CHB 동정 kit을 사용하여 50가지의 당에 대한 생화학적 특성을 조사한 후, API 20E kit을 이용하여 획득한 결과와 함께 API LABplus(V. 3. 3. 3, bioMerieux, France)프로그램으로 확인한 결과, Bacillus amyloliquefaciense\- 97.7%의 상동성을 나타내었다. 그러나 보다 정확한 동정 결과를 얻을 수 있는 16s rDNA sequences 등의 결과와 비교하지 못하여 최종적으로 Bacillus sp.
- KMU-1011은 호기성 세균으로 catalase, gelatin liquefaction, 그리고 nitrate reductione 양성반응을 나타내었으나, citrate utilization, indole test, production of oxidase, voges-proskauer test는 음성으로 조사되었다. 이러한 결과를 바탕으로 Bergey's manual of systematic bacteriology를 이용하여 비교한 결과, Bacillus sp로 분류되었다(Table 1). 이 결과를 바탕으로 Bacillus sp를 동정하는데 이용되어지는 API 50 CHB 동정 kit을 사용하여 50가지의 당에 대한 생화학적 특성을 조사한 후, API 20E kit을 이용하여 획득한 결과와 함께 API LABplus(V.
- KMU-1011 이 생산하는 항진균 물질의 생산에 미치는 탄소원의 영향을 조사한 결과 Table 6과 같다. 첨가한 10종의 탄소원 중에서 glucose를 첨가하였을 때 가장 양호한 항진균 활성을 나타내었으며 fructose, glucose, maltose, mannitol, sorbitol, 그리고 sucrose를 첨가하였을 때 탄소 원을 첨가하지 않은 대조구보다 항진균 활성이 10% 증가하는 것으로 조사되었다. 그러나 glycerol, lactose, 그리고 soluble starch를 첨가하였을 때 항진균 활성이 감소하였으며이ycerol을 첨가한 경우 항진균 활성은 대조구와 비교하여 28% 그리고 glucose를 첨가한 경우와 비교하여 35% 활성이 감소한 것으로 조사되었으며 생육은 대조구와 비교할 때 30% 저해되는 것으로 조사되었다.
- 항진균 물질의 생산을 위한 기본배지로 nutrient brot曜 사용하였으며 탄소원으로 1.0% glucose와 질소원으로 1.0% polypeptone를 첨가하였을 때 가장 높은 항진균 활성을 나타내었다. 배양조건으로는 24℃, 180 rpm, 48시간 배양하였을 때 가장 높은 항진균 활성을 나타내었다.
후속연구
- 이러한 결과들을 바탕으로 하여 작물병원성 곰팡이에 대한 미생물제제로 Bacillus sp. KMU-1011 을 이용할 수 있을 것이라는 가능성을 확인할 수 있었으며, 실용적인 생물학적 방제제 개발을 위한 포장실험, 제형개발 등의 다양한 조사를 진행할 예정이다.
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