선택한 단어 수는 입니다.
최소 단어 이상 선택하여야 합니다.
최소 단어 이상 선택하여야 합니다.
선택한 단어 수는 30입니다.
최대 10 단어까지만 선택 가능합니다.
최대 10 단어까지만 선택 가능합니다.
문제 정의
- 본 실험실에서 보유하고 있는 식용 및 약용식물의 추출물을 대상으로 pancreatic lipase의 활성 저해물질을 탐색하였다. 각각의 식물은 methanol로 추출하여 1 m응/ml이 되도록 제조한 후, pancreatic lipase 용액과 섞어 3분간 반응시킨 후, tributylin을 함유한 평판배지의 구멍에 넣고 4시간 후 투명 환(clear zone)의 크기를 측정하여 pancreatic lipase의 activ- ity를 측정하여 투명환의 크기가 작은 시료를 1차 탐색하여 13종의 식물을 선정하였다.
- 본 연구에서는 pancreatic lipase의 활성을 저해하는 물질을 탐색하고자 국내의 식용 또는 약용식물의 추출물을 대상으로 lipase 활성에 대한 저해능력을 측정하고 그 중에서 저해능이 우수한 백자인Ce orientalis) 추출물에 대한 결과를 보고하고자 한다.
- 유래 lipase와 porcine pancreatic lipase에서 상대적으로 우수한 저해효과를 나타내었다. 이와 같은 결과를 근거로 본 실험에서는 li- pase에 대한 활성이 가장 우수한 것으로 판단되는 백자인을 대상으로 pancreatic lipase에 대한 저해활성 연구를 진행하였다.
제안 방법
- 백자인 추출물 TF-1Z TF-2, TF-3 및 orlistat의 농도를 10 /ml 제조한 후, 미분화상태 전구 지방세포인 NIH-3T3 "의 지방세포로의 분화에 미치는 영향을 조사하였다(Table 3). NIH-3T3 L1 이 지방세포로 분화되는 정도의 측정은 지방세포 내 lipid droplet 형성정도로 측정하였다.
- , Rhizopus sp., 기원의 lipase와 porcine pancreatic lipase에 대한 선택적 저해활성 여부를 조사하였다.(Table 2).
- NIH-3T3 L1 세포를 phosphate buffered sal- ine (PBS) 용액으로 세척한 후, 5xl04 cells/ml을 12 well-flat plate에 배양하였다. 48시간 동안 배양 후 10% FBS, 0.5 mM dexamethasone (DEXA), 10 mg/ml insulin, 1 M 3-iso- butyl-l-methyxanthine (IBMX)이 첨가된 배지에서 48시간 동안 배양하고, 이후 2일 간격으로 6일 동안 10% FBS가 첨가된 배지에 10 g/ml insulin과 시료를 첨가하여 분화를 유도 하였다.
- 10 mM CaCh/ 200 mM NaCb을 포함한 5% gum arabic 용액 100 ml을 제조하여 9 ml을 취한 후, 여기에 tributylin 1 ml을 섞어 초음파장치 내에서 유화시킨 후, 2% 한천배지에 혼합하여 평판배지를 제조하였다. 5 mm 두께의 한천배지에 지름 6 mm의 구멍을 만들고, 메탄올에 녹인 시료와 pancre atic lipase 용액을 섞어 3분간 반응시켜 넣은 후 4시간 후 투 명환(dear zone)의 형성 크기를 측정하여 pancreatic lipase 에 대한 저해활성을 측정하였다.
- NIH-3T3 L1 세포의 분화 정도는 역상현미경으로 관찰하여 세포 내 밝은색의 지방과립이 형성되는 것을 확인하였고, 세포의 분화정도는 Oil red O로 염색하여 측정하였다. 60% triethyl-phosphate 100 ml에 500 mg Oil red O를 녹인 후 여과하여 Oi! red O stock solution을 제조하고, Oil red O stock solution 12 ml에 증류수 8 ml을 혼합하여 실험에 사용하였다.
- 백자인 추출물 TF-1Z TF-2, TF-3 및 orlistat의 농도를 10 /ml 제조한 후, 미분화상태 전구 지방세포인 NIH-3T3 "의 지방세포로의 분화에 미치는 영향을 조사하였다(Table 3). NIH-3T3 L1 이 지방세포로 분화되는 정도의 측정은 지방세포 내 lipid droplet 형성정도로 측정하였다. 즉 지방세포 내 lipid droplet을 Oil red O 시약으로 염색하여 isopropanol로 용출시켜 510 nm에서 흡광도를 측정한 결과, Table 3에서 보는 바와 같이 TF-1, TF-3를 처리한 실험구에서는 대조구에 비해 지방세포 분화능이 각각 76.
- Pancreatic lipase의 활성을 저해하는 물질을 탐색하고자 국내의 식용 또는 약용식물의 추출물을 대상으로 lipase 활성에 대한 저해능력이 있는 식물추출물은 탐색한 결과 대복 피, 계혈등, 오배자 및 백자인의 식물추출물을 선정하였다. Pancreatic lipase에 대한 저해활성이 우수한 백자인으로 부터 클로로포름 용매 추출, 실리카겔컬럼 크로마토그라피, 세파덱스 LH-20 컬럼 크로마토그라피와 고속액 체크로마토그라피를 실시하여 pancreatic lipase에 대한 저해활성 물질로 TF-1, TF-2, TF-3를 분리하였다. 이들을 대상으로 porcine pancreatic lipase에 대한 저해효과를 측정한 결과, 활성물질 TF-1, TF-2, TF-3 및 orlistat의 porcine pancreatic lipase에 대한 ICW 값은 각각 44.
- 6g를 회수하고 이를 chloroform, buthanob H2O 로 각각 분획하였다. Panreatic lipase에 대해 강한 저해 활성을 나타내는 chloroform 층을 감압농축하여 2L7응를 획득한 후/ 이를 /7-hexane/chloroform^/l/ v/v) 조건에서 sili ca gel column chromatography(Kiesegel 60, paticle size : 0.040^0.063 nm)를 실시하여 활성물질 2.4g을 용출하였다. 얻어진 활성분획을 chloroform /n-hexane/methanol(2/3/l) 의 용매조건으로 Sephadex LH-20 column chromatography 를 수행하여 활성분획 074 g을 획득하였다.
- 본 실험실에서 보유하고 있는 식용 및 약용식물의 추출물을 대상으로 pancreatic lipase의 활성 저해물질을 탐색하였다. 각각의 식물은 methanol로 추출하여 1 m응/ml이 되도록 제조한 후, pancreatic lipase 용액과 섞어 3분간 반응시킨 후, tributylin을 함유한 평판배지의 구멍에 넣고 4시간 후 투명 환(clear zone)의 크기를 측정하여 pancreatic lipase의 activ- ity를 측정하여 투명환의 크기가 작은 시료를 1차 탐색하여 13종의 식물을 선정하였다. 선정한 각각의 식물추출물을 methanol, chloroform, buthanoL HQ 층으로 용매분획하여 1 mg/ml 농도가 되도록 시료를 제조하여 pancreatic lipase 에 대한 저해능을 조사하였다.
- 백 자인으로부터 pancreatic lipase 활성물질을 분리하기 위하여 Fig. 1에서 나타낸 바와 같이 백자인 200g을 6일 동안 메탄올 1 L에 침지하여 3회 추출하고 진공회전농축기로 감압, 농축하여 39.6g를 회수하고 이를 chloroform, buthanob H2O 로 각각 분획하였다. Panreatic lipase에 대해 강한 저해 활성을 나타내는 chloroform 층을 감압농축하여 2L7응를 획득한 후/ 이를 /7-hexane/chloroform^/l/ v/v) 조건에서 sili ca gel column chromatography(Kiesegel 60, paticle size : 0.
- 각각의 식물은 methanol로 추출하여 1 m응/ml이 되도록 제조한 후, pancreatic lipase 용액과 섞어 3분간 반응시킨 후, tributylin을 함유한 평판배지의 구멍에 넣고 4시간 후 투명 환(clear zone)의 크기를 측정하여 pancreatic lipase의 activ- ity를 측정하여 투명환의 크기가 작은 시료를 1차 탐색하여 13종의 식물을 선정하였다. 선정한 각각의 식물추출물을 methanol, chloroform, buthanoL HQ 층으로 용매분획하여 1 mg/ml 농도가 되도록 시료를 제조하여 pancreatic lipase 에 대한 저해능을 조사하였다. 그 결과 mhanol 추출물의 경우, pancreatic lipase에 대한 저해 효과는 Arecae peri- a(대복피), Mucunae Cs(계혈등), Rs jwm(오배자), is(백자인)이 우수한 저해활성을 나타냈다' 대부분의 추출물은 chloroform 분획에 활성이 있는 것으로 나타났으며, 오배자 등은 buthan이 분획에서도 활성이 있었다 (Table 1).
- 4g을 용출하였다. 얻어진 활성분획을 chloroform /n-hexane/methanol(2/3/l) 의 용매조건으로 Sephadex LH-20 column chromatography 를 수행하여 활성분획 074 g을 획득하였다. 활성물질의 순도를 높이기 위하여 HPLC(YMC, ODS-H80, 25Qx20mm, 30% CH3CN(0.
- 2 ml에 2%(v/v) m어:han()l이 포함된 chloroform/heptane(l:l) 용액 3 ml을 첨가하여 10분 동안 교반한 후, 10분 동안 원심분리 (2Q00xg)하여 수충을 제거하였다. 여기에 copper 반응액 1 ml을 첨가하여 다시 분 동안 교반한 후, 10분 동안 원심분리 (2, 000xg)하여 추출된 이eic acid와 copper salt가 포함된 유기용매층 1 ml을 취하여 0.05%(w/v) 3-ferf-butyl-4-hydrox- yanisole이 포함된 0.1 %(w/v) bathocuprione 용액 1 ml을 첨가한 후, 480 rm에서 흡광도를 측정하여 oleic acid를 정량함으로써 효소 활성을 측정하였다.
- 최종 분리된 활성물질 TF-1Z TF-2, TF-3 및 orlistat를 최종 반응농도별(1〜250 /ml)로 제조하여 porcine pancreatic lipase에 대한 저해효과를 측정하였다(Fig. 2). Fig.
- 얻어진 활성분획을 chloroform /n-hexane/methanol(2/3/l) 의 용매조건으로 Sephadex LH-20 column chromatography 를 수행하여 활성분획 074 g을 획득하였다. 활성물질의 순도를 높이기 위하여 HPLC(YMC, ODS-H80, 25Qx20mm, 30% CH3CN(0.01% TFA), flow rate 2 ml/min)를 수행하여 최종적으로 활성물질 TF-1Z Tf2 TF-3 각각 3.5mg/ 24. mg, 1.
대상 데이터
- Pancreatic lipase의 활성을 저해하는 물질을 탐색하고자 국내의 식용 또는 약용식물의 추출물을 대상으로 lipase 활성에 대한 저해능력이 있는 식물추출물은 탐색한 결과 대복 피, 계혈등, 오배자 및 백자인의 식물추출물을 선정하였다. Pancreatic lipase에 대한 저해활성이 우수한 백자인으로 부터 클로로포름 용매 추출, 실리카겔컬럼 크로마토그라피, 세파덱스 LH-20 컬럼 크로마토그라피와 고속액 체크로마토그라피를 실시하여 pancreatic lipase에 대한 저해활성 물질로 TF-1, TF-2, TF-3를 분리하였다.
- 각 분리단계에 이용된 유기용매는 덕산약품공업(주)의 고순도 제품을 사용하였고 HPLC 용매는 Burdick & Jackson (Muskegon, USA)을 사용하였다. pancreatic lipase assay 에 사용한 tributylin은 Fluka (St. Gallen, Switzerland)에서, pancreatic lipase (Type VI-SZ por cine pancreas), gum arabic은 Sigma (St. Louis, USA) 제품을 사용하였다. 그 외에 사용된 시약은 모두 특급 및 1급 시약을 사용하였다.
- 5 mm in thickness) 와 ODS RP-18 F254S (25DC-Platten 5x10 cm)는 Merck사 (Darmstadt Germany)로부터 구입하였다. 각 분리단계에 이용된 유기용매는 덕산약품공업(주)의 고순도 제품을 사용하였고 HPLC 용매는 Burdick & Jackson (Muskegon, USA)을 사용하였다. pancreatic lipase assay 에 사용한 tributylin은 Fluka (St.
- 본 실험에 사용한 생약재료인 백자인은 측백나무의 종자로서 대전의 일산약품(주)에서 구입하였다. 활성물질의 분리 및 확인에 사용된 silica gel (Kiesegel 60, paticle size : 0.
- 실험에 사용된 NIH-3T3 L1 세포(preadipocyte)는 ATCC 에서 분양받아 10% FBS, 50 U/ml penicillin, 50 /ml streptomycin 이 첨가된 Dulbecco's modified Eagle's me dium (DMEM)에 접종하여 37C에서 5% CO2 세포배양기에서 배양하였다. NIH-3T3 L1 세포를 phosphate buffered sal- ine (PBS) 용액으로 세척한 후, 5xl04 cells/ml을 12 well-flat plate에 배양하였다.
- 본 실험에 사용한 생약재료인 백자인은 측백나무의 종자로서 대전의 일산약품(주)에서 구입하였다. 활성물질의 분리 및 확인에 사용된 silica gel (Kiesegel 60, paticle size : 0.04 0 〜 0.063 nm)은 Merck사 (Darmstadt, Germany), ODS RP-18 (ODS-AZ 120Az S-150 )은 YMGGEL사 (Tokyo, Japan)로부터 구입하였고, TLC에 이용된 procoated silica gel plates 6OF254 (0.25mm and 0.5 mm in thickness) 와 ODS RP-18 F254S (25DC-Platten 5x10 cm)는 Merck사 (Darmstadt Germany)로부터 구입하였다. 각 분리단계에 이용된 유기용매는 덕산약품공업(주)의 고순도 제품을 사용하였고 HPLC 용매는 Burdick & Jackson (Muskegon, USA)을 사용하였다.
이론/모형
- Pancreatic lipase의 활성 및 저해능은 Bitou 등[3]의 방법에 따라 triolein으로부터 분리되는 oleic acid를 측정함으로써 결정하였다. 기질은 M NaO이 첨가된 0.
- 0, 반응온도 37C에서 30분간 반응시켰다. 효소반응 후 생성된 oleic acid의 정량은 Zapf 등[22]의 방법에 따라 결정하였다. 효소반응 후 반응용액 0.
성능/효과
- 2). Fig. 2에 나타난 바와 같이 활성물질 및 orlistat의 처리농도가 증가함에 따라 lipase에 저해효과도 증가함을 알 수 있었다. Porcine pan creatic lipase에 대한 저해효과는 TF-2보다 TF-1, TF-3가 다소 우수한 것으로 나타났으나, 대조구로 사용한 orlistat 보다는 다소 저해효과가 낮은 것으로 조사되었다.
- 2에 나타난 바와 같이 활성물질 및 orlistat의 처리농도가 증가함에 따라 lipase에 저해효과도 증가함을 알 수 있었다. Porcine pan creatic lipase에 대한 저해효과는 TF-2보다 TF-1, TF-3가 다소 우수한 것으로 나타났으나, 대조구로 사용한 orlistat 보다는 다소 저해효과가 낮은 것으로 조사되었다. 이 때 각 활성물질 TF-1Z TF-2Z TF-3 및 wlistat의 porcine pancreatic lipase에 대한 IC5o 값은 각각 44.
- 88%의 분화도를 나타내는 것으로 조사되었으므로 TF-2 및 orlistat 의 경우 지방세포 분화 저해정도가 우수함을 확인할 수 있었다. 따라서 활성물질 TF-2가 지방세포 분화의 지표로 사용되는 lipid droplet의 형성을 억제함으로써 지방세포 분화를 저해하는 효과도 가지고 있음을 확인할 수 있었다.
- 19%로 나타났다. 반면, TF-2를 처리한 실험구에서는 24.84%의 지방세포 분화도를 나타내었으며, orlistat를 처리한 실험구에서는 23.88%의 분화도를 나타내는 것으로 조사되었으므로 TF-2 및 orlistat 의 경우 지방세포 분화 저해정도가 우수함을 확인할 수 있었다. 따라서 활성물질 TF-2가 지방세포 분화의 지표로 사용되는 lipid droplet의 형성을 억제함으로써 지방세포 분화를 저해하는 효과도 가지고 있음을 확인할 수 있었다.
- Orlistat의 경우, Candida sp. 유래 lipase 나 porcine pancreatic lipase에 대해 상대적으로 강한 활성을 나타냈으며, 미생물에서 유래하는 lipase의 종류에 따라 제어 활성의 차이를 나타내지만, 선택적 제어활성은 크지 않은 것으로 판단된다 그러나 본 실험에서 선정한 대복피의 경우에서는 미생물유래 lipase보다는 porcine pancreatic lipase에 대하여 강한 저해활성을 나타냄으로써 선택적 제어효과가 있는 것으로 사료된다. 또한 복분자 추출물의 경우에서는 Chemobacterium sp.
- , Candida sp. 유래 lipase와 porcine pancreatic lipase에서 상대적으로 우수한 저해효과를 나타내었다. 이와 같은 결과를 근거로 본 실험에서는 li- pase에 대한 활성이 가장 우수한 것으로 판단되는 백자인을 대상으로 pancreatic lipase에 대한 저해활성 연구를 진행하였다.
- Pancreatic lipase에 대한 저해활성이 우수한 백자인으로 부터 클로로포름 용매 추출, 실리카겔컬럼 크로마토그라피, 세파덱스 LH-20 컬럼 크로마토그라피와 고속액 체크로마토그라피를 실시하여 pancreatic lipase에 대한 저해활성 물질로 TF-1, TF-2, TF-3를 분리하였다. 이들을 대상으로 porcine pancreatic lipase에 대한 저해효과를 측정한 결과, 활성물질 TF-1, TF-2, TF-3 및 orlistat의 porcine pancreatic lipase에 대한 ICW 값은 각각 44.7, 98.7, 46.1 및 27.6 g/ml인 것으로 나타났다. 활성물질 TF-2와 orlistat의 경우에는 10 /ml의 농도에서 NIH-3T3 "의 지방세포로의 분화에도 억제효과가 있음을 입증하였다.
- 6 g/ml이 었다. 이와 같은 결과로 보아 본 실험에서 탐색한 백자인 추출물 TF-L TF-2, TF-3은 비록 시판되고 있는 oHistat보다는 lipase에 대한 활성저해능을 다소 떨어지더라도 좀 더 순수하게 정제된 후에는 그 활성이 더욱 높아질 것으로 예상된다.
- NIH-3T3 L1 이 지방세포로 분화되는 정도의 측정은 지방세포 내 lipid droplet 형성정도로 측정하였다. 즉 지방세포 내 lipid droplet을 Oil red O 시약으로 염색하여 isopropanol로 용출시켜 510 nm에서 흡광도를 측정한 결과, Table 3에서 보는 바와 같이 TF-1, TF-3를 처리한 실험구에서는 대조구에 비해 지방세포 분화능이 각각 76.75, 60.19%로 나타났다. 반면, TF-2를 처리한 실험구에서는 24.
※ AI-Helper는 부적절한 답변을 할 수 있습니다.