목재부후균은 리그닌 분해효소로 lignin peroxidase (LIP), Mn-peroxidase (MNP) 및 laccase를 생성하는데 균류에 따라 위의 효소중 하나 혹은 둘 이상의 효소를 분비하거나 전혀 생성하지 않는 균도 있다. 본 실험은 이러한 목재 부후균의 효소생성 양상과 몇 종의 염료화합물 탈색과의 상관관계를 조사하고자 하였다. 조사한 23종 36균주 중 MNP 생성균은 30균주였으며 LIP 혹은 laccase 생성균은 각각 11균주와 12균주였다. 또한 같은 종에서도 효소활성은 다양한 양상을 보여 주었다. 리그닌 분해효소 활성과 비교하여 염료 탈색 정도는 세 효소가 모두 분비되는 백색 부후균의 경우 염료 탈색율이 상대적으로 우수하였고 균주에 따라 차이가 있으나 MNP 활성만을 갖는 균주의 경우, poly R-478 polymeric dye 및 anthron-type dye 인 remazol brilliant blue R염료는 효소 활성도와 다소 유연관계를 보였으며 methylene blue, bromophenol blue및 congo red 염료는 위의 효소들과는 직접적인 관련이 없는 것으로 판단되었으며, 오히려 균사의 생장과 비례하여 탈색율을 나타냈다. LIP, MNP 및 laccase 효소활성이 거의 검출되지 않은 갈색 부후균에서는 bromophenol blue를 제외하고는 염료의 탈색이 10%미만 혹은 전혀 탈색이 되지 앓았다.
목재부후균은 리그닌 분해효소로 lignin peroxidase (LIP), Mn-peroxidase (MNP) 및 laccase를 생성하는데 균류에 따라 위의 효소중 하나 혹은 둘 이상의 효소를 분비하거나 전혀 생성하지 않는 균도 있다. 본 실험은 이러한 목재 부후균의 효소생성 양상과 몇 종의 염료화합물 탈색과의 상관관계를 조사하고자 하였다. 조사한 23종 36균주 중 MNP 생성균은 30균주였으며 LIP 혹은 laccase 생성균은 각각 11균주와 12균주였다. 또한 같은 종에서도 효소활성은 다양한 양상을 보여 주었다. 리그닌 분해효소 활성과 비교하여 염료 탈색 정도는 세 효소가 모두 분비되는 백색 부후균의 경우 염료 탈색율이 상대적으로 우수하였고 균주에 따라 차이가 있으나 MNP 활성만을 갖는 균주의 경우, poly R-478 polymeric dye 및 anthron-type dye 인 remazol brilliant blue R염료는 효소 활성도와 다소 유연관계를 보였으며 methylene blue, bromophenol blue및 congo red 염료는 위의 효소들과는 직접적인 관련이 없는 것으로 판단되었으며, 오히려 균사의 생장과 비례하여 탈색율을 나타냈다. LIP, MNP 및 laccase 효소활성이 거의 검출되지 않은 갈색 부후균에서는 bromophenol blue를 제외하고는 염료의 탈색이 10%미만 혹은 전혀 탈색이 되지 앓았다.
Wood-rot fungi produce extracellular lignin-degrading enzymes, the best known of which are lignin peroxidase, Mn-peroxidase and laccase. In this experiment, some of them produced all of three enzymes. Many other wood-rot fungi produced one or two of those enzymes with various combinations. In this e...
Wood-rot fungi produce extracellular lignin-degrading enzymes, the best known of which are lignin peroxidase, Mn-peroxidase and laccase. In this experiment, some of them produced all of three enzymes. Many other wood-rot fungi produced one or two of those enzymes with various combinations. In this experiment, we tried to clarify the relationship between the pattern of enzyme production and degradative activity of several dye compounds. From the 36 strains of 23 species of wood-rot fungi, Mn-peroxidase activity was found in 30 strains of the fungi tested, whereas the activity of lignin peroxidase and laccase was detected in 11 strains and 12 strains of species, repectively, in Kirks low nitrogen media. In relation to the activity of lignin degrading enzymes and degradation of dye compounds, the white-rot fungi with three kinds of enzymes tested showed the best dye decolorizers. The fungi with Mn-peroxidase activity only decolorized poly R-478 and remazol brilliant blue R dye in proportion to the enzyme activity, while methylene blue, bromophenol blue and congo red dye were degraded in regardless of enzyme activity. Those dyes were degraded in relation to the growth rate of mycelium. Brown-rot fungi did not degrade all the dye compounds except bromophenol blue, in spite of moderate growth rate.
Wood-rot fungi produce extracellular lignin-degrading enzymes, the best known of which are lignin peroxidase, Mn-peroxidase and laccase. In this experiment, some of them produced all of three enzymes. Many other wood-rot fungi produced one or two of those enzymes with various combinations. In this experiment, we tried to clarify the relationship between the pattern of enzyme production and degradative activity of several dye compounds. From the 36 strains of 23 species of wood-rot fungi, Mn-peroxidase activity was found in 30 strains of the fungi tested, whereas the activity of lignin peroxidase and laccase was detected in 11 strains and 12 strains of species, repectively, in Kirks low nitrogen media. In relation to the activity of lignin degrading enzymes and degradation of dye compounds, the white-rot fungi with three kinds of enzymes tested showed the best dye decolorizers. The fungi with Mn-peroxidase activity only decolorized poly R-478 and remazol brilliant blue R dye in proportion to the enzyme activity, while methylene blue, bromophenol blue and congo red dye were degraded in regardless of enzyme activity. Those dyes were degraded in relation to the growth rate of mycelium. Brown-rot fungi did not degrade all the dye compounds except bromophenol blue, in spite of moderate growth rate.
* AI 자동 식별 결과로 적합하지 않은 문장이 있을 수 있으니, 이용에 유의하시기 바랍니다.
문제 정의
또한 리그닌이 방향족 화합물이라는 관점에서 리그닌 분해효소들은 농약과 같은 난 분해성 방향 족 화합물이나 인공섬유, 종이류, 가죽제품 등의 염색제로 사용되는 각종 염색제들로 인한 오염원들을 제거해보자는 차원에서 많은 관심과 연구가 이루어지고 있다 (2, 3, 4, 6, 17, 18, 20). 따라서 본 연구의 목적은 목재부후균이 갖는 다양한 목재부후양상과 이들의 특징적인 리그닌 분해효소체계와 난분해성 오염물질로 알려져 있는 각종 염료화합물의 탈색 정도를 분리된 부후균을 대상으로 조사하고자 함에 있다.
이것은 또한 효소학적으로 다른 효소체계를 가지고 있음을 뜻하는 것이기도 하다. 본 논문에서는 리그닌 분해와 관련된 효소들의 체제가 부후균의 종류에 따라 어떻게 다른가를 살펴보고자 한다.
목재부후균류가 이들 효소들을 모두 가지고 있는지 아니면 그 중 일부만 가지고 있는지 또한 보유효소의 활성도에는 어떤 차이가 있는지 파악하는 것은 수많은 목재부후균들의 목재부후양상을 이해하는 데 중요한 자료가 될 수 있다. 이에 관한 연구논문은 총설 형태로 발표된 것이 있으나 (8) 우리 자연에서 새로이 분리된 각종 부후균들을 재료로 관련 효소 활성을 파악하고 이들을 근간으로 연구를 수행하는 것은 우리의 유용한 미생물 자원을 발굴한다는 데 의미가 크다고 판단되어 본 연구를 착수하게 되었다.
제안 방법
고체 배지에서는 생장한 균사체의 직경을 측정하였으며 생장 백분율은 페트리 접시의 직경을 기준으로 계산하였다. 액체배지 에서는 균사체의 건조 중량으로 생장 정도를 측정하였다.
액체배지 에서는 균사체의 건조 중량으로 생장 정도를 측정하였다. 균사체 는 배양 배지를 여과하여 larc에서 90분간 건조하여 중량을 측정하였다.
2% 염료(poly-R, remazol brilliant blue, methylene blue, bromophenol blue, 및 congo red)가 각각 함유된 고체 배지를 사용하였다. 균사체가 생장하면서 나타나는 염료 탈색 영역을 측정하였으며 탈색율은 페트리 접시의 직경을 기준으로 측정하였다.
부후된 목재 조각으로부터 무균적으로 균사체를 1차 분리한 후 Malt 배지(1리터 수용액에 포도당 20 g, 맥아추출물 20 g, 펩톤 1 g, 한천20g)를 이용하여 25℃에서 15일간 배양하여 오염되지 않고 균사 배양이 이루어진 것들을 분리하였으며 자실체 형태, 포자 등의 특징에 의해 동정하였다. 성공적으로 분리된 균주는 효소분석을 위해서 Kirk 액체배지(12) 10ml 당 균사조각 7개 비율로 접종하였으며 25℃에서 14일 또는 16일 배양하였다.
부후된 목재 조각으로부터 무균적으로 균사체를 1차 분리한 후 Malt 배지(1리터 수용액에 포도당 20 g, 맥아추출물 20 g, 펩톤 1 g, 한천20g)를 이용하여 25℃에서 15일간 배양하여 오염되지 않고 균사 배양이 이루어진 것들을 분리하였으며 자실체 형태, 포자 등의 특징에 의해 동정하였다. 성공적으로 분리된 균주는 효소분석을 위해서 Kirk 액체배지(12) 10ml 당 균사조각 7개 비율로 접종하였으며 25℃에서 14일 또는 16일 배양하였다. 염료 탈 색 분석을 위해서는 0.
고체 배지에서는 생장한 균사체의 직경을 측정하였으며 생장 백분율은 페트리 접시의 직경을 기준으로 계산하였다. 액체배지 에서는 균사체의 건조 중량으로 생장 정도를 측정하였다. 균사체 는 배양 배지를 여과하여 larc에서 90분간 건조하여 중량을 측정하였다.
염료 탈색 정도는 효소 활성 측정을 위한 액체 배지에 0.2% 염료(poly-R, remazol brilliant blue, methylene blue, bromophenol blue, 및 congo red)가 각각 함유된 고체 배지를 사용하였다. 균사체가 생장하면서 나타나는 염료 탈색 영역을 측정하였으며 탈색율은 페트리 접시의 직경을 기준으로 측정하였다.
대상 데이터
2%의 염료를 첨가한 고체 배지에서 배양하였다. 배양을 위한 배지 성분은 Difco사 제품을 사용하였다.
3은 염료MB에 대한 결과로 BB 및 CR과 함께 생장과 비례하여 전반적으로 탈색율이 높았다. 생장과 탈색이 일어나지 않은 균으로는 KR-412W, KR-321W, KR-46W, KR-47W, KR- 411W, KR-23W, JW-01, JW-02 및 DW-02였으며 생장이 양호하나 탈색이 일어나지 않는 균들로는 갈색 부후균(KR-48B, KR- 53B 및 KR-63B)과 KR-JB-01 이었다. Fig.
그리고 이상의 모든 흡광도 측정은 UVIKON UV/VIS Spectrophotometer (모델 922, Kontron사, UK>를 사용하여 측정하였다. 효소 측정을 위한 시약은 시그마 제품을 사용하였으며 기질로 사용된 veratryl alcohol과 syring- aldazinee Aldrich사 제품을 사용하였다.
이론/모형
LIP (lignin peroxidase)은 Kirk (19)의 방법을 사용하였으며 반응 혼합물 1.0 ml의 조성은 125 mM tartaric acid buffer (pH4.5) 450 gl, 기질로 40 mM veratryl alcohol 50)11, 효소용액 450 pl를 첨가한 후 8 mM 과 산화수소 50μ1를 혼합시켜 310nm에서 흡광도 변화를 측정하였다. 효소의 활성단위는 veratryl alcoh이로부터 분(min) 당 생성되는 veratryl aldehyde의 양(jlmole)을 1 unit로 정 의하였다.
MNP (Mn-dependent peroxidase)는 Gold (7)의 방법을 사용하였으며 반응 혼합물 1.0 nd의 조성은 0.5 M sodium tartrate buffer (pH5.0) 200 )11, H20 677.5(11, 10 mM MnSO4 10 p.1, 효소용액 100 |il로 하였으며 8 mM 과 산화수소 12.5 μ1를 혼합시켜 238nm에서 흡광도 변화를 측정하였다. 효소의 활성단위는 분 (min)당 1 umole의 Mn(II)를 산화시키는 정도를 1 unitS.
단백질 정량은 Lowry방법(13)과 Bradford 방법(1)을 병행하여 즉정하였으며 표준단백질로 bovine serum albumin (Sigma Chemical Co)을 사용하였다. 그리고 이상의 모든 흡광도 측정은 UVIKON UV/VIS Spectrophotometer (모델 922, Kontron사, UK>를 사용하여 측정하였다. 효소 측정을 위한 시약은 시그마 제품을 사용하였으며 기질로 사용된 veratryl alcohol과 syring- aldazinee Aldrich사 제품을 사용하였다.
단백질 정량은 Lowry방법(13)과 Bradford 방법(1)을 병행하여 즉정하였으며 표준단백질로 bovine serum albumin (Sigma Chemical Co)을 사용하였다. 그리고 이상의 모든 흡광도 측정은 UVIKON UV/VIS Spectrophotometer (모델 922, Kontron사, UK>를 사용하여 측정하였다.
성능/효과
Table 1과 Fig. 1에서 Fig. 5까지의 실험 결과를 근거로 3종 류의 리그닌 분해효소 활성도의 유형에 따라 36균주를 구분하여 염료 탈색 및 생장율을 비교하여 분석한 결과(Table 2), MNP+ LIP+Lac+형 구름버섯 균 혹은 MNP+LIP+Lac-형인 부후균에서 대체로 실험한 염료에 대하여 탈색율이 높았다. 그러나 MNP+ LIP-Lac-형이더라도 MNP활성이 높은 균주는 특히 poly-R과 RBBR염료에 대해 높은 탈색율을 나타냈다.
5까지의 실험 결과를 근거로 3종 류의 리그닌 분해효소 활성도의 유형에 따라 36균주를 구분하여 염료 탈색 및 생장율을 비교하여 분석한 결과(Table 2), MNP+ LIP+Lac+형 구름버섯 균 혹은 MNP+LIP+Lac-형인 부후균에서 대체로 실험한 염료에 대하여 탈색율이 높았다. 그러나 MNP+ LIP-Lac-형이더라도 MNP활성이 높은 균주는 특히 poly-R과 RBBR염료에 대해 높은 탈색율을 나타냈다. MB, BB 및 CR염 료는 갈색 부후균을 제외하고 다른 균주들은 생장율과 비례하여 염료 탈색율이 양호하였다.
MB, BB 및 CR염 료는 갈색 부후균을 제외하고 다른 균주들은 생장율과 비례하여 염료 탈색율이 양호하였다. 또한 MNP-LIP-Lac-형인 균주에서도 균주마다 일정하지는 않지만 미약하나 마 탈 색이 된 것을 보면 대표적인 3종류의 리그닌 분해효소 외에 염료분해효소 의 존재 가능성을 보여준다. 근래에 발표된 연구 결과는 이러한 사실을 뒷받침해준다(10, 11, 15, 16).
또한 치마버섯균 및 기계층 버섯균도 같은 종내에서 MNP+LIP-Lac- 형과 MNP-LIP-Lac-형이 동시에 관찰되었다. 또한 전체적으로 MNP 효소 활성만을 갖는 것이 다수 관찰되었다. Laccase의 활성을 갖는 균은 많지 않았으며 효소 활성을 갖는 균이라도 그 활성도가 극히 미약하였다.
Table 1에 의하면 구름버섯균은 같은 부후균 내에서도 효소 활성 양상이 세 종류로 즉, MNP+LIP+Lac+형, MNP+LIP-Lac+형, 그리고 MNP+LIP+ Lac-형의 세 형태가 관찰되었다. 또한 치마버섯균 및 기계층 버섯균도 같은 종내에서 MNP+LIP-Lac- 형과 MNP-LIP-Lac-형이 동시에 관찰되었다. 또한 전체적으로 MNP 효소 활성만을 갖는 것이 다수 관찰되었다.
근래에 발표된 연구 결과는 이러한 사실을 뒷받침해준다(10, 11, 15, 16).목재 부 후균을 사용하여 염료화합 물의 분해를 연구한 문헌들은 균류 자체의 배양에 의해 염료의 탈색을 연구한 경우(2, 3, 4, 5, 6, 20)와 분리된 리그닌 분해효소 각각에 대해 염료 탈색에 관하여 연구한 경우(10, 11, 14, 15, 16, 17, 18)로 대별할 수 있는데, 다양한 유형의 효소를 생성하는 균류들을 대상으로 수행한 본 실험에 의하면 염료 탈색에는 효소적으로 MNP 혹은 LIP효소가 중요한 역할을 하는 것으로 생각 되었다.
본 실험에 사용한 균주는 자연계에서 가장 많이 분포하는 구름버섯균 9균주를 포함하여 36균주이었다. Table 1에 의하면 구름버섯균은 같은 부후균 내에서도 효소 활성 양상이 세 종류로 즉, MNP+LIP+Lac+형, MNP+LIP-Lac+형, 그리고 MNP+LIP+ Lac-형의 세 형태가 관찰되었다.
갈색 부후균은 poly-R 염료와 마찬가지로 생장율은 양호하였으나 탈색율은 10% 미만이었다. 생장과 탈색이 일어나지 않은 균주들(KR46W, KR-411W, KR-23W, JB- 01, JW-01 및 JW-02)과 생장은 양호 하나 탈색이 일어나지 않은 균주들(KR-321W, KR-48B, KR-53B, 및 KR-63B) 이 다소 있었다. Fig.
생장과 탈색이 일어나지 않은 균으로는 KR-412W, KR- 32IW, KR-46W, KR-47W, KR-411W, KR-23W, KR-JB-01, KR- JW-01, KR-JW-02, 및 KR-DW-02 등이다. 생장은 양호 하나 탈색이 되지 않은 균류에는 KR-36W, KR-39W였으며 갈색 부후균의 경우, KR-63B는 생장에 비해 탈색율이 10% 정도였으나 KR- 48B 및 KR-53B 는 생장과 탈색율이 양호하였으며 이는 다른 염료와는 달리 갈색 부후균의 BB염료 탈색에 다른 효소계의 존재를 암시하는 것으로 생각된다. Fig.
참고문헌 (20)
Bradford, M.M. 1976. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal. Biochem. 72, 248-250
Bumpus, J.A. and S.D. Aust. 1987. Biodegradation of DDT(1,1,1-tetrachloro -2,2-bis(4-chlorophenyl ethane) by the white rot fungus Phanerochaete chrysosporium. Appl. Environ. Microbiol. 53, 2001-2008
Bumpus, J.A. and B.J. Brock. 1988. Biodegradation of crystal violet by the white-rot fungus Phanerochaete chrysosporium. Appl.Environ. Microbiol. 54, 1143-1150
Cripps, C. and J.A. Bumpus. 1990. Biodegradation of azo and hetero cyclic dyes by Phanerochaete chrysosporium. Appl. Environ.Microbiol. 56(4), 1114-1118
Eichlerova, I., L. Homolka, L. Lisa and F. Nerud. 2005. Orange G and remazol brilliant blue R decolorization by white rot fungi Dichomitus squalens, Ischnoderma resinosum and Pleurotus calyptratus. Chemosphere, 60, 398-404
Heinfling, A., M.J. Martinez, A.T. Martinez, M. Bergbauer, and U. Szewzyk. 1998. Transformation of industrial dyes by manganese peroxidases from Bjerkandera adusta and Pleurotus eryngii in a manganese-independent reaction. Appl. Environ. Microbiol. 64(8), 2788-2793
Kim, S.J. and M. Shoda. 1999. Purification and characterization of a novel peroxidase from Geotrichum candidum Dec 1 involved in decolorization of dyes. Appl. Environ. Microbiol. 65(3), 1029- 1035
Kirk, T.K. and W.J. Connors. 1987. Influence of culture parameters on lignin metabolism by Phanerochaete chrysosporium. Arch. Microbiol. 117(3), 277-285
Lowry, O.H., N.J. Rosebrough, A.L. Farr, and R.L. Randall. 1951. Protein measurement with the folin phenol reagent. J. Biol. chem. 193, 265-275
Molitoris, H.P. and B.R.M. Vyas. 1995. Involvement of an extracellular $H_{2}O_{2}$ -dependent ligninolytic activity of the white-rot fungus Pleurotus ostreatus in the decolorization of Remazol Brilliant Blue R. Appl. Environ. Microbiol. 61(11), 3919-3927
Ollikka, P., K. Alhonmaki, and T. Glumoff.1993. Decolorization of azo, triphenyl methane, heterocyclic, and polymeric dyes by lignin peroxidase isoenzymes from Phanerochaete chrysosporium. Appl.Environ. Microbiol. 59(12), 4010-4016
Shin, K.S. and C.J. Kim. 1997. Production and purification of remazol Brilliant Blue R decolorizing peroxidase from the culture filtrate of Pleurotus ostreatus. Appl. Environ. Microbiol. 63(5), 1744-1748
Tauber, M.M., G.M. Gueb itz and A. Rehorek. 2005. Degradation of azo dyes by laccase and ultrasound treatment. Appl. Environ.Microbiol. 71(5), 2600-2607
Tien, M. and T.K. Kirk. 1988. Lignin peroxidase of Phanerochaete chrysosporium. Methods in Enzymol. 161. 238-249
Yang, Q., A. Yediler, M. Yang and A. Kettrup. 2005. Decolorization of an azo dye, reactive black 5 and MnP production by Yeast isolate: Debaryomyces polymorphus. Biochem. Eng. J. 24, 249- 253
※ AI-Helper는 부적절한 답변을 할 수 있습니다.