Objective : This study was performed to investigate the antineoplastic effect of Astragalus membranaceus, Angelica gigas, Rhus verniciflua Stokes and Trichosanthes kirilowii on SNU-80 anaplastic thyroid carcinoma cell line. Method : We examined whether our herbal medicines decreases cell growth rate...
Objective : This study was performed to investigate the antineoplastic effect of Astragalus membranaceus, Angelica gigas, Rhus verniciflua Stokes and Trichosanthes kirilowii on SNU-80 anaplastic thyroid carcinoma cell line. Method : We examined whether our herbal medicines decreases cell growth rate of SNU-80 using MTT assay. We performed western blot analysis to verify that our herbal medicines induces apoptosis via caspase-dependent mechanism. We also performed wound healing assay and transwell invasion assay to investigate whether our herbal medicines affects the migration and invasion of anaplastic cancer cells, SNU-80. We also carried out ELISA assay to know our herbal medicines suppresses the expression of proinvasive molecules, such as VEGF and MMP-2 secreted from SNU-80. Results : MTT assay demonstrates that Angelica gigas, Rhus verniciflua Stokes, and Trichosanthes kirilowii suppressed strongly the growth of SNU-80. Western blot analysis demonstrates that Trichosanthes kirilowii induces apoptosis activating the cleavages of caspases (caspase-8, caspase-3) and PARP. Wound healing assay demonstrates that Rhus verniciflua Stokes, and Trichosanthes kirilowii inhibited the migration of SNU-80. Transwell invasion assay demonstrates that Rhus verniciflua Stokes, and Trichosanthes kirilowii inhibited the invasion of SNU-80. Elisa assay demonstrates that Astragalus membranaceus, Angelica gigas, Rhus verniciflua Stokes, and Trichosanthes kirilowii suppressed the expression of VEGF and MMP-2. Conclusion : We could conclude that several herbal medicines suppresses the growth and inhibits the migration and invasion of SNU-80 which is anaplastic thyroid cancer cells. Especially, Rhus verniciflua Stokes, Trichosanthes kirilowii had stronger anti-cancer effect suggesting that we can apply them to treat anaplastic thyroid cancer.
Objective : This study was performed to investigate the antineoplastic effect of Astragalus membranaceus, Angelica gigas, Rhus verniciflua Stokes and Trichosanthes kirilowii on SNU-80 anaplastic thyroid carcinoma cell line. Method : We examined whether our herbal medicines decreases cell growth rate of SNU-80 using MTT assay. We performed western blot analysis to verify that our herbal medicines induces apoptosis via caspase-dependent mechanism. We also performed wound healing assay and transwell invasion assay to investigate whether our herbal medicines affects the migration and invasion of anaplastic cancer cells, SNU-80. We also carried out ELISA assay to know our herbal medicines suppresses the expression of proinvasive molecules, such as VEGF and MMP-2 secreted from SNU-80. Results : MTT assay demonstrates that Angelica gigas, Rhus verniciflua Stokes, and Trichosanthes kirilowii suppressed strongly the growth of SNU-80. Western blot analysis demonstrates that Trichosanthes kirilowii induces apoptosis activating the cleavages of caspases (caspase-8, caspase-3) and PARP. Wound healing assay demonstrates that Rhus verniciflua Stokes, and Trichosanthes kirilowii inhibited the migration of SNU-80. Transwell invasion assay demonstrates that Rhus verniciflua Stokes, and Trichosanthes kirilowii inhibited the invasion of SNU-80. Elisa assay demonstrates that Astragalus membranaceus, Angelica gigas, Rhus verniciflua Stokes, and Trichosanthes kirilowii suppressed the expression of VEGF and MMP-2. Conclusion : We could conclude that several herbal medicines suppresses the growth and inhibits the migration and invasion of SNU-80 which is anaplastic thyroid cancer cells. Especially, Rhus verniciflua Stokes, Trichosanthes kirilowii had stronger anti-cancer effect suggesting that we can apply them to treat anaplastic thyroid cancer.
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문제 정의
Apoptosis는 최종적으로 cell shrinkage, DNA fragmentation, membrane blebbing을 일으킨다24-32). 본 실험에서는 황기, 당귀, 칠피, 천화분이 역형성 갑상선 암세포 SNU-80의 세포성장을 저해하는 기전으로서의 apoptosis를 확인하기 위해 western blot analysis를 시행하였다. Apoptosis에 관련된 molecules들을 western blot analysis을 통해 detection한 결과, apoptosis가 일어날 때 발현되는 cleaved caspase-8은 천화분에서 발현이 가장 강하게 되었다.
. 본 연구에서는 扶正法에 활용할 수 있는 황기, 당귀 및 祛邪法에 활용할 수 있는 칠피, 천화분을 이용하여 실험을 수행하였으며, 그들의 역형성갑상선암세포에 대한 효과의 강약을 알아보고자 하였다.
본 연구에서는 황기, 당귀, 칠피, 천화분 각각이 역형성갑상선암세포에 미치는 영향과 기전을 살펴보았다.
제안 방법
24시간 후 세포간 간격이 얼마나 좁혀졌는지 control에 비교하여 사진을 찍었다(40×magnification).
2시간 동안 37℃ incubator에서 반응한 후 media를 제거하고 DMSO를 100㎕ 넣어서 blue fomazan crystal이 녹게 하였다. 570㎚에서 ELISA Reader(Merck Co., Germany)를 이용하여 흡광도를 측정하여 각 한약의 세포독성 및 증식효과에 대한 영향을 조사하였다.
세포가 monolayer form을 형성하고 80~90%로 꽉 찼을 때, 노란색 pipette tip을 세포 위로 십자로 긁어서 세포간 간격이 생기게 하였다. PBS로 세포를 씻어낸 후 각 한약을 세포사멸(apoptosis)을 일으키지 않을 농도로(50㎍/㎖) 처리하였다. 24시간 후 세포간 간격이 얼마나 좁혀졌는지 control에 비교하여 사진을 찍었다(40×magnification).
그 다음 4% paraformaldehyde를 500㎕씩 well에 넣고 200㎕씩 insert에 넣고 sealing하여 4℃에서 overnight하였다. 다음날, hematoxylin과 eosin으로 염색한 후 현미경으로 관찰하였다.
또한 황기, 당귀, 칠피, 천화분이 역형성갑상선암세포 SNU-80이 세포주의 전이에 미치는 영향을 알아보기 위해 wound healing assay를 시행하고, 아울러 transwell invasion assay를 시행하였다. 상처치유분석(wound healing assay)은 생체 내 상처 치유 기간 동안의 cell migration을 모방한 것이다.
마지막으로 본 실험에서는 암의 침윤(invasion) 및 혈관생성(angiogenesis)에 관여하는 인자들(VEGF, MMP-2)의 발현정도를 측정하기 위해 ELISA assay를 시행하였다. VEGF(Vascular endothelial growth factor)는 혈관신생과 혈관형성의 중심조절자로, 암과 같은 몇몇 질병들은 비정상적인 혈관신생에 의해서 유발되는데, 많은 경우에 이런 질병들은 VEGF의 과다한 생성들을 수반한다.
다시 씻어준 후 TMB substrate solution (BD bioscience, USA)를 넣어준 다음 어두운 곳에서 반응시키면서 발색을 확인하고 적당히 발색되었을 때에 2N의 황산을 넣어 반응을 중지시켰다. 반응을 중지시킨 후 450㎚에서의 흡광도를 측정하여 VEGF와 MMP-2의 농도를 확인하였다.
이후, 2차 항체를 1:4,000으로 희석하여 실온에서 1시간 반응시켰다. 세척 후 ECL detection kit(Amersham) 를 이용하여 반응성이 있는 특정 단백질 띠를 찾았다.
개가 되도록 96- well culture plate에 심어준 후 overnight 배양하였다. 세포가 monolayer form을 형성한 후 각 한약을 농도별로(0~500㎍/㎖) 처리하였다. 72시간 후 MTT, 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl) -2,5-diphenyltetrazolium bromide, a yellow tetrazole) 0.
세포를 한 100 Ø dish 당 1×106개를 깔고 그 다음날 각 한약 (500㎍/㎖)을 처리하였다.
수종 한약 단일물의 역형성갑상선암세포 SNU-80에 대한 항암효과를 알아보기 위해 각 한약을 처리한 SNU80 thyroid cancer cells에서 세포생존율, 세포사멸효과(apoptosis), 상처치유분석(wound healing assay), 암의 침윤정도 확인(invasion assay), 암의 침윤 및 혈관생성 관여하는 인자들(VEGF, MMP-2)의 발현정도(ELISA assay)를 측정하여 다음과 같은 결론을 얻었다.
대상 데이터
1차 항체들 중 FAS, cleaved caspase-8, cleaved caspase-3, PARP는 Cell Signaling Technology Inc (Danvers, MA, USA)에서 구입하였다. STAT3, phospho-STAT3 (Tyr705), phospho-JAK1 (Tyr1022/Tyr1023)은 Upstate-Millipore (Billerica, MA, USA) 에서 구입하였다.
Louis, MO, USA)에서 구입하였다. Horse radish peroxidase (HRP)-conjugated secondary antibodies (mouse and rabbit) (2차 항체)는 Calbiochem (San Diego, CA, USA)에서 구입하였다.
Human VEGF, MMP-2 ELISA set은 R&D system(USA)에서 구입하였다.
SNU-80 human thyroid cancer cells은 한국 서울대학교 세포주 은행에서 분양받아 사용하였다. 세포배양에 사용된 배지는 10% FBS(Welgene, Daegu, Korea)와 Antibiotic-antimycotic(Welgene, Daegu, Korea)이 포함된 RPMI 배지(Welgene, Daegu, Korea) 를 사용하였으며 3일 1회 배지를 교환하였다.
1차 항체들 중 FAS, cleaved caspase-8, cleaved caspase-3, PARP는 Cell Signaling Technology Inc (Danvers, MA, USA)에서 구입하였다. STAT3, phospho-STAT3 (Tyr705), phospho-JAK1 (Tyr1022/Tyr1023)은 Upstate-Millipore (Billerica, MA, USA) 에서 구입하였다. Tubulin은 Sigma-Aldrich (St.
STAT3, phospho-STAT3 (Tyr705), phospho-JAK1 (Tyr1022/Tyr1023)은 Upstate-Millipore (Billerica, MA, USA) 에서 구입하였다. Tubulin은 Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)에서 구입하였다. Horse radish peroxidase (HRP)-conjugated secondary antibodies (mouse and rabbit) (2차 항체)는 Calbiochem (San Diego, CA, USA)에서 구입하였다.
Louis, MO, USA)에서 구입하여 사용하였다. 본 실험에 사용된 시약 중 NaCl, KCl, NaH2PO4, KH2PO4는 Sigma(USA)제품을 사용하였고, Tween 20은 BIO-RAD(USA) 제품을 사용하였다. Human VEGF, MMP-2 ELISA set은 R&D system(USA)에서 구입하였다.
세포실험에 사용된 plastic 제품 96-well culture plate, 24-well culture plate, 100mm culture plate는 Daeillab service Co, Ltd,(Seoul, Korea)에서 구입하였다. 세포 독성 측정 실험에 사용된 MTT 시약은 Sigma aldrich(St. Louis, MO, USA)에서 구입하여 사용하였다. 본 실험에 사용된 시약 중 NaCl, KCl, NaH2PO4, KH2PO4는 Sigma(USA)제품을 사용하였고, Tween 20은 BIO-RAD(USA) 제품을 사용하였다.
SNU-80 human thyroid cancer cells은 한국 서울대학교 세포주 은행에서 분양받아 사용하였다. 세포배양에 사용된 배지는 10% FBS(Welgene, Daegu, Korea)와 Antibiotic-antimycotic(Welgene, Daegu, Korea)이 포함된 RPMI 배지(Welgene, Daegu, Korea) 를 사용하였으며 3일 1회 배지를 교환하였다. FBS는 잔존하는 보체 성분을 불활성화 시키기 위해 실온에서 녹인 후 heat inactivation(56℃ water bath에 30분간 가열)하여 사용하였다.
세포실험에 사용된 plastic 제품 96-well culture plate, 24-well culture plate, 100mm culture plate는 Daeillab service Co, Ltd,(Seoul, Korea)에서 구입하였다. 세포 독성 측정 실험에 사용된 MTT 시약은 Sigma aldrich(St.
실험에 사용된 수종 한약은 (주) 한풍제약(Jeonjoo, Korea)에서 조제되어 본 연구실로 배송되었다. 배송된 수종 한약 분말은 30% 에탄올에 녹여 사용하였다.
데이터처리
실험결과에 대한 모든 분석은 Win PC-SPSS(VER. 8.5) 프로그램으로 실시하였고, 기술 통계학적 분석은 각 group의 측정값을 Mean(평균) ± S.E(표준오차)로 요약하였으며, Student t-test method로 분석하여 p<0.05 level에서 유의성을 인정하였다.
성능/효과
1. 당귀, 칠피, 천화분에서 SNU-80의 생존율을 감소시켰다.
2. cleaved caspase-8, cleaved caspase-3, cleaved PARP가 모두 천화분에서 강하게 발현되었다.
3. 칠피, 천화분에서 SNU-80의 전이율을 감소시켰다.
4. 칠피, 천화분에서 SNU-80의 침윤율을 감소시켰다.
5. 황기, 당귀, 칠피, 천화분에서 VEGF와 MMP-2의 발현을 억제하였다.
apoptosis의 최종단계라고 할 수 있는 cleaved PARP는 특히 천화분에서 발현이 강하게 되었다. 결과적으로 천화분이 apoptosis가 일어날 때 발현되는 molecules들을 강하게 발현시킴을 확인하여 apoptosis를 가장 잘 일으킴을 추정할 수 있다(Figure 3). 본 연구에서 칠피의 결과는 얻지 못하였다.
본 연구에서 正氣를 키우는 扶正法의 관점에서 선택한 황기, 당귀는 邪氣를 쫓는 祛邪法의 관점에서 선택한 칠피, 천화분에 비교하여 역형성 갑상선 암세포의 침윤이나 전이를 저해하는 효과가 미미하였다. 황기의 경우 암세포 성장저해에 효과가 없었으며, 암세포의 전이와 침윤은 황기, 당귀가 오히려 증가시켰다.
암의 침윤 및 혈관생성에 관여하는 인자들인 VEGF와 MMP-2의 발현정도를 측정하기 위해 ELISA assay를 시행한 결과, 황기, 당귀, 칠피, 천화분 모두 control (EtOH 30%)에 비교했을 때 VEGF와 MMP-2의 발현을 억제하였다(Figure 6). 이는 실험에 사용한 황기, 당귀, 칠피, 천화분이 역형성갑상선암세포의 침윤이나 전이를 저해하는데 효과가 있음을 밝혀준다.
이상의 실험결과로부터 황기, 당귀, 칠피, 천화분이 각각 역형성갑상선암세포인 SNU-80에 대해 항암효과를 가지고 있음을 확인하였으며, 특히 칠피와 천화분의 경우 매우 높은 항암효과를 보였다.
그러나 VEGF, MMP-2의 발현 등에서는 황기, 당귀 역시 유효한 결과를 확인할 수 있었다. 칠피와 천화분은 본 연구에서 확인한 항암관련 실험 항목에서 높은 항암효과를 보였다.
황기(Astragalus membranaceus), 당귀(Angelica gigas), 칠피(Rhus verniciflua Stokes), 천화분(Trichosanthes kirilowii)이 역형성갑상선암세포(human anaplastic thyroid cancer cells)인 SNU-80 세포주에 미치는 세포독성을 알아보기 위하여 MTT assay 방법으로 세포의 생존율을 관찰한 결과, 황기는 농도에 관계없이 세포생존율에 영향을 미치지 않았고(Figure 1), 당귀는 농도에 따라(dose-dependent) 점차 생존율을 감소시켰으며(Figure 1), 칠피와 천화분은 낮은 농도에서부터 높은 농도까지 급격히 세포생존율을 감소시켰다(Figure 2).
황기, 당귀, 칠피, 천화분의 세포독성 및 증식효과를 조사하기 위해 MTT assay를 통해 세포의 생존율을 관찰한 결과, 황기는 농도에 관계없이 세포생존율에 영향을 미치지 않았으며, 당귀는 농도에 따라 점차 생존율을 감소시켰다. 칠피와 천화분은 낮은 농도에서부터 높은 농도까지 급격히 세포생존율을 감소시켰다.
황기, 당귀, 칠피, 천화분이 SNU-80 세포에서 분비되는 VEGF(Vascular endothelial growth factor) 나 MMP-2(matrix metalloproteinase-2)의 발현을 어떻게 조절하는지를 관찰한 결과, control(EtOH 30%) 에 비교했을 때 황기, 당귀, 칠피, 천화분 모두 VEGF와 MMP-2의 발현을 억제하였다(Figure 6, Figure 7).
황기, 당귀, 칠피, 천화분이 SNU-80 세포주의 전이에 미치는 영향을 알아보기 위해 시행한 wound healing assay에서 각 한약을 50㎍/㎖의 농도로 세포에 처리한 후 24시간 동안 배양하여 세포의 전이율을 관찰한 결과, 황기와 당귀는 control(EtOH 30%)에 비교했을 때 오히려 세포의 전이율을 증가시켰고, 칠피와 천화분은 control에 비해 SNU-80의 전이율을 감소시켰다(Figure 4). 이는 황기나 당귀는 암세포의 전이를 저해하지 못하나 칠피와 천화분은 역형성갑상선암세포의 전이를 저해하는데 큰 효과가 있음을 밝혀준다.
이는 황기나 당귀는 암세포의 전이를 저해하지 못하나 칠피와 천화분은 역형성갑상선암세포의 전이를 저해하는데 큰 효과가 있음을 밝혀준다. 황기, 당귀, 칠피, 천화분이 SNU-80 세포주의 침윤에 미치는 영향을 알아보기 위하여 transwell invasion assay 방법으로 세포의 침윤율을 관찰한 결과, 황기와 당귀는 control(EtOH 30%)에 비교했을 때 오히려 세포의 침윤율을 증가시켰고, 칠피와 천화분은 control에 비교했을 때 SNU-80의 침윤율을 감소시켰다(Figure 5). 이는 황기나 당귀는 암세포의 침윤을 저해하지 못하나 칠피와 천화분은 역형성 갑상선 암세포의 침윤을 저해하는데 큰 효과가 있음을 밝혀준다.
황기, 당귀, 칠피, 천화분이 역형성갑상선암세포 SNU80 세포주의 전이에 미치는 영향을 관찰한 결과, 황기와 당귀는 control(EtOH 30%)에 비교했을 때 오히려 세포의 전이율을 증가시켰고, 칠피와 천화분은 control (EtOH 30%)에 비교했을 때 SNU-80의 전이율을 감소시켰다(Figure 4).
황기, 당귀, 칠피, 천화분이 역형성갑상선암세포인 SNU-80 세포주의 침윤에 미치는 영향을 알아보기 위하여 transwell invasion assay 방법으로 세포의 침윤율을 관찰한 결과, 황기와 당귀는 control(EtOH 30%) 에 비교했을 때 오히려 세포의 침윤율을 증가시켰고, 칠피와 천화분은 control(EtOH 30%)에 비교했을 때 SNU-80의 침윤율을 감소시켰다(Figure 5).
후속연구
이에 황기와 당귀를 대상으로 향후 좀 더 다양한 항암기전에 대한 실험연구가 필요하며, 이를 바탕으로 扶 正法을 임상에서 어떻게 적용할 것인지 깊이 있는 논의와 연구가 필요할 것이다. 아울러 扶正法과 祛邪法 양자를 적절히 운용하여 扶正祛邪法의 관점에서 다양한 한약물의 조합을 통해 한약물의 항암효과에 대한 보다 심도 있는 연구가 필요할 것으로 사료된다.
이에 황기와 당귀를 대상으로 향후 좀 더 다양한 항암기전에 대한 실험연구가 필요하며, 이를 바탕으로 扶 正法을 임상에서 어떻게 적용할 것인지 깊이 있는 논의와 연구가 필요할 것이다. 아울러 扶正法과 祛邪法 양자를 적절히 운용하여 扶正祛邪法의 관점에서 다양한 한약물의 조합을 통해 한약물의 항암효과에 대한 보다 심도 있는 연구가 필요할 것으로 사료된다.
본 연구에서 칠피의 결과는 얻지 못하였다. 향후 칠피가 암세포 apoptosis에 미치는 영향에 대해서도 추가적인 실험 및 연구가 이루어져야 할 것이다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
갑상선암이란?
갑상선암은 내분비계의 가장 흔한 악성종양으로 갑상선유두암종과 갑상선여포암종과 같은 분화종양들은 완치되는 경우가 흔하며 예후가 아주 좋은 편이지만1), 주위 조직으로 침윤해 들어간 경우나 다른 장기에 전이된 경우엔 생존율이 급격히 낮아진다. 역형성 암은 드물게 발생하며 악성도가 높은 미분화암으로, 원발성으로 생길 수도 있고 분화성이 좋은 유두암종이나 여포암종이 퇴화하여 생길 수도 있다2).
한의학에서의 암치료는 어떻게 행해지고 있는가?
한의학에서의 암치료는 正氣를 돕는 약을 써서 邪氣 로 하여금 저절로 소멸되게 하는 ‘扶正法’과, 邪氣를 제거하는 약을 쓰는 것으로 이를 통해 正氣를 돕는 ‘祛邪法’을 활용하고 있으며, 각각의 치료법을 이용한 여러 한약물의 항암효과가 보고되고 있다6-9). 黃芪(Astragali Radix)는 性은 溫하고 味는 甘하며, 生用하면 益衛固表, 利水消腫, 托毒, 生肌의 효능이 있어 自汗, 盜汗, 血痺, 浮腫, 癰疽不潰, 潰久不斂를 치료하며, 炙用하면補中益氣의 효능이 있어 內傷勞倦, 脾虛泄瀉, 脫肛, 氣虛血脫, 崩帶, 一切氣衰血虛之證을 치료한다10-11).
수종 한약 단일물의 역형성갑상선암세포 SNU-80에 대한 항암효과를 알아보기 위한 실험의 결과는 어떠한가?
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