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문제 정의
- 따라서 송라로부터 Sclerotinia sclerotiorum에 항균활성을 갖는 항균물질을 탐색하여 추후 친환경 농자재 개발에 이용하고자 본 연구를 수행하였다.
- 본 연구는 균핵병의 원인균인 Sclerotinia sclerotiorum에 대해 항균활성을 갖는 친환경 유기농자재를 개발할 목적으로 송라(Usnea longissima)로부터 활성물질을 분리하였다. 송라를 MeOH로 추출하여 용매분획을 하였고, 용매분획 중에서 강한 활성을 나타낸 CHCl3 fraction을 column chromatography로 분리하여 40개의 subfractions을 얻었고 9개의 그룹으로 나누었다.
제안 방법
- CHCl3 : Methanol (1, 10, 20, 30... 50% in CHCl3, v/v)의 용매계로 순차용출(step-wise) 시켜 40개의 subfractions을 받았으며, 각각의 subfraction을 TLC에 전개하여 spot을 확인하여 9개의 그룹(G1, G2, …, G9)으로 나누었다.
- G3 subfraction의 GC Chromatogram에서 검출된 peak들 중에서 주요 화합물인 24.607 min에 검출된 A peack 화합물의 화학적 구조를 구명하고자 MS spectra와 Wiley library를 비교하여 구조를 확인하였다. 그 결과, 화합물은 Usnic acid 화합물로 동정되었다(Fig.
- 생물검정에서 활성을 나타낸 G3 subfraction을 GC-MS로 분석하였다. GC-MS에서 얻어진 peak를 Wiley library Data base와 비교하였고 이를 통해 G3 subfraction에 함유된 물질들의 화학구조를 동정하였다.
- (2013)의 방법을 응용하여 고압 멸균한 PDA배지를 Petri dish (90×15 mm)에 분주하여 평판배지를 만든 다음 완전히 굳히고, 추출물을 MeOH로 10,000 ppm으로 만들어 Paper disc (∅8 mm)에 50 µl씩 점적하였다. MeOH이 완전히 휘발된 다음 PDA 평판배지 가장자리에 Paper disc를 치상하였다. 시험 균주는 Cork borer (8 mm)로 채취하여 배지 중앙에 치상하고, 18℃ incubator에서 각각의 시험균주가 다 자랄 때까지 배양하였다.
- 건조시킨 송라 시료 500 g을 blender를 이용해 잘게 분쇄하고 99.5% MeOH로 실온에서 24시간 침지 후 추출하였으며 MeOH 침지와 추출과정을 3회 반복하였다. 상등액을 여과지(Sanyo 185 ㎜ Ø, No 2, Japan)를 사용하여 고형물을 걸러내고 40℃에서 rotary evaporator로 감압 ․ 농축 건조하여 MeOH 추출물(38.
- 검출된 화합물은 Usnic acid로써 항균활성물질로 추정되며 Usnic acid의 항균활성을 검정하기 위하여 표준품 Usnic acid을 구매하여 PDA 배지에 0 ppm, 1 ppm, 10 ppm, 100 ppm 농도로 화합물을 배지에 첨가하여 실험배지를 만들었다. 시험균주를 배지 중앙에 치상하여 약액배지혼합방법으로 항균활성을 검정하였다.
- 시험 균주는 Cork borer (8 mm)로 채취하여 배지 중앙에 치상하고, 18℃ incubator에서 각각의 시험균주가 다 자랄 때까지 배양하였다. 균이 다 자라면 clean zone의 형성유무를 확인하여 항균 활성 여부를 조사하였다.
- 균핵병균의 배양 배지는 B.D사의 PDA를 1 L 조건으로 Petri dish에 조제하였다. 병원균(Sclerotinia sclerotiorum)은 Cork borer (8 mm)로 채취하여 배지의 중앙에 치상 시킨 후 18℃ 로 배양 후 사용하였다.
- 분리한 화합물의 균핵병 생육억제능을 평가하기 위해서는 고압멸균 한 PDA 배지에 0 ppm, 1 ppm, 10 ppm, 100 ppm 농도로 화합물을 첨가하여 Petri dish (90×15 mm)에 분주 평판배지를 만들었다.
- 생물검정에서 활성을 나타낸 G3 subfraction을 GC-MS로 분석하였다. GC-MS에서 얻어진 peak를 Wiley library Data base와 비교하였고 이를 통해 G3 subfraction에 함유된 물질들의 화학구조를 동정하였다.
- 본 연구는 균핵병의 원인균인 Sclerotinia sclerotiorum에 대해 항균활성을 갖는 친환경 유기농자재를 개발할 목적으로 송라(Usnea longissima)로부터 활성물질을 분리하였다. 송라를 MeOH로 추출하여 용매분획을 하였고, 용매분획 중에서 강한 활성을 나타낸 CHCl3 fraction을 column chromatography로 분리하여 40개의 subfractions을 얻었고 9개의 그룹으로 나누었다. 9개의 subfractions을 bioassay한 결과 G3 subfraction에서 강한 활성을 나타내었다.
- 검출된 화합물은 Usnic acid로써 항균활성물질로 추정되며 Usnic acid의 항균활성을 검정하기 위하여 표준품 Usnic acid을 구매하여 PDA 배지에 0 ppm, 1 ppm, 10 ppm, 100 ppm 농도로 화합물을 배지에 첨가하여 실험배지를 만들었다. 시험균주를 배지 중앙에 치상하여 약액배지혼합방법으로 항균활성을 검정하였다. 검정결과 100 ppm 농도에서 균핵병 원인균인 S.
- 분리한 화합물의 균핵병 생육억제능을 평가하기 위해서는 고압멸균 한 PDA 배지에 0 ppm, 1 ppm, 10 ppm, 100 ppm 농도로 화합물을 첨가하여 Petri dish (90×15 mm)에 분주 평판배지를 만들었다. 평판배지를 완전히 굳히고 Cork borer (8 mm)로 채취한 시험 균주를 배지 중앙에 치상하여 18℃ incubator에서 균주의 생장속도를 보며 항균 활성 여부를 조사하였다.
- 항균 활성 탐색을 위해 Kang et al. (2013)의 방법을 응용하여 고압 멸균한 PDA배지를 Petri dish (90×15 mm)에 분주하여 평판배지를 만든 다음 완전히 굳히고, 추출물을 MeOH로 10,000 ppm으로 만들어 Paper disc (∅8 mm)에 50 µl씩 점적하였다.
- 활성을 나타낸 fraction들 중에 CHCl3 fraction을 silica gel column chromatography에 충진하고 용매계 (CHCl3 : Methanol)로 step-wise 방법으로 용출하여 분획별 300 ml 씩 총 40개의 subfractions을 얻어 TLC 분석으로 이들을 다시 9개의 그룹으로 나누었다. 이들 9개의 subfractions (G1, G2, …, G9)을 대상으로 항균활성을 조사한 결과, G3 subfraction에서 가장 강한 활성을 나타내었다.
- 활성이 우수한 Chloroform fraction의 활성물질을 탐색하기 위하여 Silica gel (Merck 7734, 700 g)을 glass column (50 mmØ × 860 mm)에 충진 시킨 후 CHCl3 fraction (4.00 g)을 chloro-form에 용해시켜 column chromatograph에 charge하였다.
대상 데이터
- , Paper disc는 Advantec사, Petri dish는 SPL사, silica gel(7734)은 Merck사 제품이었다. Gas chromatography-Mass spectrometry (GC-MS)는 Agilent의 7890A 기종을 사용하였고, Column은 HP-5MS capillary를, Detector는 Agilent 5975C를, library는 Wiley (W9N08.L)를 사용하였다.
- D사의 PDA를 1 L 조건으로 Petri dish에 조제하였다. 병원균(Sclerotinia sclerotiorum)은 Cork borer (8 mm)로 채취하여 배지의 중앙에 치상 시킨 후 18℃ 로 배양 후 사용하였다.
- 본 연구에 사용된 균핵병 병원균인 Sclerotinia sclerotiorum은 전북대학교 생명공학부 (Prof. 이귀재)에서 분양받았으며, 경북대학교 대학원 생태환경시스템학과 식물자원환경전공 천연물화학연구실에 보관하여 배양한 뒤 사용하였다. 식물재료인 송라(Usnea longissima)는 라오스 약재상에서 구매하였다.
- MeOH이 완전히 휘발된 다음 PDA 평판배지 가장자리에 Paper disc를 치상하였다. 시험 균주는 Cork borer (8 mm)로 채취하여 배지 중앙에 치상하고, 18℃ incubator에서 각각의 시험균주가 다 자랄 때까지 배양하였다. 균이 다 자라면 clean zone의 형성유무를 확인하여 항균 활성 여부를 조사하였다.
- 이귀재)에서 분양받았으며, 경북대학교 대학원 생태환경시스템학과 식물자원환경전공 천연물화학연구실에 보관하여 배양한 뒤 사용하였다. 식물재료인 송라(Usnea longissima)는 라오스 약재상에서 구매하였다.
- 용매분획과 Silica gel column chromatography를 위한 MeOH, n-hexane, CHCl3, EtOAc, n-BuOH 등은 덕산약품공업(주)회사의 extra pure grade를 사용하였다. Bioassay에 사용된 PDA배지는 Becton, Dickinson & Co.
성능/효과
- 송라를 MeOH로 추출하여 용매분획을 하였고, 용매분획 중에서 강한 활성을 나타낸 CHCl3 fraction을 column chromatography로 분리하여 40개의 subfractions을 얻었고 9개의 그룹으로 나누었다. 9개의 subfractions을 bioassay한 결과 G3 subfraction에서 강한 활성을 나타내었다. G3 subfraction을 GC-MS로 분석하여 chromatogram 상의 활성물질로 추정되는 peak의 mass spectrum과 Wiley library를 비교하여 profiling한 결과, Usnic acid가 주요 물질로 검출되었다.
- 9개의 subfractions을 bioassay한 결과 G3 subfraction에서 강한 활성을 나타내었다. G3 subfraction을 GC-MS로 분석하여 chromatogram 상의 활성물질로 추정되는 peak의 mass spectrum과 Wiley library를 비교하여 profiling한 결과, Usnic acid가 주요 물질로 검출되었다. 항균활성물질로 추정되는 Usnic acid 화합물의 항균활성을 검정하기 위하여 표준품을 사용하여 생물검정한 결과 이 화합물이 강한 활성을 나타내었다.
- 시험균주를 배지 중앙에 치상하여 약액배지혼합방법으로 항균활성을 검정하였다. 검정결과 100 ppm 농도에서 균핵병 원인균인 S. sclerotiorum균의 생육이 완벽하게 억제됨이 관찰되었고 10ppm 농도에서도 강하게 생육을 억제하는 것으로 나타났다(Fig. 4). 따라서 본 연구에서는 송라로부터 분리한 Usnic acid 화합물이 활성물질인 것으로 추정 되었으며, 항균력이 강한 송라 추출물 또는 Usnic acid 화합물을 주성분으로 하는 추출물을 채소류 또는 과수 균핵병에 대한 친환경농자재의 개발이 가능할 것으로 판단되었다.
- 균핵병의 원인균인 S. sclerotiorum에 대한 송라(Usnea longissima) 추출물의 용매분획의 항균활성을 조사한 결과, Hexane fraction, CHCl3 fraction, EtOAc fraction에서 강한 항균활성을 보였다(Fig. 1).
- 이들 9개의 subfractions (G1, G2, …, G9)을 대상으로 항균활성을 조사한 결과, G3 subfraction에서 가장 강한 활성을 나타내었다.
- G3 subfraction을 GC-MS로 분석하여 chromatogram 상의 활성물질로 추정되는 peak의 mass spectrum과 Wiley library를 비교하여 profiling한 결과, Usnic acid가 주요 물질로 검출되었다. 항균활성물질로 추정되는 Usnic acid 화합물의 항균활성을 검정하기 위하여 표준품을 사용하여 생물검정한 결과 이 화합물이 강한 활성을 나타내었다. 따라서 송라로부터 분리한 Usnic acid가 균핵병의 원인균인 Sclerotinia sclerotiorum에 대한 항균 활성물질인 것으로 추정하였다.
후속연구
- 4). 따라서 본 연구에서는 송라로부터 분리한 Usnic acid 화합물이 활성물질인 것으로 추정 되었으며, 항균력이 강한 송라 추출물 또는 Usnic acid 화합물을 주성분으로 하는 추출물을 채소류 또는 과수 균핵병에 대한 친환경농자재의 개발이 가능할 것으로 판단되었다.
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