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문제 정의
- 한편 실험 전반적인 경향을 볼 때 모려와 육울 탕이 혼합된 처방 (Sample Ⅲ)에서 항 스트레스와 지질대사의 조절이 우수하게 나타났다. 이는 모려를 이용한 건강기능 보조제의 발굴에 필요한 복합처방(육울 탕)의 선정에 예상된 목적을 달성한 것으로 본 연구의 목표를 달성함과 아울러 향후 기대 효과 목표 달성도 예상된다.
- 이는 모려를 이용한 건강기능 보조제의 발굴에 필요한 복합처방의 선정(육울탕)어〕 예상된 목적을 달성한 것으로, 본 연구의 목표를 달성함과 아울러 향후 기대 효과 목표 달성도 예상된다.
제안 방법
- , PK-6101)으로 실온에서 30분간 처리하였으며/ tumor necrosis factor (TNF)-q, inte괴eukin (IL)-ipz cyclooxygenase (COX)-1Z COX-2, nuclear factor (NF)-k Bp65, inhibitory (I)-kBq 항체 (Santa Cruz Biotechnology Inc)를 200:1로 희석하여 4℃ 습실에 16시간 동안 반응시켰다. PBS로 세척하고 biotinylated anti-rabbit IgG (Vector Lab., PK-6101)틀 실온에서 30분 동안 반응시켰으며 PBS로 세척 후 ABC kit (Vector Lab., PK-6101)에 실온에서 60분간 반응시켰다, DAB substrate kit (Vector Lab.z SK-4100)로 실온에서 5분간 발색시켰으며 상기 실험 방법 중 일차 항체 대신 10% BSA/PBS을 처리하고 동일한 과정으로 염색한 것을 대조군으로 삼았다.
- 투여한 대조군(Control)으로 하였다. 검액은 1일 1희 오전11 시에 사람 1일 복용량의 3배 농도로 흰쥐 체중에 비례(0.1 ml/kg)하여 경구투여하였으며, 구속된 12시간 동안은 절식시켰다. 검액은 구속 시작과 함께 투여하였다.
- 1 ml/kg)하여 경구투여하였으며, 구속된 12시간 동안은 절식시켰다. 검액은 구속 시작과 함께 투여하였다. sample 군은 모려군 (ostreae concha, Sample I), 육울탕군(yukwool-tang, Sample II), 육울탕+모려군(yukwool-tang add ostreae concha , Sample Ⅲ) 으로 나누었다.
- 구속 7일째 동물을 가볍게 ether 마취시킨 후 심장 천자하여 혈액을 채취하였으며 원심분리기 (IEC Centra-8R centrifuge international EQUIPMENT COMPANY Extraction apparatus 3 unitx500 ml, USA)로 2014 g로 25분간 원심분리하여 혈청을 분리한 후, 그 혈청을 실험에 사용하였다.
- 모려분을 이용한 한의학적 항 스트레스성 기능보조제 개발을 위하여 면역 관련 유전자의 변화가 발견되며, 정서적 스트레스의 대표적 방법인 구속 스트레스 방법으로, 7일간 야간에 12시간씩 구속하고, 모려, 육울 탕 그리고 육울 탕 가 모려를 각각 경구 투여한 후, 스트레스 반응의 주요 인자인 catecholamine과 지질 대사와 관련된 GOT, GPT, TG 및 LDH 함량의 변화를 살펴보았다.
- 본 실험에는 생화학 분석기 (COBAS MIRA, Roche, Germany), Gamma Counter(1470-Wizard Gamma Counter, Willacz Finland), 원심분리기 (IEC Centra-8R centrifuge international EQUIPMENT COMPANY Extraction apparatus 3 unitx500 ml, USA), 감압농축기 (Rotarapor REⅢ BUCHI SwitzeHahd)등을 사용하였다.
- 조직병리학적 관찰을 위하여 hematoxylin-eosin 및 periodic acid Schiff s (PAS)염색을 실시하였다. 비장내 백색 수질에 대한 형태학적 계측은 동맥주위임파초 (periaterial lymphatic sheath, PALS) 오I 비장 소절 (splenic node, SN)로 구별하여 현미 경하에서 micrometer로 짧은 직경을 측정하였다
- 이에 실험적으로 스트레스 부여 방법은 다양하지만, 전신적스트레스 뿐만 아니라, 감정적 스트레스 반응이 가장 잘 발현되는 구속 스트레스”渺咨25)를 흰쥐에 부여하고, 모려, 육울 탕 그리고 육울 탕 가 모려를 각각 경구 투여한 후, 혈중 catecholamine함량 Aspartate aminotrans£erase(AST; GOT), Alanine aminotransferase (ALT; GPT), Lactate Dehydrogenase (LDH) 활성 £ Triglyceride (TG) 함량, 비장에 미치는 병리조직화학적 관찰 및 염증관련 단백질에 대한 면역조직화학적 변화를 살펴보았다.
- 6 ㎛ 절편을 제작하였다. 조직병리학적 관찰을 위하여 hematoxylin-eosin 및 periodic acid Schiff s (PAS)염색을 실시하였다. 비장내 백색 수질에 대한 형태학적 계측은 동맥주위임파초 (periaterial lymphatic sheath, PALS) 오I 비장 소절 (splenic node, SN)로 구별하여 현미 경하에서 micrometer로 짧은 직경을 측정하였다
- 한편 실험적 스트레스 부여 방법은 주로 구속 스트레스, 통증자극, 저혈압 출혈, 한냉 노출, 광주기 등의 방법이 있으나3气 본 실험에서는 면역 관련 유전자의 변화가 발견되며, 정서적 스트레스의 대표적 방법인 구속스트레스를 이용하였으며33岡, 쥐의 활동이 야행성임을 감안하여 7일간 야간에 12시간씩 구속하고, 모려, 육울탕 그리고 육울 탕 가 모려를 각각 경구 투여한 후, 스트레스 반응의 주요 인자인 catecholamine과 지질 대사와 관련된 GOT, GPT, TG 및 LDH 함량의 변화를 살펴보았다.
- 혈청 중 ALT 측정은 자동 분석기기 (COBAS MIRA, Roche, Germany)로 Reitman-Frankel 법을 통하여 발생하는 적갈색의 흡광도 측정하고 표준혈청에 있어서도 같은 방법으로 반응시켜 작성한 검량선으로 부터 검체 중의 ALT를 측정하였다.
- 혈청 중 AST 측정은 자동 분석기기 (COBAS MIRA, Roche, Germany)로 Reitman-Frankel 법을 통하여 발생하는 적갈색의 흡광도 측정하고 표준혈청에 있어서도 같은 방법으로 반응시켜 작성한 검량선으로 부터 검체 중의 AST를 측정하였다.
- 혈청 중 LDH 측정은 자동 분석기기 (COBAS MIRA, Roche, Germany)로 LDH가 젖산을 산화, 피루빈산을 생성하고, 조효소인 NAD는 NADH로 환원되면서, 340nm에서의 흡광도가 증가하는데 이 흡광도 변화속도를 측정하는 것에 의하여 LDH의 활성 치를 구하고 표준혈청에 있어서도 같반응 시켜으로 반응시켜 작성한 검량선으로 부터 검체 중의 LDH 농도를 측정하였다.
- 혈청 중 Triglyceride 측정은 자동 분석기기 (COBAS MIRA, Roche, Germany) 로 유리 Glycerol 소거법 (GPO with Glycerol blank)을 통하여 반응물의 탁도를 광학적으로 측정하고 표준혈청에 있어서도 같은 방법으로 반응 시켜 작성한 검량선으로 부터 검체 중의 Triglyceride 농도를 측정하였다.
- 흰쥐 8마리를 1군으로 하여 아무 처치하지 않은 정상군 (Normal), 나무로 만든 구속 상자(5x20x5 cm)에 넣어 1일 12시간씩(오후 9시 ~다음날 오전 9시) 7일간 구속시키면서 검액을 경구 투여한 실험군(Sample), 7일간 구속시키면서 생리식염수를 경구 투여한 대조군(Control)으로 하였다. 검액은 1일 1희 오전11 시에 사람 1일 복용량의 3배 농도로 흰쥐 체중에 비례(0.
대상 데이터
- 본 실험에 사용한 약재는 시중에서 구입하여 엄선한 것을 사용하였으며, 육울탕 처방은《東醫寶鑑》에 수재된 내용에 叫 라 조제하였으며, 1첩의 처방내용과 분량은 Table 1과 같다.
- 실험동물은 체중 130 g 내외의 Sprague Dawly계 암컷 흰 주](대한실험동물센터, 한국)를 구입하여 고형사료(삼양 배합사료 실험동물용, 삼양유지사료, 한국)와 물을 충분히 공급하면서 실험실 환경(온도: 20±2 ℃Z 습도: 40~60 %, 명암: 12 시간 light/dark cycle)하에서 2주 적응 후 사용하였다.
데이터처리
- 성적은 평균치 土 표준오차로 나타내었으며, 평균치간의 유의성은 Studenfs T-test를 이용하여 검정하였고 p 값이 0.05 미만일 때 유의한 것으로 判定하였다.
성능/효과
- 염증관련 단백질에 대한 면역반응도 증가하였다. COX-1 및 I- KBa를 제외한 모든 면역반응이 증가하였으며 특히 IL-고의 면역반응이 가장 현저하였다. 이에 비해 Sample Iz Sample Ⅱ, Sample Ⅲ을 투여 하였을 때 대체로 면역반응이 감소하였으며 TNK-a에서는 Sample Ⅱ에 비해 Sample I을 처리하였을 때 더 감소하였다.
- 염증관련 단백질 반응을 보면 Normal에 비해 Control 의 적색수질에서 면역반응이 증가하였으며 특히 IL-1。의 면역반응이 가장 현저하였다. Sample I, Sample Ⅱ, Sample Ⅲ을 투여하였을 때 면역반응이 감소하며 TNK-0의 반응은 특히 Sample I 을 처리하였을 때 현저하였다';
- 비장에 대한 병리 조직학적 소견을 보면 Normal에 비해 Control에서는 적색수질에 비해 백색 수질의 분포가 줄어들었고, 동맥주위 임파초와 비장 소절 직경이 현저히 감소하였으나 Sample I, Sample Ⅱ, Sample Ⅲ 처리 군에서 Control에 비해 증가하였다. 염증관련 단백질 반응을 보면 Normal에 비해 Control 의 적색수질에서 면역반응이 증가하였으며 특히 IL-1。의 면역반응이 가장 현저하였다.
- 실험 전반적인 경향을 볼 仰 모려와 육울 탕이 혼합된 처방 (Sample Ⅲ)에서 항 스트레스와 지질대사의 조절이 우수하게 나타났다. 이는 모려를 이용한 건강기능 보조제의 발굴에 필요한 복합처방의 선정(육울탕)어〕 예상된 목적을 달성한 것으로, 본 연구의 목표를 달성함과 아울러 향후 기대 효과 목표 달성도 예상된다.
- Sample Ⅱ, Sample HI에서 대조군에 다소 증가하였다. 또한 Control 비장의 적색 수질에서 PAS 양성 반응 세포의 증가와 더불어 염증관련 단백질에 대한 면역반응도 증가하였으며 COX-1 및 MBa를 제외한 모든 면역반응이 증가하였으며 특히 IL-1。의 면역반응이 가장 현저하였으나 Sample I, Sample Ⅱ, Sample Ⅲ 처리에서는 Normal과 유사한 반응을 보였으며 특히 TNF-q는 Sample I을 처리했을 때 현저하였다.
- 이상의 결과를 볼 때 지질 대사에서의 변화도 모려의 성분이 함유된 Sample I과 Sample Ⅲ에서 주로 그 효과가 나타난 것으로 보아 모려가 항 스트레스에 효능이 있음을 알 수 있었다. 한편 실험 전반적인 경향을 볼 때 모려와 육울 탕이 혼합된 처방 (Sample Ⅲ)에서 항 스트레스와 지질대사의 조절이 우수하게 나타났다.
- 이상의 결과에서 스트레스 반응의 주요 지표로 삼는 norepineprine, dopamine 함량의 변화에 모려의 성분이 함유된 Sample I과 Sample Ⅲ에서 그 효과가 나타난 것으로 보아 모려가 항스트레스 효과에 유효한 것으로 생각되육울 탕은울탕은 주로 epinephrine의 함량 변화에 작용하여 물질대사를 자극하며, 모려도 유사한 효과가 있음을 알 수 있었다.
- 전형적인 비장의 조직학적 소견을 보이는 Normal에 비해 Control에서는 적색수칠에 비해 백색 수질의 분포가 줄어들었다. 또한 적색수질에서 혈액 충만과 더불어 PAS 양성 반응을 보이는 세포가 다수 관찰되었다.
- 한편 실험 전반적인 경향을 볼 때 모려와 육울 탕이 혼합된 처방 (Sample Ⅲ)에서 항 스트레스와 지질대사의 조절이 우수하게 나타났다. 이는 모려를 이용한 건강기능 보조제의 발굴에 필요한 복합처방(육울 탕)의 선정에 예상된 목적을 달성한 것으로 본 연구의 목표를 달성함과 아울러 향후 기대 효과 목표 달성도 예상된다.
- 육울 탕은 주로 epinephrine의 함량 변화에 작용하여 물질대사를 자극하며, 모려도 유사한 효과가 있음을 알 수 있었다. 한편 지질 대사에서의 변화도 모려의 성분이 함유된 Sample I과 Sample Ⅲ에서 주로 그 효과가 나타난 것으로 보아모려가 항스트레스에 효능이 있음을 알 수 있었다.
- 혈청 중 Alanine aminotransferase의 함량은 Normal에서 32.50±0.89(U/l)이었으며, Controle- 48.67±L94(U/1)로 Normal 에 비하여 유의한(pVO.OOl) 증가를 보였으며 Sample I에서는 27.17±Q54(U/1)로 Control에 비하여 유의한(pvQOOl) 감소를 나타내었고 Sample II에서는 36.33±Q88(U/1)로 Control에 비하 여유의 한 (pvO.OOl) 감소를 나타내었으며 Sample Ⅲ 에서는 33.50±0.34(U/l)로 Control에 비하여 유의한(pvO.OOl) 감소를 나타내었다(Table 6).
- 혈청 중 Aspartate aminotransferase의 함량은 Normal에서 107.17±2.15(U/i)O] 었으며, Controle 112.50±2.58(U/1)로 Normal에 비하여 유의한(p<0.05) 증가를 보였으며 Sample I에서는 115.50±2.83(U/l)로 Cor也位에 비하여 증가하였으나 유의성은 나타나지 않았으며 Sample II에서는 120.67±2.68(U/l)로 Control 에 비하여 유의한(p<0.05) 증가를 하였으며 Sample Ⅲ에서는 114.17±2.87(U/1)로 Control에 비하여 증가하였으나 유의성은 나타나지 않았다(Table 5).
- 혈청 중 Dopamine의 함량은 Nomial에서 114.12±13.23(pg/ 做)이었으며/ Controle 207.92±32.80(pg/mE)로 Normal에 비하 여유의 한(pv0.05) 증가를 보였으며 Sample I에서는 60.59±15.13 (p응/戒)로 Control에 비하여 유의한(p<0.005) 감소를 나타내었고 Sample II에서는 367.63±8L50(pg/mE)로 Control에 비하여 증가하였으나 유의성은 나태내지 않았으며 Sample 田에서는 39.84±16.83(pg/诫)로 Control에 비하여 유의한(pvO.OOl) 감소를 나타내었다(Table 4).
- 혈청 중 Epinephrine의 함량은 Normal에서 209.80±7.70(pg/ 戒)이었으며, Controle 686.33±17.92(pg/戒)로 Normal에 비하 여유의 한(pvO.001) 증가를 보였으며 Sample I에서는 311.89+29.10 (pg/戒)로 Control에 비하여 유의한(p<0.001) 감소를 나타내었고 Sample II에서는 480.71±36.62(pg/祉)로 Control에 비하여 유의한(pvO. OOl) 감소를 나타내었으며 Sample Ⅲ에서는 18349±22.13 (pg/n盼로 Control에 비하여 유의한(pvO.OOl) 감소를 나타내었다 (Table 2).
- 혈청 중 GPT 함량은 Normal에서 32.50±0.89(U/l)이었으며, Controle 48.67±1.94(U/1)로 Normal에 비하여 유의한(pO.OOl) 증가를 보였으며 Sample I, Sample IIZ Sample Ⅲ에서 각각 27J7±0.54(U/l), 36.33±0.88(U/l), 33.50±0.34(U/l)로 Control에 비하여 유의한(pvO.OOl) 감소를 나타내었으며 Sample I이 가장 효과가 좋은 것으로 나타났다(Table 6).
- 혈청 중 LDH 함량은 Normal에서 829.50±32.87(U/l)이었으며, Controle 999.50±38.60(U/l)로 Normal에 비하여 유의한 (p<0.05) 증가를 보였으며 Sample Ⅱ, Sample Ⅲ에서 각각 730.50±61.55(U/l)z 726.50±39.88(U/l)로 Controlofl 비하여 유의한 (p<0005, p<0.001) 감소를 나타내었으며 Sample Ⅲ가 가장 효과가 좋은 것으로 나타났다(Table 8).
- 혈청 중 Lactate Dehydrogenase의 함량은 Normal에서 829.50±32.87(U/l) 이었으며, Controle 999.50±38.60(U/l) 로 Normal에 비하여 유의한(p<0.05) 증가를 보였으며 Sample I에서는 883.00±56.92(U/l)로 Contr이에 비하여 감소하였으나 유의성은 나타나지 않았으며 Sample II에서는 730.50±61.55(U/l)로 Control에 비하여 유의한(pV0.005) 감소를 하였으며 Sample Ⅲ 에서는 726.50±39.88(U/l)로 Control에 비하여 유의한(p<0.001) 감소를 하였다(Table 8).
- 혈청 중 Norepineprine의 함량은 Normal에서 1534, 11±156.32 (pg/1戒)이었으며, Controle 3]77.96±89.72(pg/mE)로 Normal에 비하여 유의한 (pvO.OOl) 증가를 보였으며 Sample I에서는 1217.78±73.92(pg/m〃로 Control에 비하여 유의한(pO.OOl) 감소를 나타내었고 Sampl 은 II에서는 1932.42±153.24(pg/i此)로 Contr이에 비하여 유의한(p<0.001) 감소를 나타내었으며 Sample Ⅲ 에서는 1383.80±69.83(pg/n的로 Control에 비하여 유의한 (p<0.001) 감소를 나타내었다(Table 3).
- 혈청 중 TG 함량은 Normal에서 50.42±L06(mg/dl)이었으며, Controle 8Z83±3.98(mg/dl)로 Normal에 비하여 유의한 (p<0.001) 증가를 보였으며 Sample I, Sample IIZ Sample Ⅲ에서 각각 52.70±1.55(mg/dl), 50.03±3.82(mg/dl)z 47.93±2.98(mg/dl) 로 Control에 비하여 유의한(pvO.OOl) 감소를 나타내었으며, Sample Ⅲ가 가장 효과가 좋은 것으로 나타났다(Table 7).
- 혈청 중 Triglyceride의 함량은 Normal에서 50.42+1.06 (mg/dl)이었으며, Controle 82.83±3.98(mg/dl)로 Normal에 비하여 유의한 (pvO.OOl) 증가를 보였으며 Sample I에서는 52.70±1.55(mg/dl)로 Control에 비하여 유의한(p<0.001) 감소를 나타내었고 Sample II에서는 50.03±3.82(mg/dl)로 Control에 비하여 유의한(pvO.OOl) 감소를 나타내었으며 Sample Ⅲ에서는 47.93±2.98(mg/dl)로 Contr이에 비하여 유의한(pO.OOl) 감소를 나타내었다(Table 7).
- 혈청 중 dopamine의 함량은 Normal에서 114.12±13.23(pg/ 圳)이었으며, Controle 207.92±32.80(pg/畝)로 Normal에 비하 여유의 한(pv0.05) 증가를 보였으며 Sample I, Sample Ⅲ에서 각각 60.59±15.13(pg/畝), 39.84±16.83(pg/诫)로 Control에 비하여 유의한(p<〔).005, p<0.001) 감소를 나타내었으며 Sample HI가 가장 효과가 좋은 것으로 나타났다(Table 4).
- 혈청 중 epinephrine의 함량은 Normal에서 209.80+7.70(pg/ m2)이었으며, Controle 686.33±17.92(pg/mE)로 Normal에 비하 여유의 한(pvO.OOl) 증가를 보였으며 Sample I, Sample II 및 Sample Ⅲ에서 각각 311.89±29.10(pg/m£), 480.71 ±36.62(pg/me 183.49± 22.13(pg/i旭)로 Control에 비하여 유의한(pvO.OOl) 감소를 나타내었으며 Sample Ⅲ가 가장 효과가 좋은 것으로 나타났다(Table 2).
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