[논문]소청룡탕이 천식이 유발된 생쥐의 면역세포에 미치는 영향

김형우

문제 정의

본 논문에서 저자들은 생쥐에 천식을 유발시킨 후, 기관지 폐포 세척액 내에서 사이토카인의 변화와 면역세포의 침윤정도를 관찰하고, 이러한 변화에 대하여 소청 룡탕이 미치는 영향을 조사하여 의미 있는 결과를 얻었기에 이에 보고하는 바이다.
소청룡탕이 기관지 조직 내로 의 염증세포 침윤에 미치는 영향을 조사하기 위하여, 기관지 폐포세척액으로부터 염증세포의 개수와 종류를 조사하였다. 본 실험으로부터 천식을 유발한 대조군에서 정상군에 비해 무려 34.

가설 설정

유발 하였다.第, W7)이러한 방식의 문제점은 각각의 개체들의 호흡량과 기타 다른 요인에 따라서 각각의 개체들에게 흡입되는 항원의 양이상이할 수 있다는 점이다. 그러나, 본 논문에서와 같이 최근 들어 새로 개발된 방법인 비강 내점적의 방법'8)을 사용하게 되면 모든 실험 개체에게 균등한 양의 항원을 빠른 시간 안에 전달할 수 있다는 장점을 가지게 된다.

제안 방법

투여하였다. 3일 뒤 같은 방법으로 2번에 걸쳐 비강 내 점적을 시행하여서 총 4번의 비강 내점적을 시행하였다(Fig. 1). 소청룡탕은 6일간 구강 투여 되었는데, 투여용량은 이전 연구에서 생쥐의 대사율과 체중을 고려하며, kg 당 정상인의 4배 분량으로 정하였다(data not shown).
lOOul의 용매 (phosphate buffer saline, PBS) 에 lOOug 의 난황(OVA, 항원으로서)과 2mg alum을 녹여 3일간 복강으로 주사한 후, 2주 뒤 생쥐를 케타민(100㎎/㎏)과 럼푼(10㎎/㎏) 으로 마취시킨 후, 비강 내점적의 방법으로 25ug의 항원 (PBS 30ul)을 생쥐에게 2일에 걸쳐 투여하였다. 3일 뒤 같은 방법으로 2번에 걸쳐 비강 내 점적을 시행하여서 총 4번의 비강 내점적을 시행하였다(Fig.
면역세포의 개수를 측정하기 위하여, 기관지폐포 세척액을 5배로 희석한 다음, 슬라이드 글라스(MARIENFELD, 독일)에 붙여 말린 후, 각각의 슬라이드 글라스를 헤마톡실린 과에 오신으로 염색하고, 400배에서 현미경으로 관찰 하였다.
이러한 내용들을 참고하여 살펴보면, 본 논문에서 사용된 질병 모델은 한의학적으로 실증에 해당한다고 볼 수 있다. 소청룡탕 (小靑龍湯)은 세계적으로 가장 유명한 실증에기 인한 호흡기 질환 치료제이지만, 그 치료기전에 대해서는 명확히 알려진 바가 별로 없는 실정이기 때문에 이러한 실험을 기획하게 되었다.
실험 마지막 날, 과도한 용량의 케타민과 럼푼을 주사하여 생쥐를 희생시킨 후, 경부를 절개하고 기관지의 연골 사이를 절개하여 개방시킨 후, 연골과 연골 사이로 도 관 (Insyte, BD) 을 삽입하며 기관지 폐포세척액을 얻었다. 1 회 세척당 1.
얻어진 기관지 폐포 세척액을 1, 100g로 10간 원심분리하여 찌꺼기를 제거하고 난 후, 얻어진 상층액을 사이토카인을 측정하는 데 사용하였다. IL-4, IFN-g 의 농도를 측정함에 있어 Chen R.
다음과 같다(Table 1). 여덟 가지 한약재를 표기된 용량대로 섞어서 전기약탕기(대웅, 한국)에 넣고 증류수 1, 300ml을 붓고 3시간 달여 최종 500ml의 검액을 얻었다, 얻어진 검액을 원심분리기를 이용하여 2, 200g에서 20분간 원심분리한 후, 찌꺼기를 버리고 상층액을 얻었다. 얻어진 약액을 진공농축기(EYELA, 일본)를 이용하여 1/10로 농축하여 사용할 때까지 영하 20℃의 냉동실에 보관하였다.

대상 데이터

8 주령된 암컷 Balb/c 생쥐를 오리엔트 바이오(서울, 한국에서 구입하여, 일주일간 실험실 환경에 적응시킨 후 온도와 습도가 조절되는 환경(24 ± 3℃, 12-hr light-dark cycle) 에서고형사료와 물을 마음껏 섭취하게 하며 실험에 사용하였다. 실험동물은 정해진 규정에 의하여 다루었으며, 실험 프로토콜은 실험동물위원회의 승인을 득하였다.
난황(OVA albumin)은 시그마(St. Louis, 미국)에서 구입하였고 사용하기 전에 DetoxiGel colunm(Pierce, New York, USA)을 이용하여 독성을 제거하고 BCA 법으로 다시 정량하였다. 사이토카인 측정을 위하여, The Multiplex cytokine detection kite Bender Med-Systems(Vienna, Austria)으로부터 구입하였다.
Louis, 미국)에서 구입하였고 사용하기 전에 DetoxiGel colunm(Pierce, New York, USA)을 이용하여 독성을 제거하고 BCA 법으로 다시 정량하였다. 사이토카인 측정을 위하여, The Multiplex cytokine detection kite Bender Med-Systems(Vienna, Austria)으로부터 구입하였다.

데이터처리

모든 결과는 Mann-Whitney' s U test를 통하여 검정하였고 이때에 SPSS version 1 L5가 사용되었다. 결과에서 P 값이 0.
반응이 끝난 후, 잘 씻어내고 남은 검체를 5-mKSPL, 한국) 튜브에 옮겨 담은 후, 30M의 PBS를 더해 총 50(X11로 만들어준다. 형광도 는 유세포 분석기(BD, 미국)를 이용하여 측정하였고, 측정된 값은 flow cytomix pro(Bender Medsystems, Vienna, Austria)를 이용하여 계산하였고, 계산 결과는 picograir/rnillilitedpg/ml) 로 나타내었다.

이론/모형

IL-4, IFN-g 의 농도를 측정함에 있어 Chen R. et al의 방법(1)으로 시행하였다. 간략히 요약하자면, 기관지 폐포세척액과 농도별로 희석된 스탠다드를 96-well 필터 플레이트 (Millipore, 미국)에 넣은 후, 각각의 사이토카인에 대한항체가 부착되어 있는 형광 비드 (fluorescent bead) 와 비오틴이 부착되어 있는 2차 항체를 넣고, 실온에서 2시간 동안 반응시킨다.
Total inflammatory cell number and shape are measured using cytospin methods. The data were observed in same sized squared, 650cm') at the magnification of 400.
재료 및 방법에서 논술한 것과 같이 기관지폐포 세척액으로부터 사이토카인의 함량을 형광 비드법을 이용하여 측정하였다. 이러한 측정 결과에서, 대조군은 현격한 수준의 IL-4(36.

성능/효과

지속된다.(2) 천식 환자의 기관지 폐포 세척액, 가래 등에서 Th2 driven cytokine인 IL-4의 레벨은 정상인에 비해 올라가 있고, Thl driven cytokine 인 IFN-g 레벨은 정상인보다 낮아져 있다. 13, 1415) 이러한 과정을 통하여 N₂ 반응에 관련된 면역세포들이 기도 내로 침윤되게 되는데, 본 논문에서 사용한 천식 모델은 이러한 천식 환자의 상태를 잘 반영하였다.
결론적으로 본 논문에서는 소청룡탕(小靑龍湯)이 천식 치료에 사용될 수 있는 매우 강력한 가능성을 제시하며, 아울러 이러한 소청룡탕 (小靑龍湯)의 천식 치료기전은 Thl/Th2 밸런스를 조절하는 기능일 것으로 사료된다.
영향을 미치지 않았다. 또한 천식 유발에 의해 현저하게 증가된 기관지 내로의 염증세포 침윤을 효과적으로 억제하였다. 이상의 결과들에서 소청룡탕(小靑龍湯)의 염증 억제 기전은 Thl/T口2 밸런스를 조절하는 것이 한가지기 전임을 유추해 볼 수 있겠다
조사하였다. 본 실험으로부터 천식을 유발한 대조군에서 정상군에 비해 무려 34.5배나 되는 면역세포가 침윤된다는 사실을 알 수 있었다. 이러한 염증세포수의 증가를 소청룡탕의 투여가 효과적으로 억제하였고, 그 억제력은 총 세포 개수 기준으로 65%에 달했다 (Fig.
하지만, Nagai 등囲 은 소청룡탕(小靑龍湯)의 구강투여가 천식 유발에 의하여 감소된 IFN-g의 생성 수준을 정상 수준으로 회복시켜 줄 수 있다고 보고 했고, 게다가 Ko 등分은 소청룡탕의 처지가 IFN-g의 mRNA 발현 수준을 향상시킨다는 것을 RT-PCR을 통하여 밝혀냈다. 우리의 결과에서 소청룡탕(小靑龍湯)은 천식 유발에 의하여 상승된 IL-4의 수준을 효과적으로 감소시켜 이전의 논문들과 동일한 결과를 나타내었고, IFN-g의 생성 수준에는 별 영향을 미치지 않았다.
이러한 결과를 요약해보면, 소청룡탕(小靑龍湯)의 구강투여는 기관지 폐포 세척액 내에서 천식 유발에 의하여 증가된 Th2 관련 사이토카인인 IL-4의 수준을 효율적으로 낮추었고, Thl 관련 사이토카인인 IFN-g의 수준에는 특별한 영향을 미치지 않았다. 또한 천식 유발에 의해 현저하게 증가된 기관지 내로의 염증세포 침윤을 효과적으로 억제하였다.
5배나 되는 면역세포가 침윤된다는 사실을 알 수 있었다. 이러한 염증세포수의 증가를 소청룡탕의 투여가 효과적으로 억제하였고, 그 억제력은 총 세포 개수 기준으로 65%에 달했다 (Fig. 3).현미경을 통하여 확인된 면역세포들은 대식세포, 그리고 림프구와 호중구나 호산구를 포함하는 다핵형 세포(polymorphonuclear cells) 였고, 각 군에서 가장 대표적인 현미경 소견을 Fig.
이용하여 측정하였다. 이러한 측정 결과에서, 대조군은 현격한 수준의 IL-4(36.58 ± 3.37pg/ml) 생성량의 증가를 보임을 확인 할 수 있었다.이 때의 정상군이 보인 IL-4 수준은 25.
또한 천식 유발에 의해 현저하게 증가된 기관지 내로의 염증세포 침윤을 효과적으로 억제하였다. 이상의 결과들에서 소청룡탕(小靑龍湯)의 염증 억제 기전은 Thl/T口2 밸런스를 조절하는 것이 한가지기 전임을 유추해 볼 수 있겠다

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