The purpose of this study is to examine the cytotoxicity of species of Angelica (Angelicas Radix; the root of Angelica gigas Nakai, A. sinensis (Oliv.) Diels, and A. acutiloba Kitag.) on HepG2 cells. The water extracts of roots of Angelica gigas (WAG), A. sinensis (WAS), and A. acutiloba (WAA) were ...
The purpose of this study is to examine the cytotoxicity of species of Angelica (Angelicas Radix; the root of Angelica gigas Nakai, A. sinensis (Oliv.) Diels, and A. acutiloba Kitag.) on HepG2 cells. The water extracts of roots of Angelica gigas (WAG), A. sinensis (WAS), and A. acutiloba (WAA) were studied for HepG2 cell viability by a modified MTT assay in the concentrations of 5, 10, 50, 100, 250, 500 ug/ml for 24, 48, 72 h. WAG and WAS did not reduced the cell viability significantly. But WAA reduced the cell viability in the concentration of 500 ug/ml for 24 h (85.45%), 48 h (75.01%). In conclusion, WAG and WAS have not the significant cytotoxicity on HepG2 cells in the suitable dose.
The purpose of this study is to examine the cytotoxicity of species of Angelica (Angelicas Radix; the root of Angelica gigas Nakai, A. sinensis (Oliv.) Diels, and A. acutiloba Kitag.) on HepG2 cells. The water extracts of roots of Angelica gigas (WAG), A. sinensis (WAS), and A. acutiloba (WAA) were studied for HepG2 cell viability by a modified MTT assay in the concentrations of 5, 10, 50, 100, 250, 500 ug/ml for 24, 48, 72 h. WAG and WAS did not reduced the cell viability significantly. But WAA reduced the cell viability in the concentration of 500 ug/ml for 24 h (85.45%), 48 h (75.01%). In conclusion, WAG and WAS have not the significant cytotoxicity on HepG2 cells in the suitable dose.
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문제 정의
본 연구에서는 위와 같이 한의학의 치료 약물로서 중요한 위치를 차지하고 있는 當歸에 대한 간세포 독성을 알아보기 위하여 한국.중국.
이와 같이 血病의 主藥인 當歸가 인체에 흡수되었을 때 나타날 수 있는 간독성 (肝毒性) 유발 여부 연구를 위해 한국.중국.
중국.일본 當歸의 물 추출물로 세포 독성 유발 실험을 실시하여 유의한 결과를 얻었기에 이에 보고하는 바이다.
제안 방법
96 well plate에 1* x10 cells/well의 cel을 100 成씩 넣고 37℃, 5% CO2 incubator에서 24시간동안 배양한 후 배지를 버리고 배양세포 표면을 phosphate buffered saline (PBS) 용액으로 씻어주었다. 같은 양의 배지와 PBS에 녹인 시료 5, 10, 50, 100, 250, 500 ug/mL을 각 well에 처리하고 24, 48, 72시간 동안 배양하였다. 배양이 끝나기 4시간 전에 PBS에 녹인 5 mg/mL MTT (Sigma, USA)를 20 以씩 각 well에 처리한 후 알루미늄호일로 차광시킨 후 나머지 시간 동안 같은 조건에서 배양하였다.
중국.일본 當歸를 각 50g씩 정확하게 중량을 측정하여 환류 추출기에 1차 증류수 LOOOml와 함께 넣은 뒤 탕액이 끓는 시점으로부터 2시간동안 가열, 추출하였다. 추출액을 filter paper 루 감압 여과한 뒤, 여과액을 rotary vacuum evaporatoi# 이용하여 농축하였다.
한의학에서 중요한 치료 약물로 사용되고 있는 當歸의 간세포 독성을 알아보기 위하여 한국 當歸 물 추출물 (WAG), 중국 當歸 물 추출물 (WAS), 일본 當歸 물 추출물 (WAA)로 처리한 HepG2 cells의 세포생존율을 측정한 결과 다음과 같은 결론을 얻었다.
대상 데이터
각 시약의 품질은 분석용 등급 이상의 것으로 하여 사용하였다. 본 실험에 사용된 기기는 rotary vacuum evaporator (Eyela, Japan), freeze dryer (Eyela, Japan), deep freezer (Revco, USA), microplate spectrophotometer (Molecular Devices, USA), CO2 incubator (Sanyo, Japan) 등이다.
본 실험에 사용된 시약 중 Tetrazolium salt 3, [4, 5-dimethylthiazol-2-yl]-2, 5-dyphenyl tetrazolium bromide (MTT)와 Dimethyl Sulfoxide (DMSO)는 Sigma사로부터 구입하여 사용하였다. 각 시약의 품질은 분석용 등급 이상의 것으로 하여 사용하였다.
실험에 사용된 간조직 세포는 HepG2 (human hepatoma cell line)로서 한국 세포주 은행 (KCLB, Korea)에서 구입하였다.
acutiloba Ki tag. 의 건조된 뿌리부분으로서 서울특별시 동대문구 제기동 경동약령시장에 소재한 원광약업사를 통하여 구입하여 경희대학교 한의과대학 처방제형학교실에서 외부형태를 비교 조사하였으며, 일부는 경희대학교 한의과대학 처방제형 학교실에 보관하였다.
데이터처리
실험성적은 평균치 土 표준오차 (Mean 士 S.E.)로 나타내었으며, 대조군과 각 실험군과의 평균의 차이는 ANOVA test로 분석하여 p< 0.05일 때 통계적으로 유의한 것으로 판정하였다.
이론/모형
중국.일본 當歸가 HepG2 cells에 나타내는 세포독성유발 효과를 알아보기 위하여 Mosmann2 * * 5), Kotnik") 등의 방법을 응용하였다. 96 well plate에 1* x10 cells/well의 cel을 100 成씩 넣고 37℃, 5% CO2 incubator에서 24시간동안 배양한 후 배지를 버리고 배양세포 표면을 phosphate buffered saline (PBS) 용액으로 씻어주었다.
성능/효과
WAS를 처리한 HepG2 cells의 세포 생존율 감소를 확인하기 위해 MTT assay를 수행한 결과 처리농도 (5, 10, 50, 100, 250, 500 ug/ml)와 처리 시간 (24, 48, 72시간) 어〕관계없이 유의한 감소는 나타나지 않았다. WAA를 처리한 HepG2 cells의 세포생존율 감소를 확인하기 위해 MTT assay 를 수행한 결과 500ug/ml의 농도로 24, 48시간 동안 처리한 군에서 정상군에 비해 각각 85.45%, 75.01%로 유의한 감소를 나타내었다 (p<0.05).
WAA의 HepG2 cells에 대한 세포 독성을 측정하기 위하여 시료 5, 10, 50, 100, 250, 500 ug/ml의 범위에 대하여 24, 48, 72 시간동안 배양한 후 세포 생존율을 측정한 결과 500 ug/m의 농도로 24, 48시간 동안 처리한 군이 대조군보다 각각 85.45%, 75.01%로 유의하게 (p < 0.05) 감소하였다 (Fig. 3).
WAG를 처리한 HepG2 cells의 세포 생존율 감소를 확인하기 위해 MTT assay를 수행한 결과 처리 농도 (5, 10, 50, 100, 250, 500 u음/ml)와 처리 시간 (24, 48, 72시간)어〕관계없이 유의한 감소는 나타나지 않았다. WAS를 처리한 HepG2 cells의 세포 생존율 감소를 확인하기 위해 MTT assay를 수행한 결과 처리농도 (5, 10, 50, 100, 250, 500 ug/ml)와 처리 시간 (24, 48, 72시간) 어〕관계없이 유의한 감소는 나타나지 않았다.
WAG의 HepG2 cells에 대한 세포 독성을 측정하기 위하여 시료 5, 10, 50, 100, 250, 500 ug/ml의 범위에 대하여 24, 48, 72 시간동안 배양한 후 세포 생존율을 측정한 결과 WAG가 처리된 군과 정상군과의 유의한 차이는 나타나지 않았다 (Fig. 1.).
감소는 나타나지 않았다. WAS를 처리한 HepG2 cells의 세포 생존율 감소를 확인하기 위해 MTT assay를 수행한 결과 처리농도 (5, 10, 50, 100, 250, 500 ug/ml)와 처리 시간 (24, 48, 72시간) 어〕관계없이 유의한 감소는 나타나지 않았다. WAA를 처리한 HepG2 cells의 세포생존율 감소를 확인하기 위해 MTT assay 를 수행한 결과 500ug/ml의 농도로 24, 48시간 동안 처리한 군에서 정상군에 비해 각각 85.
WAS의 HepG2 cells에 대한 세포 독성을 측정하기 위하여 시료 5, 10, 50, 100, 250, 500 ug/ml의 범위에 대하여 24, 48, 72 시간 동안 배양한 후 세포 생존율을 측정한 결과 WAS가 처리된 군과 정상군과의 유의한 차이는 나타나지 않았다 (Fig. 2).
이상의 결과에서 한국 當謊와 중국 當歸는 500 ug/ml의 최고농도에서 간세포 독성이 나타나지 않았음을 확인하였다.
중국. 일본 當歸의 물 추출물로서 간 조직 세포인 HepG2 cells을 대상으로 MTT assay를 실시하여 세포생존율 측정 실험을 수행한 결과 한국 當歸 물 추출물 (WAG) 과 중국 當歸 물 추출물 (WAS) 에서는 처리 농도 (5, 10, 50, 100, 250, 500 ug/ml) 와 처리 시간 (24, 48, 72시간)어】 관계없이 정상군에 비해 유의한 감소는 나타나지 않았으나 일본 當歸 물 추출물 (WAA)에서는 500ug/ml21 농도로 24, 48 시간 동안 처리한 군에서 정상군에 비해 각각 85.45%, 75.01%로 유의한 감소를 나타내었다 (p < 0.05). 따라서 한국 當歸와 중국 當歸의 물 추출물은 500 ug/ml의 농도에서 HepG2 cells에 세포 독성이 없는 것으로 사료된다.
참고문헌 (9)
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