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문제 정의
- 니코틴에 의한 보행성 활동 변화에 한약들이 어떤 역할을 하고 있는지에 대해서는 현재까지 거의 알려져 있지 않다, 1 다라서 본 연구에서는 니코틴의 반복투여로 유도된 니코틴 약물중독모델에서 한약이 행동적으로 보행성 활동량에 미치는 효과와 중추신경 화학적 변화에 미치는 효과를 검토한다. 이로써 니코틴중독의 초기 및 확립 단계어】 적합한 새로운 한방치료약물 또는 예방제로서의 효능을 살펴보고자 한다.
- 약물중독의 주요 표적인 도파민계와 니코틴의 상호작용에 관한 이해를 넓히기 위해서는 in vitro 방법보다 신경전달이 직접적으로 이루어지는 세포외액에서 신경전달물질을 측정할 수 있는 이러한 in vivo 방법들이 이용되어야 한다. 이 연구에서는 이 연구에 가장 적합하고 유력한 방법인 미세투석법을 이용하여 살아있는 동물의 뇌에서 니코틴중독의 신경 화학적 기전을 규명하고자 한다. 또한 중추신경계에서 한약이 어떤 방식으로 니코틴 작용을 매개하는지 밝혀냄으로써, 니코틴 중독의 차단과 치료약물 또는 금연(보조) 약물로써 한방치료의 효용가치를 높이는데 기여 할 것이다.
- 변화에 미치는 효과를 검토한다. 이로써 니코틴중독의 초기 및 확립 단계어】 적합한 새로운 한방치료약물 또는 예방제로서의 효능을 살펴보고자 한다.
제안 방법
- 2. 니코틴 반복 투여에 의한 측핵 내 DA 함량변화와 한약의 효과 니코틴의 반복투여가 DA 유리에 미치는 한약의 효과를 알아보기 위하여 실험동물을 7일간 하루에 두 번씩 nicotine hydrogen tartrate (0.4 ㎎/㎏, s.c., free base)를 투여한 다음 3일 동안의 철회기간을 두고 약물강화효과를 유도하기 위하여 산조인 100㎎/㎏을 1일1회 경구투여 하였다. 니코틴 민감화 발달 현상에 대한 대조군으로서 saline(l㎎/㎏/ s.
- )을투여한다. 3일 동안의 약물 중단기간을 거쳐 Day 11에 약물 challenge한 후 활동량 변화를 측정하여 평가한다. 약물 투여 전 60분 동안 기저 수준의 자발적 활동량을 측정하며, 약물투여 후 120분 동안 활동량 변화를 측정한다.
- ) 처치군을 두어 동일한 방법으로 투여하였다. 3일 철회기간 다음날 산조인 100㎎/㎏을 경구투여하고 5시간이 지난 다음 니코틴(3mM)을 국소투여 하였을 때 실험동물의 측핵 내 DA 유리의 함량 변화를 관찰하였다. Saline 처치군(n=7)에서는 basal DA 농도(194±4.
- 50㎎/㎏의 sodium pentobarbital을 복강 주사하여 마취시킨 다음에 stereotaxic 수술대에 고정시키고, microdialysis probe 를 삽입할 부위의 두피를 절개한 뒤 현미경을 이용하여 lamda와 bregma를 찾고, coordinate는 nucleus accumbens shell(AP 1.7, ML 0.8, DL -6.0)의 위치에 guide cannula를 설치한 후 미세나사와 치과용 시멘트를 이용하여 guide cannula를 고정시킨다. 수술을 마친 실험군은 일주일간의 회복시기를 거친 후 microdialysis system에 연결시켰다.
- 높이가 각각 43x43x45 인 검은색 무광택 아크릴 상자에서 실험동물의 움직임을 추적하였다. 8개의 상자에 약 2.5 meter 위에 설치된 디지털 카메라에서 얻어진 화상을 컴퓨터에 전달하여, 검은 배경에 흰색 피사체의 대조 원리를 이용하여 흰색 실험동물 상(image)의 중심점을 초당 수 번을 인식하는 방식으로 실험동물의 움직임을 따라 추적하여 궤적을 데이터화하고 그 거리를 정량하였다.
- 7g의 NaCl을 증류수 에 녹여서 만들었으며 생리식염수와 formalin buffer# 각각 4/ 짜리 증류수 통에 넣어 높은 위치에 설치한 뒤 tube를 통해 관류할 수 있도록 하였다. Microdialysis 분석을 마친 흰쥐의 복부에 sodium pentobarbital을 80㎎/㎏을 복강주사하여 마취시킨 뒤 수술대에 고정하여 흉곽을 열고 descending aorta를 결찰하고, 심첨부위에 천자 하여 먼저 생리식염수를 홀려서 혈액을 씻어낸다. 그리고 formalin buffer를 충분히 관류한 후 두개골로부터 뇌를 분리하여 formalin buffer에 저장하여 냉장 보관하였다.
- Microdialysis 실험이 끝난 후에는 nucleus accumbens내의 microdialysis probe의 위치확인을 위한 조직학적 검증을 위하여 우선 formalin buffer를 显 formalin(37%)z 900叫증류수, 6.5g Na2HPC)4(dibasic), 4g NaHzPOJHQImonobasic)을 혼합하여 만들었다 생리식염수는 8.7g의 NaCl을 증류수 에 녹여서 만들었으며 생리식염수와 formalin buffer# 각각 4/ 짜리 증류수 통에 넣어 높은 위치에 설치한 뒤 tube를 통해 관류할 수 있도록 하였다. Microdialysis 분석을 마친 흰쥐의 복부에 sodium pentobarbital을 80㎎/㎏을 복강주사하여 마취시킨 뒤 수술대에 고정하여 흉곽을 열고 descending aorta를 결찰하고, 심첨부위에 천자 하여 먼저 생리식염수를 홀려서 혈액을 씻어낸다.
- Rat가 bowl cage 속에서 자유로이 움직이는 상태에서 microdialysis system을 통해 20분 간격으로 probe 끝의 반투과성 막의 확산원리에 의한 세포 외액을 취하여 -70℃의 deep freezere] 저장한 뒤 분석하였다.
- 각 약재 600g을 정확히 잰 다음 대웅약탕기로 3시간 전탕하고 그 여액을 감압농축한 후 동결건조(-66C, lOmmHg)시켜 試料 粉末을 획득하였다. 건조 수율은 23%였다.
- 니코틴 만성 투여로 인한 약물강화와 의존성에 대한 한약의 효과를 연구하기 위하여 만성 니코틴투여 후 행동적 민감화에 의한 보행성 활동량을 측정하고 nucleus accumbens shell에서 dopamine 및 그 대사체 물질의 함량변화를 관찰함으로써 산조인 이 도파민유리와 행동에 미치는 효과를 측정하여 다음과 같은 결론을 얻었다.
- , free base)를 투여한 다음 3일 동안의 철회기간을 두고 약물강화효과를 유도하기 위하여 산조인 100㎎/㎏을 1일1회 경구투여 하였다. 니코틴 민감화 발달 현상에 대한 대조군으로서 saline(l㎎/㎏/ s.c.) 처치군을 두어 동일한 방법으로 투여하였다. 3일 철회기간 다음날 산조인 100㎎/㎏을 경구투여하고 5시간이 지난 다음 니코틴(3mM)을 국소투여 하였을 때 실험동물의 측핵 내 DA 유리의 함량 변화를 관찰하였다.
- 동물을 사육장에서 외부 소음이 차단된 실험실로 옮겨 각각 무게를 측정한 후 8개의 활동량 측정상자에 개별적으로 넣었다. 상자 내에서 60분간의 적응기간(adaption)을 거친 후, 다시 60 분간의 기저활동량(bas이ine)을 측정하였다.
- 넣었다. 상자 내에서 60분간의 적응기간(adaption)을 거친 후, 다시 60 분간의 기저활동량(bas이ine)을 측정하였다. 측정이 끝난 후 試料 (100㎎/㎏)를 경구투여하고 60분 후 니코틴(0.
- 0)의 위치에 guide cannula를 설치한 후 미세나사와 치과용 시멘트를 이용하여 guide cannula를 고정시킨다. 수술을 마친 실험군은 일주일간의 회복시기를 거친 후 microdialysis system에 연결시켰다.
- 실험 1에서는 실험동물에게 하루에 두번씩 7일 동안 연속적으로 saline을 투여하고, 실험 2에서는 니코틴(0.4 ㎎/㎏, s.c.)을투여한다. 3일 동안의 약물 중단기간을 거쳐 Day 11에 약물 challenge한 후 활동량 변화를 측정하여 평가한다.
- 약물 투여 전 60분 동안 기저 수준의 자발적 활동량을 측정하며, 약물투여 후 120분 동안 활동량 변화를 측정한다. 실험 3에서는 challenge 60 분전에 산조인(100㎎/㎏)을 경구투여하고 니코틴을 투여한 후 행동 변화 정도를 측정하였다.
- 실험동물의 활동량을 정량화하기 위하여, 본 연구에서는 Ethovision(Noldusy Netherland)을 이용하여 보행성 활동량을 측정하였다. 크기가 가로.
- 실험은 하루에 두 번씩 7일 동안 연속적으로 nicotine hydrogen tartrate(0.4㎎/㎏z s.c.; Sigam, St. Louis, MO)를 처치하는 민감화 발달단계 (sensitization phase)와 3일 동안 니코틴을 철회하는 약물철회단계(withdrawal phase), 그리고 약물 철회 기간이 끝난 다음날 다시 동일 용량의 니코틴을 한번 처치하는 검사단겨】(testing phase)로 구성되었다. 한편 니코틴의 반복적인 처치에 의한 활동량의 점진적인 증가로 표현되는 행동적 민감화 현상이 일어나는지 확인하기 위하여 통제군은 생리식염수 (lml/kg, sc)만을 반복적으로 투여하였다.
- 3일 동안의 약물 중단기간을 거쳐 Day 11에 약물 challenge한 후 활동량 변화를 측정하여 평가한다. 약물 투여 전 60분 동안 기저 수준의 자발적 활동량을 측정하며, 약물투여 후 120분 동안 활동량 변화를 측정한다. 실험 3에서는 challenge 60 분전에 산조인(100㎎/㎏)을 경구투여하고 니코틴을 투여한 후 행동 변화 정도를 측정하였다.
- 일주일간의 회복시기가 지난 후, microdialysis probe용 guide cannula가 설치된 rat를 microdialysis system에 연결하고, 미세투석법을 위해 CMA/11, 14/02 microdialysis probe(shaft length : 14mm, dimension : 024x2mm)를 guide cannula를 통하여 삽입한다. Microdialysis injection pump(Harvard Apparatus 22와 11)를 이용하여 flow rate 1.
- 상자 내에서 60분간의 적응기간(adaption)을 거친 후, 다시 60 분간의 기저활동량(bas이ine)을 측정하였다. 측정이 끝난 후 試料 (100㎎/㎏)를 경구투여하고 60분 후 니코틴(0.4㎎/㎏, s.c.)을투여한 다음 60분간의 처치 후 활동량(after treatment;ATM)을측정하였다.
- 따라서 산조인이 유의성 있게 도파민 억제효과를 갖는다는 것을 관찰할 수 있었다. 한편 DOPACe 40분과 80분 시점에서 dopamine과 역전된 관계를 보이고 있어서 이를 좌증한다. 하지만 HVA는 실험군별로 유의성 있는 차이를 보이지 않고 있어서 역전관계를 판단하기는 어렵다.
- Louis, MO)를 처치하는 민감화 발달단계 (sensitization phase)와 3일 동안 니코틴을 철회하는 약물철회단계(withdrawal phase), 그리고 약물 철회 기간이 끝난 다음날 다시 동일 용량의 니코틴을 한번 처치하는 검사단겨】(testing phase)로 구성되었다. 한편 니코틴의 반복적인 처치에 의한 활동량의 점진적인 증가로 표현되는 행동적 민감화 현상이 일어나는지 확인하기 위하여 통제군은 생리식염수 (lml/kg, sc)만을 반복적으로 투여하였다.
대상 데이터
- 酸棗仁 중국산 표준품을 부산시내 건재상에서 구입하고 엄선하여 사용하였으며 니코틴(Sigma)은 표준품을 사용하였다. 각 약재 600g을 정확히 잰 다음 대웅약탕기로 3시간 전탕하고 그 여액을 감압농축한 후 동결건조(-66C, lOmmHg)시켜 試料 粉末을 획득하였다.
- 세로.높이가 각각 43x43x45 인 검은색 무광택 아크릴 상자에서 실험동물의 움직임을 추적하였다. 8개의 상자에 약 2.
- 실험동물은 Sprague-Dawley 웅성 rat(250~260g)를 사용하여 12시간 조명주기 조건하에서 먹이와 식수는 자유롭게 섭취토록 하였으며, 실험 시작 전 2~3일간 적응시킨 후 실험에 사용하였다. 50㎎/㎏의 sodium pentobarbital을 복강 주사하여 마취시킨 다음에 stereotaxic 수술대에 고정시키고, microdialysis probe 를 삽입할 부위의 두피를 절개한 뒤 현미경을 이용하여 lamda와 bregma를 찾고, coordinate는 nucleus accumbens shell(AP 1.
- 증상은 담배 갈망, 긴장, 불안정성, 불안, 주의집중장애, 두통, 졸음, 수면장애, 소화기장애, 易怒, 맥박감소, 혈압저하, 체중증가 등이다. 한방에서는<金匱要略 .
데이터처리
- Rats were pretreated with saline(Acute nicotine n=6) or nicotine(repeated nicotine n=6) or (repeated Zizyphus jujuba n=10) twice daily 11. Data were analyzed by repeated ANOVA and followed by post hoc Turkey test. ##P<0.
- Rats were pretreated with saline(Acute nicotine n=6) or nicotine(repeated nicotine n=6) or (repeated Zizyphus jujuba n=10) twice daily 11. Data were analyzed by repeated ANOVA and followed by post hoc Turkey test. ##P<0.
- 모든 실험성적은 니코틴 처리전 세 개의 기저치의 평균값에 대한 백분율로 표시하였고 통계적 유의성은 SPSS program(version 11.01)5] one-way ANOVA로 검정하여 p값이 0.05이하인 경우에 유의한 것으로 인정하였다.
성능/효과
- 니코틴 중독을 유발하기 위해 7일간 하루에 2번씩 0.4㎎/㎏의 니코틴을 피하주사한 생리식염수 처치군의 한 시간 보행성 활동량과 니코틴 처치군의 활동량을 비교해 보았을 때 4014H35.3 까지 증가하였다. 그러나 산조인을 투여한 군은 3265.
- 4%로 유의하게 억제되었다. 따라서 산조인이 유의성 있게 도파민 억제효과를 갖는다는 것을 관찰할 수 있었다. 한편 DOPACe 40분과 80분 시점에서 dopamine과 역전된 관계를 보이고 있어서 이를 좌증한다.
- 하지만 HVA는 실험군별로 유의성 있는 차이를 보이지 않고 있어서 역전관계를 판단하기는 어렵다. 따라서 이상의 결과로 미루어 볼 때 산조인 추출물은 측핵에서의 dopamine 유리를 감소시킴으로써 동물의 locomotor activity를 감소시키고 민감화현상을 억제하는 효능이 있음을 알 수 있었다.
- 또한 3일 철회 후 니코틴군에서 challenge하여 도파민 유리를 측정한 결과 basal state에 비하여 40분에 704.1 ±134.4%로 현저히 증가하였다 그러나, 산조인을 투여한 결과 dopamine상승이 280.。±44.
- 01) 보행성 활동량이 감소된 것으로 나타났다. 또한 dopamine의 nucleus accumbens에서의 유리정도를 측정한 결과 역시 산조인 투여군에서 유의성있게(p<0.01) 감소하였다. 이것은 니코틴에 의해 유발되었던 동물의 민감화현상과 탐닉현상이 감소된 것으로 해석되는데 dopamine의 유리량 정도와 일치함으로써 dopamineO] 매개역할을 하였음을 알 수 있다.
- 4%까지 증가하였다. 산조인군 (n=6)은28d0±44.4% 증가하여 대조군에 비하여 DA 유리가 유의하게 억제되었다.
- 우선 locomotor activity에서 산조인 투여군은 유의성있게 (p<0.01) 보행성 활동량이 감소된 것으로 나타났다. 또한 dopamine의 nucleus accumbens에서의 유리정도를 측정한 결과 역시 산조인 투여군에서 유의성있게(p<0.
후속연구
- 이 연구에서는 이 연구에 가장 적합하고 유력한 방법인 미세투석법을 이용하여 살아있는 동물의 뇌에서 니코틴중독의 신경 화학적 기전을 규명하고자 한다. 또한 중추신경계에서 한약이 어떤 방식으로 니코틴 작용을 매개하는지 밝혀냄으로써, 니코틴 중독의 차단과 치료약물 또는 금연(보조) 약물로써 한방치료의 효용가치를 높이는데 기여 할 것이다.
- 이로써 산조인이 40분대에 측핵내 도파민 유리를 억제하여 만성 니코틴 투여에 의한 약물강화작용 민감화 효과를 억제함으로써 니코틴 금단증상과 중독의 치료방안으로 모색될 수 있으리라 생각된다.
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