흑두청국으로부터 분리된 혈전용해력이 우수한 Bacillus subtilis BB-1(KFCC 11344P)으로부터 혈전용해효소 유전자를 PCR법에 의해 크로닝하였고 이를 BCF-1으로 명명하였다. BCF-1의 DNA 염기서열결정 결과 1,145 bp 크기의 혈전용해 효소로, 일본의 natto로부터 분리된 nattokinase 유전자와 99%의 상동성을 보임을 확인하였다. 혈전용해효소 유전자의 발현을 위하여 Bacillus 발현계인 Bacillus-E. coli의 shuttle vector인 pEB vector에 크로닝 하고 host로서 B. subtilis 168에 형질전환시켜 대량 발현시켰다. 생산된 혈전용해효소의 최 적활성 pH와 온도는 7.0과 $35^{\circ}C$로 확인되었다, 기질에 대한 분해양상을 조사한 결과 fibrin에서만 특이적으로 강한 분해가 일어났으며, skim milk에서 아주 약한 분해능을 보였으나 blood agar, gelatin, casein에서는 전혀 분해능을 보이지 않았다. 특히 blood agar plate에서 분해능이 없는 것으로 보아 혈액 내에서의 적혈구 파괴현상과 같은 부작용에 대한 위험을 배제할 수 있을 것으로 사료된다. BCF-1에 의해 생산된 혈전용해효소는 fibrin 특이적으로 활성을 나타냄을 확인할 수 있으며, 이는 임상적이나 산업적으로 적용하였을 때 부작용에 대한 위험적인 문제는 배제될 수 있으리라 생각된다.
흑두청국으로부터 분리된 혈전용해력이 우수한 Bacillus subtilis BB-1(KFCC 11344P)으로부터 혈전용해효소 유전자를 PCR법에 의해 크로닝하였고 이를 BCF-1으로 명명하였다. BCF-1의 DNA 염기서열결정 결과 1,145 bp 크기의 혈전용해 효소로, 일본의 natto로부터 분리된 nattokinase 유전자와 99%의 상동성을 보임을 확인하였다. 혈전용해효소 유전자의 발현을 위하여 Bacillus 발현계인 Bacillus-E. coli의 shuttle vector인 pEB vector에 크로닝 하고 host로서 B. subtilis 168에 형질전환시켜 대량 발현시켰다. 생산된 혈전용해효소의 최 적활성 pH와 온도는 7.0과 $35^{\circ}C$로 확인되었다, 기질에 대한 분해양상을 조사한 결과 fibrin에서만 특이적으로 강한 분해가 일어났으며, skim milk에서 아주 약한 분해능을 보였으나 blood agar, gelatin, casein에서는 전혀 분해능을 보이지 않았다. 특히 blood agar plate에서 분해능이 없는 것으로 보아 혈액 내에서의 적혈구 파괴현상과 같은 부작용에 대한 위험을 배제할 수 있을 것으로 사료된다. BCF-1에 의해 생산된 혈전용해효소는 fibrin 특이적으로 활성을 나타냄을 확인할 수 있으며, 이는 임상적이나 산업적으로 적용하였을 때 부작용에 대한 위험적인 문제는 배제될 수 있으리라 생각된다.
A fibrinolytic enzyme gene was isolated from Bacillus subtilis BB-1 by PCR method. Primers for PCR cloning were designed according to pre-identified gene for fibrinolytic enzymes from B. subtilis. The primer sequences were 5'-CGG ATC CGT GAG AGG CAA AAA GGT G-3' and 5'-TGA ATT CTT AAT GTG CTG CTG CT...
A fibrinolytic enzyme gene was isolated from Bacillus subtilis BB-1 by PCR method. Primers for PCR cloning were designed according to pre-identified gene for fibrinolytic enzymes from B. subtilis. The primer sequences were 5'-CGG ATC CGT GAG AGG CAA AAA GGT G-3' and 5'-TGA ATT CTT AAT GTG CTG CTG CTT GTC C-3' as concensus sequences of the fibrinolytic genes of Bacillus species. The PCR product was 1,145 bp and the sequence homology was 99% with nattokinase gene isolated from Japanese natto. The cloned fibrinolytic gene was reconstructed in Bacillus-E. coli shuttle vector, pEB for bulk-production. The fibrinolytic enzyme was purified by FPLC from the cloned B. subtilis 168. The optimum pH and temperature of the enzyme were 7.0 and $35^{\circ}C$, respectively. The fibrinolytic enzyme did not show any activity toward to skim milk, gelatin, casein and blood agar plate. The enzyme specific polyclonal antibody was prepared in rabbit for further assays such as detection of the gene expression in plant cells. This means that the enzyme may be used for health-care such as thrombosis without any hamful effects in the blood vessel.
A fibrinolytic enzyme gene was isolated from Bacillus subtilis BB-1 by PCR method. Primers for PCR cloning were designed according to pre-identified gene for fibrinolytic enzymes from B. subtilis. The primer sequences were 5'-CGG ATC CGT GAG AGG CAA AAA GGT G-3' and 5'-TGA ATT CTT AAT GTG CTG CTG CTT GTC C-3' as concensus sequences of the fibrinolytic genes of Bacillus species. The PCR product was 1,145 bp and the sequence homology was 99% with nattokinase gene isolated from Japanese natto. The cloned fibrinolytic gene was reconstructed in Bacillus-E. coli shuttle vector, pEB for bulk-production. The fibrinolytic enzyme was purified by FPLC from the cloned B. subtilis 168. The optimum pH and temperature of the enzyme were 7.0 and $35^{\circ}C$, respectively. The fibrinolytic enzyme did not show any activity toward to skim milk, gelatin, casein and blood agar plate. The enzyme specific polyclonal antibody was prepared in rabbit for further assays such as detection of the gene expression in plant cells. This means that the enzyme may be used for health-care such as thrombosis without any hamful effects in the blood vessel.
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문제 정의
하지만 이 효소의 대량발현이 어려워 효 소자체의 상업적 이용은 많이 이루어지지 않고 있으며, 나또 식품을 통하여 이 효소의 가치를 부여하고 있다. 현재까지는 Bacillus 유래의 혈전용해효소 유전자를 크로닝 후 대량생산 체계가 구축되지 않아 의학적 가치의 상품개발에 성공한 예가 없어 그 목적의 일환으로 본 연구에서는 혈전용해작용이 우수하며, 혈전만을.특이적으로 분해함으로서 섭취 시 인체나 혈액 내에서 부작용이 없는 혈전용해효소를 Bacillus sub Ulis BB-1 (KFCC11344P)로부터 크로딩하고 그 유전자를 Bacillus host에 대량발현 및 순수분리하고 효소의 특성을 조사하여 의학적 이용가능성을 검토하였다.
이 효소를 natto에서 분리하여 실험을 이행하였고, 따라서 natto 자체를 상품화하여 판매되고 있지만 이 효소의.유전자를 크로닝하여 그 재조합 DNA를 대량 발현시키거나 혹은 의학적 이용은 전무한 실정으로 본 연구에서 이를 새롭게 크로딩하고 Bae에서 대량 발현시키고자 하였다.
제안 방법
현재까지는 Bacillus 유래의 혈전용해효소 유전자를 크로닝 후 대량생산 체계가 구축되지 않아 의학적 가치의 상품개발에 성공한 예가 없어 그 목적의 일환으로 본 연구에서는 혈전용해작용이 우수하며, 혈전만을.특이적으로 분해함으로서 섭취 시 인체나 혈액 내에서 부작용이 없는 혈전용해효소를 Bacillus sub Ulis BB-1 (KFCC11344P)로부터 크로딩하고 그 유전자를 Bacillus host에 대량발현 및 순수분리하고 효소의 특성을 조사하여 의학적 이용가능성을 검토하였다.
iNtRON사의 Genomic DNA Extraction kit (Cat. No 17121) 를 사용하여 청국에서 분리한 Bacillus subtilis BB4(KFCC 11344P)을 OD LO이 되게 배양한 후 회수한 균체를 50 pre-buffer (added 20 mg/RNase A)로 현탁 후 lysozyme 3 (100 mg/)를 첨가하여 37℃ 에서 15분동안 반응시켰다.
를 합성하였고, 이때 PCR 후 크로 닝을 위하여 forward primer에 BamHl 그리고 reverse pri- mei에 EcoRl restriction site를 각각 삽입하였다. 증폭에 사용된 Perkin Elmer-2400의 조건을 초기 denaturation 단계에서 95℃, 30초를 유지하였으며, annealing 55℃, 30초, 그리고 중합반응은 72℃, 30초에서 30 cycle을 실시한 후 최종 단계인 DNA합성은 72℃에서 10분 동안 실시하여 증폭하였다.
생성된 PCR 산물을 pGEM T-easy(Promega Co., USA) 크로닝 벡터에 크로닝 후 primer 제작 시 인위적으로 삽입한 BmHl과 EwRl으로 절단하여 pBluescriptn SK(-)에 sub- cionin음하여 DNA 연결 순서를 확인하고 혈전용해효소 대량 발현을 위해 DNA 단편의 5'-end에 Ndelf 3'-end에 BamHl restriction site를 각각 생성시켜 Bacillus^- E. c의 안inttle vector 인 pEB vector (BioLeaders Co., Korea) 의 Nd이과 BamHl site에 연결하여 protease 활성이 약한 B. subtilis 168에 형질전환 하였다.
subtilis 168 competent cell에 가하여 얼음에 10분간 방치하였다. Electroporator Gene Pulser' II(Bio Rad Co., USA) 의 electric fid rength (kV/cm)와 resistance (Q), capacitance (#F)를 선택한 후 혼합된 c을 cuvette에 미리 37℃ 항온 수조에서 가온한 expression medium(4xpenassay medium : 2xwashing buffer) 1 을 가하고 세포를 부유시켜 회수하였다. 그 후 37C의 항온수조에서 3시간 동안 배양한 다음 kanamycin (25 )이 포함된 Luria Bertani 배지 에 도말하여 37℃에서 24시간 배양하였다[11].
, Germany)에 녹인 후 직경 87x15 mm petri dish에 넣고 thrombin (1 NIH unit/m£) 20 unit를 첨가하여 실온에 30분간 방치하여 응고시켰다. 응고된 fibrin plate에 시료를 적당량loading하여 6시간동안 37C에서 반응시켜 용해된 분해면적을 측정하였다. 표준혈전 분해효소로 1 unit의 plasmin을 사용하여 비교하였다.
재조합 균주의 배양에 따른 혈전용해효소의 분비발현을 측정하기 위하여 kanamycin (10 mg/m)이 포함된 10 의 Luria-Bertani broth에 접종하여 37℃에서 12시간 동안 배양하였다. 이중 5 를 취하여 500 의 액체 배지에 다시 접종한 후 37C에서 진탕 배양(150 rpm)하면서 생육단계인 대수 증식기, 정지기, 사멸기의 배양 상등액을 회수하여 SDS- PAGE의 단백질 전기영동을 실시하여 확인하였다.
순수 분리된 혈전용해효소를 수컷의 토끼 피하지방에 한 번에 200씩 일주일 간격으로 세 번 주사한 후 마지막 주사다. 혈액은 4C에 overnight 시킨 후 3, 000 rpm에서 분간 원심분리하여 혈청을 얻어 polyclonal 항체로 사용하였다.
이를 PBS buffer로 15분간 3회 세척한 뒤 15 mg 4-chloro-l-naphtol, 45 )Tris-Cl (pH 7.4), 90 HQ?로 구성된 발색용액에 10분간 반응시킨 후 증류수로서 세척하고 건조하여 생성된 band 를 육안으로 관찰하여 사진 촬영하였다.
혈전용해 효소 생산의 최적 pH와 온도를 측정하기 위하여 pH는 fibrin plate# 제조함에 있어서 fibrinogen 용액의 pH 를 각각 5.0부터 9.0까지 조절한 후 thrombin 10 unit를 가하여 본 혈전용해효소를 적당량 loading한 후 37℃에서 6시간 반응시켜 용해된 분해면적을 측정하였다. 이때 pH 4.
0 이상에서는 강산과 강염기로 인해 fibrin plate가 만들어지질 않았다. 최적활성 온도는 최적 pH Z0에서 2(J℃부 터 40℃로 배지의 온도를 조절 후 6시간 반응시켜 용해된 분 해면적을 측정하였다.
제조된 fibrin plate를 80℃에서 30분간 열처리하여 plas~ minogen을 불활성화시킨 fibrin piate (plasminogen-free fi brin plate)와 열처리하지 않은 fibrin plate plasmi- noen-rich fibrin plate)에서 FPLC에 의해 순수 분리된 혈전용해효소를 반응시켜 그 분해 양상을 비교, 검토하여 plami- nogen activator type인지 fibrin을 직접 분해하는 혈전용해효소인지 검토하였다
혈전용해효소를 강력하게 생산하는 B. subiilis BB-1(KFCC 11344P)의 chromosomal DNA를 분리 한 후 B. sis로부터 이미 보고된 공통적인 혈전용해효 소 유전자들의 연결 순서 영역으로부터 forward와 backward의 primer를 각각 25mer 씩 합성하여 1, 145 bp의 PCR산물을 얻었다(Fig. 1). 앞서 설명한 것과 같이 5과 3 '양쪽에 인위적인 제한효소 BamHl 과 EcoRl 자리를 이용하여 PCR 산물을 pBluescript II SK(-) 에 subcloning한 후 재조합된 DNA를 agarose gel상에서 확 인하였고(Fig.
1). 앞서 설명한 것과 같이 5과 3 '양쪽에 인위적인 제한효소 BamHl 과 EcoRl 자리를 이용하여 PCR 산물을 pBluescript II SK(-) 에 subcloning한 후 재조합된 DNA를 agarose gel상에서 확 인하였고(Fig. 2) 혈전용해효소 의 유도적인 대량발현을 위하여 s와 E.
앞서 설명한 것과 같이 5과 3 '양쪽에 인위적인 제한효소 BamHl 과 EcoRl 자리를 이용하여 PCR 산물을 pBluescript II SK(-) 에 subcloning한 후 재조합된 DNA를 agarose gel상에서 확 인하였고(Fig. 2) 혈전용해효소 의 유도적인 대량발현을 위하여 s와 E. coH의 shuttle vector인 pEB vector에 크로닝 하여 대량발현계를 구축하였고(Fig. 3) Bacillus host인 B.
BCF-1 의 염기 서열 결정은 T7, T3 primer를 이용하여 양방향으로 염기서열을 확인하고 DNA assembly를 실시하여 최종 중복되는 연결 순서에 의해 전체적인 염기서열을 결정하 였다(Fig. 5). 결정된 염기서열을 NCBI상의 Genbank를 통해 search한 결과 nattokinase와 유전자가 99 %이상 유사함을 확인하였다(Fig.
재조합 균주에서 혈전용해효소는 배양상등 액의 회수, 70 % ammonium sulfate-g- 이용한 침전, 투석 그리고 FPLC gel filteration의 4단계에 의하여 분리 정제하였다. 모든 과정은 4℃에서 실시하였으며, 12.
순수 분리된 혈전용해효소를 토끼를 통하여 항체를 제작하였다. 이 항체를 이용하여 B.
Protease기질인 skim milk, casein, gelatin, blood agar를 이용하여 순수 분리된 혈전용해효소의 기질에 대한 특이성을 비교하였다. 동일한 양의 효소를 37℃에서 16시간 동안 반응시킨 후 분해환을 측정한 결과, Fig.
흑두청국으로부터 분리된 혈전용해력이 우수한 Bacillus subtilis BB-1(KFCC U344P)으로부터 혈전용해효 소 유전자를 PCR법에 의해 크로닝하였고 이를 BCF-1 으로 명명하였다. BCF-1 의 DNA 염기서열결정 결과 1, 145 bp 크기의 혈전용해효소로, 일본의 natto로부터 분리된 nattokinase 유전자와 99%의 상동성을 보임을 확인하였다.
정제된 혈전용해효소의 기질특이성을 조사하기 위하여 각종 단백질인 skim milk, casein, gelatin, blood agar를 기질로 한 plate상에서 동량, 동시간 반응하여 기질의 분해양상을 비교하였다 '
이론/모형
혈전용해효소 활성을 측정하기 위해 Astrup[2]방법에 따라 fibrin을 기질로 하는 fibrin plate법을 응용하였다. 즉 0.
Ammonium sulfate에 의해 농축된 효소액을 멸균 증류수로 4C에서 여러 번 투석을 행하여 염 등을 제거한 다음 0.15 M NaCl이 포함된 50 mM phosphate buffer (pH 7.0)로 녹인 후 FPLC system에서 0.15 M NaCl이 포함된 동일 buffer로 평형화시킨 superdex 200 HR 10/ 30 (Amersham pharma- cia biotech, UK) column을 통하여 분당 0.5 2 정도의 유속으로 gel filtTation하여 분리 정제하였으며, 정제된 단백질은 Laemmii등의 방법[25]에 따라 각각 0.1% SDS가 포함된 12.5% acryamide농도의 Separatin응 gel과 4% acrylamide 농도의 stacking gel을 사용하여 SDS-PAGE gel 상에서 정제된 단백질을 최종 확인하였다.
성능/효과
흑두청국으로부터 분리된 혈전용해력이 우수한 Bacillus subtilis BB-1(KFCC U344P)으로부터 혈전용해효 소 유전자를 PCR법에 의해 크로닝하였고 이를 BCF-1 으로 명명하였다. BCF-1 의 DNA 염기서열결정 결과 1, 145 bp 크기의 혈전용해효소로, 일본의 natto로부터 분리된 nattokinase 유전자와 99%의 상동성을 보임을 확인하였다. 혈전용해효 소 유전자의 발현을 위하여 Bacillus 발현계인 Bacillus-E.
0과 35℃로 확인되었다. 기질에 대한 분해양상을 조사한 결과 fibrin에서만 특이적으로 강한 분해가 일어났으며, skim milk에서 아주 약한 분해능을 보였으나 blood agar, gelatin, casein에서는 전혀 분해능을 보이지 않았다. 특히 blood agar plate에서 분해능이 없는 것으로 보아 혈액 내에서의 적혈구 파괴현상과 같은 부작용에 대한 위험을 배제할 수 있을 것으로 사료된다.
coH의 shuttle vector인 pEB vector에 크로닝 하여 대량발현계를 구축하였고(Fig. 3) Bacillus host인 B. sub- filis 168에 형질전환 결과 Fig. 4과 같이 높은 혈전용해활성 을 보였으며, 본 유전자를 BCF-1 으로 명명하였다.
5). 결정된 염기서열을 NCBI상의 Genbank를 통해 search한 결과 nattokinase와 유전자가 99 %이상 유사함을 확인하였다(Fig. 6). Nattokinase는 Sumi 등[22] 이 이미 임상 실험에서 안전성 및 안정성을 보고한 바 있다.
Bacillus 유래 유전자 발현 host인 168 strain은 protease 활성이 비교적 적은 host로 여기에 앞의 재료 및 방법에서 구축된 pEB-BCF-1 을 형질전환시켰다. Fig. 7에서 보는 바와 같이 약 30 kDa의 protein이 배양상등액에 주 단백질로 생성됨을 확인할 수 있었고 특히 배양 8시간 만에 대량으로 발현, 분비됨을 확인할 수가 있었다.
재조합 균주에서 혈전용해효소는 배양상등 액의 회수, 70 % ammonium sulfate-g- 이용한 침전, 투석 그리고 FPLC gel filteration의 4단계에 의하여 분리 정제하였다. 모든 과정은 4℃에서 실시하였으며, 12.5 % acrylamide gel의 SDS-PAGE 상에 전기영동을 실시한 결과 약 30 kDa의 단일 band로 순수분리 됨을 Fig. 8에서 확인할 수 있었다.
순수 분리된 혈전용해효소 생산의 최적 pH와 온도를 검토한 결과 Fig. 10과 같이 pH 7온도 35℃에서 가장 높은 활성을 나타내었다.
Protease기질인 skim milk, casein, gelatin, blood agar를 이용하여 순수 분리된 혈전용해효소의 기질에 대한 특이성을 비교하였다. 동일한 양의 효소를 37℃에서 16시간 동안 반응시킨 후 분해환을 측정한 결과, Fig. 11에서 보는 바와 같이 skim milk에서 아주 약한 분해능을 보였으나, casein, gelatin, blood agar plate에서는 전혀 분해능을 보이지 않았다. 특히 blood agar plate에서의 분해가 전혀 없는 것으로 볼 때, 혈관 내에서 부작용으로 발생할 수 있는 적혈구 파괴 현상은 일어나지 않을 것으로 판단된다.
크로닝된 혈전용해효소가 fibrin을 직접적으로 분해하는 형태인 fibrinolytic enzyme인지 아니면 plasminogen을 plasmin으로 활성화하여 fibrin을 분해하는 plasminogen ac tivator type 인지를 조사한 결과 Fig. 12과 같이 plasmi nogen0] 있는 상태인 plasminogen-rich fibrin plate와 plas minogen-free fibrin plate에서 동시에 분해되는 것으로 보아 직접적으로 fibrin을 분해하는 fibrinolytic enzyme인 것을 알 수 있으며, 특히 plasminogen이 있을 경우가 없는 경우보다 fibrin의 분해능이 증가된 것을 관찰할 수 있는데 이것은 두 가지 type의 시너지 효과에 의한 것으로 생각된다.
subtilis 168에 형질전환시켜 대량 발현시켰다. 생산된 혈전용해효소의 최적활성pH와 온도는 7.0과 35℃로 확인되었다. 기질에 대한 분해양상을 조사한 결과 fibrin에서만 특이적으로 강한 분해가 일어났으며, skim milk에서 아주 약한 분해능을 보였으나 blood agar, gelatin, casein에서는 전혀 분해능을 보이지 않았다.
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