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문제 정의
- 따라서 리그닌 분해효소들을 대량으로 생산하기 위해서는 리그닌 분해효소 고생산 균주 선발, 발효 방법, 생산 배지 조성 및 단가 인하 등의 노력들이 필요하다고 판단된다. 이에 본 연구에서는 이전 보고(하, 2012)에서 선발한 리그닌 분해효소 고 생산 균주인 느타리 버섯균주 No. 42로 부터 5가지 다른 배지 조건 하에서 리그닌 분해 효소 종류 및 활성을 비교 하였기에 이에 보고하는 바이다.
제안 방법
- 본 배양은 Table 1에 나타낸 것처럼 300 ml 삼각플라스크에 3종류의 액체배지인potato-dextrose broth 배지(PDB), glucose-peptone-yeast 배지(GPY), GPY + wheat bran 추출 배지(GPYW)와 2종류의 고체배지인 wood meal + wheat bran 배지(WMW), wheat bran 단독배지(W)를 각각 20 ml와 5g씩 준비하여 위에서 언급한 전 배양한 접종원을 1 ml씩 접종하여 28℃에서 정치배양하면서 본 실험을 실시하였다.
데이터처리
- Laccase(Lac)의 효소 활성농도는 o-phenylendiamine을 기질로 하여 1분간 반응으로 생성된 물질의 440 nm에서의 흡광도로 나타내었다. 각 효소의 활성측정은 배양 중의 각각의 플라스크 3개를 선발하여 평균값으로 나타내었다.
이론/모형
- 액체배양으로부터 실험일자별로 1 ml씩 취하였으며 고체배양의 경우 20 mM Na-succinate buffer(pH 4.5) 20 ml를 분주하고 1시간 동안 진탕 추출한 뒤에 각각의 배양액을 4℃, 8000 rpm, 5분간 원심분리한후 상등액을 취해 UV-Visible spectrophotometer(Shimadzu UV-1201)을 사용하여 아래 리그닌 분해 효소 측정법에 의해 측정하였다.
성능/효과
- 5가지 배지 조성에 따른 리그닌 분해 효소의 활성 비교에서 리그닌 분해효소인 Lac의 최대 활성은 GPY배지에서 PDB배지보다 5.6배 향상되었으며 GPY 배지에 밀기울(wheat bran)을 첨가한 GPYW배지의 경우 PDB배지보다 8배 향상되었음을 알 수 있었다. 반면에 MnP의 최대 활성은 GPY배지에서 PDB배지보다 80배 향상되었으며 GPY배지에 밀기울을 첨가한 GPYW배지의 경우 PDB배지보다 180배 향상되었음을 알 수 있었다.
- 1). Glucose-peptone-yeast(GPY)배지에서는 15일간 정치 배양한 결과, laccase 활성은 7일째 1.7 U/ml의 최대 활성을 나타낸 후 서서히 감소하는 경향을 나타내었으며 MnP 활성은 5일째부터 활성이 나타나기 시작하여 11일째 1.6 U/ml의 최대 활성을 나타낸 후 감소하는 것을 확인 할 수 있었다(Fig. 2). Glucose-peptone-yeast-wheat bran(GPYW)배지에서는 15일간 정치 배양한 결과, laccase 활성은 9일째 2.
- 2). Glucose-peptone-yeast-wheat bran(GPYW)배지에서는 15일간 정치 배양한 결과, laccase 활성은 9일째 2.4 U/ml의 최대 활성을 나타낸 후 감소하는 경향을 나타내었으며 MnP 활성은 11일째 3.6 U/ml의 최대 활성을 나타낸 후 감소하는 것을 확인 할 수 있었다(Fig. 3).
- Potato dextrose broth(PDB)배지에서 15일간 정치 배양한 결과, laccase 활성은 7일째 0.3 U/ml의 최대 활성을 나타낸 후 약간 감소하는 경향을 나타내었으며 MnP 활성은 거의 생산되지 않는 것을 확인 할 수 있 었다(Fig. 1). Glucose-peptone-yeast(GPY)배지에서는 15일간 정치 배양한 결과, laccase 활성은 7일째 1.
- 고체배지인 wood meal-wheat bran(WMW)배지에서는 15일간 정치 배양한 결과, laccase 활성은 5일째 6.0 U/ml의 최대 활성을 나타낸 후 감소하는 경향을 나타내었으며 MnP 활성은 15일째 4.0 U/ml의 최대 활성을 나타낸 후 감소하는 것을 확인 할 수 있었다(Fig. 4). 한편 또 다른 고체배지인 wheat bran(W) 배지에서는 15일간 정치 배양한 결과, laccase 활성은 7일째 11.
- 5배 증가하는 경향을 나타내었다. 그러나 밀기울 단독배지인 W배지에서는 Lac 최대 활성은 11 U/ml로 실험한 모든 결과 중에서 가장 높게 나타났으나 MnP활성은 0.3 U/ml로 매우 낮게 나타났다. 이러한 결과로 볼 때, 배지 조성은 리그닌 분해효소의 활성과 매우 밀접한 관계가 있음을 알 수 있으며 본 실험결과에서 밀기울 단독배지에서 MnP 활성이 매우 낮게 나타난 이유는 과도한 질소원의 함량 때문인 것으로 판단된다.
- 느타리 버섯 No. 42균주를 5가지 배지에서 연구한 결과, 리그닌 분해효소인 Lac와 MnP는 생산되었으나 LiP는 생산되지 않았다. 실험한 본 균주의 경우 리그닌 분해효소인 Lac와 MnP의 생산에 밀기울이 관여하는 것을 확인 할 수 있었다.
- 7 U/ml) 나타났다는 보고와도 유사한 결과를 나타내었다. 따라서 peptone과 함께 밀기울(wheat bran)이 느타리 버섯 No.42균주의 리그닌 분해효소활성에 영향을 미치는 인자인 것으로 생각되며 밀기울의 질소함량 뿐만 아니라 목분(wood meal)에 함유되어 있는 구리(Cu)나 망간(Mn)과 같은 금속이온이 리그닌 분해효소의 활성에 영향을 미쳤을 것으로 판단된다. 결론적으로 본 연구결과를 활용하여 느타리버섯 균주를 이용한 리그닌 분해효소의 대량생산을 할 수 있는 기초 연구 자료로 활용될 수 있을 것으로 생각한다.
- 그러나 판막버섯에서 리그닌을 분해하는 대표적인 리그닌 분해효소인 LiP는 모든 본 실험 배지에서는 전혀 생산되지 않는 것을 확인하였으며 본 실험 결과는 느타리 버섯 균주로부터 이전에 보고한 몇몇 연구자들의 결과와 동일하였다(Iwamoto 등, 1997; Kamitsuji 등, 2004; Ruiz-Rodriguez 등, 2011). 따라서 이러한 결과는 대표적인 리그닌 분해균인 판막버섯(P. chrysosporium)과는 다르게 질소가 풍부한 조건하에서도 리그닌 분해효소를 생산하는 것으로 판단된다.
- 6배 향상되었으며 GPY 배지에 밀기울(wheat bran)을 첨가한 GPYW배지의 경우 PDB배지보다 8배 향상되었음을 알 수 있었다. 반면에 MnP의 최대 활성은 GPY배지에서 PDB배지보다 80배 향상되었으며 GPY배지에 밀기울을 첨가한 GPYW배지의 경우 PDB배지보다 180배 향상되었음을 알 수 있었다. 한편 고체배지인 WMW배지에서 Lac의 최대 활성은 PDB배지보다 20배 향상되었으며 밀기울 단독(W)배지에서는 PDB배지보다 36.
- 7배 향상되었음을 알 수 있었다. 반면에 MnP의 최대 활성은 WMW배지에서 PDB배지보다 200배 향상되었으며 밀기울 단독(W)배지에서 PDB배지보다 15배 향상되었음을 알 수 있었다. 이와 같은 결과를 바탕으로 느타리버섯 No.
- 42균주를 5가지 배지에서 연구한 결과, 리그닌 분해효소인 Lac와 MnP는 생산되었으나 LiP는 생산되지 않았다. 실험한 본 균주의 경우 리그닌 분해효소인 Lac와 MnP의 생산에 밀기울이 관여하는 것을 확인 할 수 있었다. 액체배지에서는 GPYW에서 Lac(2.
- 위와 같이 느타리 버섯 No.42균주를 5가지 다른 배지에서 배양하고 리그닌 분해효소의 생산을 실험한 결과 모든 실험 배지에서 Lac와 MnP가 생산되는 것을 확인하였다. 그러나 판막버섯에서 리그닌을 분해하는 대표적인 리그닌 분해효소인 LiP는 모든 본 실험 배지에서는 전혀 생산되지 않는 것을 확인하였으며 본 실험 결과는 느타리 버섯 균주로부터 이전에 보고한 몇몇 연구자들의 결과와 동일하였다(Iwamoto 등, 1997; Kamitsuji 등, 2004; Ruiz-Rodriguez 등, 2011).
- 반면에 MnP의 최대 활성은 GPY배지에서 PDB배지보다 80배 향상되었으며 GPY배지에 밀기울을 첨가한 GPYW배지의 경우 PDB배지보다 180배 향상되었음을 알 수 있었다. 한편 고체배지인 WMW배지에서 Lac의 최대 활성은 PDB배지보다 20배 향상되었으며 밀기울 단독(W)배지에서는 PDB배지보다 36.7배 향상되었음을 알 수 있었다. 반면에 MnP의 최대 활성은 WMW배지에서 PDB배지보다 200배 향상되었으며 밀기울 단독(W)배지에서 PDB배지보다 15배 향상되었음을 알 수 있었다.
- 4). 한편 또 다른 고체배지인 wheat bran(W) 배지에서는 15일간 정치 배양한 결과, laccase 활성은 7일째 11.0 U/ml의 최대 활성을 나타낸 후 감소하는 경향을 나타내었으며 MnP 활성은 11일째 0.3 U/ml의 최대 활성을 나타낸 후 감소하는 것을 확인 할 수 있었다(Fig. 5).
- 한편 또 다른 질소원인 밀기울의 경우, 액체배지인 GPY배지에 17.5% 첨가하였을 때 Lac의 최대 활성은 1.4배, MnP의 최대 활성은 2.3배 증가하는 경향을 나타내었으며 고체배지인 WM배지에 3.3% 첨가하였을 때 GPY배지보다 Lac의 최대 활성은 3.5배, MnP의 최대 활성은 2.5배 증가하는 경향을 나타내었다. 그러나 밀기울 단독배지인 W배지에서는 Lac 최대 활성은 11 U/ml로 실험한 모든 결과 중에서 가장 높게 나타났으나 MnP활성은 0.
후속연구
- 42균주의 리그닌 분해효소활성에 영향을 미치는 인자인 것으로 생각되며 밀기울의 질소함량 뿐만 아니라 목분(wood meal)에 함유되어 있는 구리(Cu)나 망간(Mn)과 같은 금속이온이 리그닌 분해효소의 활성에 영향을 미쳤을 것으로 판단된다. 결론적으로 본 연구결과를 활용하여 느타리버섯 균주를 이용한 리그닌 분해효소의 대량생산을 할 수 있는 기초 연구 자료로 활용될 수 있을 것으로 생각한다.
- 이러한 결과로 볼 때, 배지 조성은 리그닌 분해효소의 활성과 매우 밀접한 관계가 있음을 알 수 있으며 본 실험결과에서 밀기울 단독배지에서 MnP 활성이 매우 낮게 나타난 이유는 과도한 질소원의 함량 때문인 것으로 판단된다. 따라서 Lac 활성은 질소원의 농도에 비례하여 생산되는 것으로 생각되나 MnP 활성의 경우 질소원이 어느 정도의 농도까지는 활성에 영향을 미치지만 너무 높은 농도에서는 활성이 억제되는 것으로 판단되며 추후 질소원의 농도에 따른 두 효소의 단백질 발현 연구를 진행할 필요가 있다고 생각한다. 최근에 Elisashvili와 Kachlishvili의 연구 결과(2009)에 의하면 백색부후균인 단색구름버섯(Cerrena unicolor)을 밀기울 단독배지에 배양시켰을 경우 Lac활성은 매우 높게(151.
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