[논문]Porphyromonas gingivalis, Prevotella intermedia, 그리고 Prevotella nigrescens에서의 hemin 결합 단백질에 대한 연구

김성조

doi:10.5051/jkape.2006.36.1.155

Porphyromonas gingivalis, Prevotella intermedia, 그리고 Prevotella nigrescens에서의 hemin 결합 단백질에 대한 연구
Isolation and Partial Characterization of Hemin-binding Cell Envelope Proteins from Porphyromonas gingivalis, Prevotella intermedia, and Prevotella nigrescens 원문보기

대한치주과학회지 = The journal of Korean academy of periodontology, v.36 no.1, 2006년, pp.155 - 165

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The results of this study confirm that the availability of hemin influences the expression of selected membrane proteins of Porphyromonas gingivalis, Prevotella intermedia, and Prevotella nigrescens. A 30 kDa (heated 24 kDa) hemin-binding protein whose expression is hemin regulated was identified and purified in P. gingivalis. A strong hemin-binding function was found by LDS-PAGE and TMBZ staining when P. gingivalis cells were grown under hemin-limited conditions. A 50 kDa cell envelope associated protein, whose expression is hemin regulated, is considered to be a putative hemin binding protein from P. intermedia and P. nigrescens, respectively. N-terminal amino acid sequence analysis of CNBr-digested 24 kDa hemin binding protein from P. gingivalis revealed that this protein belongs to a new, so far undescribed hemin-binding class of proteins. N-terminal amino acid sequence of a 50 kDa putative hemin binding protein from P. intermedia was identical with Enolase from Streptococcus intermedia. Work is in progress to further characterize the molecular structure of these proteins.

주제어

AI 본문요약
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문제 정의

본 연구는 hemin 의존성을 갖는 치주질환 주요 병인 균주인 P. gingivalis, P. intermedia, 二丄리고 P. m'gre&WLS의 hemin 결합 세포막 단백질의 특성을 비교 분석하기 위해 수행되었다. 본 연구에서는 hemin이 고갈된 상태인 passage 5의 P.
기전들을 소유하고 있다. 본 연구는 hemin 의존성을 갖는 치주질환 주요병인균주인 P. gingivalis, P. intermedia, 그리고 P m'grescens의 hemin 결합 세포막 단백질의 특성을 비교 분석하기 위해 수행되었다.
본 연구는 hemin 의존성을 갖는치주질환 주요 병인 균주인 P. gingivalis, P. intermedia, 그리고 P. nigrescens^ hemin 결합 세포막 단백질의 특성을 비교 분석하기 위해 수행되었다. 본 연구는 이들 균주에서의 porphyrin 생리 및 hemin 획득 기전을 밝히는데 있어중요한 의의가 있으리라 사료된다
nigrescens^ hemin 결합 세포막 단백질의 특성을 비교 분석하기 위해 수행되었다. 본 연구는 이들 균주에서의 porphyrin 생리 및 hemin 획득 기전을 밝히는데 있어중요한 의의가 있으리라 사료된다
본 연구는, hemin 의존성을 갖는 치주질환 주요 병인 균주인 P. gingivalis, P. intermedia, 그리고 P. Egrescens에서의 hemin 조절 세포막 단백질로 hemin 결합에 관여하여 이들 균주에서의 hem in 획득에 중요한 역할을하는 것으로 추정되는 단백질을 확인하여 순수분리하고 몇몇 특성을 비교 분석한 최초의 보고로 사료된다. 향후 이 단백질에 대한보다 심도있는 연구가 수행되어야 할 것으로 사료되는 바이다.

제안 방법

단백질 분포의 평가를 위해서는 Laemmli"의 discontinuous sodium dodecyl polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGEX 실시하였고, 세포막 단백질 중에서 heme-associated perox- idase activity를 갖는 밴드를 확인하기 위해서는 lithium dodecyl sulfate (LDS) PAGE를 시행하였匸上 12% acrylamide separating gel고} 4%의 acrylamide stacking gel을 이용하였으며, verti cal slab gel apparatus (Hoefer Scientific, San Francisco, CA)오卜 minigel apparatus (Mini PROTEANR II Dual Slab Cell, Bio-Rad, Richmond, CA)를 이용하여 30 mA에서 전기영동 하였다. 각 lane에는 통상 20 卩g 및 60 Ug의 단백질을 각각 적용하였으며, low molec^ ular weight standards (Bio-Rad, Richmond, CA)> 활용하였다.
551. Amido black으로 염색한 후 해당 밴드를 잘라내었으」겨, Applied Biosystems Model 177A gas-liquid phase sequanator (coupled to an on-line HPLC model 120A analyzer)를 이용하여 N-terminal 아미노산 서열을 결정하였다.
Early stationary phase의 균주를 원심 분리 (12, 000 X g, 20 min at 4©하여 회수하여, 냉각된 phosphate-buffered saline (PBS, pH 7.2) 으로 3 회 세척한 후 각각 2 mN 의 phenyl- methylsulfonyl fluoride (PMSF), Na-P~Tosyl- L-lysine chloromethyl ketone (TLCK), 그리고 benzamidine을 포함하고 있는 PBS에 분산시켰다. 그 후 sonicator로 세포를 파쇄하고, 저속 (10, 000 X g, 30 min) 및 고속 (200, 000 x g, 2 hr) 원심분리를 시행하여 세포막을 분리하였다.
TMBZ 염색은 Stugard 등 疝의 방법에 의거하여 수행하였다. Reducing agent인 2'-mercaptoethanol의 존재가 전기영동에 미치는 영향도 분석하였다.
세균의 성장은 이중 배양 후 660 nm 파장에서의 흡광도를 측정하여 결정하였다. 균주 배양의 오염 여부는 Gram 염색 후 검경하여 판단하였다. 오염되어 있는 철분과 hemin을 제거하기 위해 모든 유리 기구들은 chro mic acid와 deionized wat或로 세척한 후 사용하였다
Ti谚zesc纹睥게서의 50 kDa hemin 조절 단백질은 이들 균주에서의 hemin 결합에 관여하는 단백질로 추정할 수 있다. 또한, 본 연구에서는 passage 5의 P. gingivalis의 30 kD 세포막 단백질에서 hemin-associated peroxidase activity를 확인하였다. 이는 P.
, Beverly, MA)로 용출액을 농축하였다. 분리된 단백질의 순도는 SDS-PAGE로 확인하였다.
균주 세포 내부에 저장되어 있는 hemin을 고갈시켰다. 세균의 성장은 이중 배양 후 660 nm 파장에서의 흡광도를 측정하여 결정하였다. 균주 배양의 오염 여부는 Gram 염색 후 검경하여 판단하였다.
CBB로 염색하였다. 이 염색 된 gel을 tem- pl ate로 활용하여 , 분리 하고자 하는 hemin 결합 단백질 밴드 (결과 참조)를 절제한 후, Hager오卜 Burgess의 방법如에 의거하여 단백질을 용출하였는 바 그 방법은 다음과 같다 잘라낸 gel 밴드를 잘게 부순 후 0.1% SDS, 0.05 M Tris-HCl, 0.1 mM EDTA, 5 mM DTT, 그리고 0.2 M NaCl을 포함하고 있는 elution buffer# 가하여, 실온에서 1 시간 씩 2차에 걸쳐 단백질을 용출하였다. 그 후 Centricon-10 microconcentrator (10, 000 mo lecular weight cutoff; Amicon Div.

대상 데이터

사용된 균주는 P. gingivails 381, P. inter media ATCC 25611, 그리고 P. nigrescens ATCC 33563이었으며, 이들 균주를 enriched Trypticase soy agar, 또는 2.1% (W0 Wcoplasma broth base (BBL, Becton Dickinson, Cockeysville, MD)에서, 1 Ug/ml의 menadione 과 5 卩g/ml의 hemin을 첨가하여, 37℃의 혐기성 조건 하에서 배양하였다. Hemin 제한 조건에서의 배양을 위해서는, hemin을 포함하지 않은 액체 배지에서 최소 5회 계대 배양하여.

이론/모형

Kermel과Hol产)에 의해 변형된 bicinchoninic acid (BCA) assay (Pierce, Rockford, IL) 법에의거하여 단백질 농도를 결정하였다. 이는 micro titer plate (flat-bottomed)에서의 단백질 정량을 위해 변형된 방법으로, 이를 간략히 소개하면, 20 m 의 시료를 microtiter well에 넣고 증류수로 2배 연속 희석한 후, 200 卩1의 protein assay reagent 를 각 well에 가하여 30분간 실온에 위치시키고, plate reader (570 nm)로 측정하였다 표준 단백질로는 bovine serum albumin이 사용되었다.
Louis, MO) 으로 염색하였다. TMBZ 염색은 Stugard 등 疝의 방법에 의거하여 수행하였다. Reducing agent인 2'-mercaptoethanol의 존재가 전기영동에 미치는 영향도 분석하였다.
각 lane에는 통상 20 卩g 및 60 Ug의 단백질을 각각 적용하였으며, low molec^ ular weight standards (Bio-Rad, Richmond, CA)> 활용하였다. 전기영동 후 Coomassie bril liant Blue-R-250 (CBB)으로 염색하고, 각 세포막 단백질밴드의 분자량 계산은 linear regression analysis에 의거하였다. 세포막 단백질의 hem- in-associated peroxidase activity를 결정히기위해 LDS-PAGE gel을 tetramethylbenzidine (TMBZ, Sigma Chemical Co.

성능/효과

刀s에서는 으F 50 kDa의 단백질 밴드가 현저히 강화되어 발현되었다 (Figure 1). LDS- PAGE gel을 TMBZ로 염색한 결과, passage 5의 P. gingivalis 세포막단백질은 30 kD에서 hem in-associated peroxidase activity 를 보였다 (Figure 2).
N-terminal 아미노산 서열을 GenBank 자료에서 분석한 결과에 의하면, P. intermedia^ 50 kDa hemin 결합 추정 단백질은 Streptococcus intermedins의 Enolase와 아미노산 서열이 일치하였으며, P. gingivalis의 24 kDa hemin 결합 단백질과 P nigrescens의 50 kDa hemin 결합추정 단백질은 기존의 보고된 단백질과 상동성을 갖지 않는 새로운 단백질로 추정된다.
gingivalis의 30 kD 세포드+ 단백질에서는 hemin-associated peroxidase activity가 확인되었다. N-terminal 아미노산 서열을 분석한 결과에 의하면, P. intermedia의 50 kDa hemin 결합 추정 단백질은 Streptococcus infermedius으) Enolase와 아미노산 서열이 일치하였으며, P. gingivalis의 24 kDa hemin 결합 단백질과 P. nigrescent 50 kDa hemin 결합추정 단백질은 기존의 보고된 단백질과 상동성을 갖지 않는 새로운 단백질로 추정된다.
본 연구에서 분리된 P. gingivalis의 24 kDa (unheated 30 kDa) hemin 결합 단백질 그리고 P. intermedia와 P. nigrescens^} 50 kDa hem in 결합 주정 단백질의 electrophoretic mobility 는 환원제인 2'-mercaptoethan이의 존재 유무에 영향을 받지 않았는 버卜, 이는 이 단백질에 disulfide bond가 존재하지 않음을 보여준다.
본 연구에서는 hemin이 고갈된 상태인 passage 5의 P. gMgf卩勿에서 으/ 24 kDa (unheated 30 kDa), 그리고 passage 5의 P. intermediate P. zifgrescens에서는 약 50 kDa의 단백질 밴드가 현저히 강화되어 발현되었다. Smalley 등釦)과 Bramanti와 Hol严는 몇몇 치주질환 병인 균주에서의 hemin 조절 세포막 단백질이 hemin 결합 단백질로서의 역할을 수행할 수 있음을 보고한 바 있다.
m'gre&WLS의 hemin 결합 세포막 단백질의 특성을 비교 분석하기 위해 수행되었다. 본 연구에서는 hemin이 고갈된 상태인 passage 5의 P. gin~ givMs에서 약 24 kDa (unheated 30 kDa), 그리고 passage 5의 P. intermedia와 P. ni~ gresieis에서는 약 50 kDa의 hemin 조절 세포막 단백질이 확인되었으며, 이들은 hemin 결합에 관여하는 것으로 추정된다. P.

후속연구

Egrescens에서의 hemin 조절 세포막 단백질로 hemin 결합에 관여하여 이들 균주에서의 hem in 획득에 중요한 역할을하는 것으로 추정되는 단백질을 확인하여 순수분리하고 몇몇 특성을 비교 분석한 최초의 보고로 사료된다. 향후 이 단백질에 대한보다 심도있는 연구가 수행되어야 할 것으로 사료되는 바이다.

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저자의 다른 논문 :

표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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