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문제 정의
- 최근, 다양한 한약재의 기능성에 관한 보고로 Jeong 등(Jeong SJ 등 2004)의 118종의 한약재와 약용식물에 대한 항산화활성 검색 연구를 비롯하여, Nam과 Kang 등(Nam SH 와 Kang MY 2000)은 130종의 한약재로서 항산화효과를 검색한 결과 25종의 한약재에서 80%이상의 전자공여 능이 있음을 보고하였고, 택사와 백자인 등은 DNA손 상을 뚜렷하게 억제하는 것으로 보고하였다 또한 천 연물중의 생리활성을 갖는 배당체를 식용미생물로서 전환 후에는 세포독성이 줄어들고 배당체의 생리활성이 증가되어 아질산염 소거능과 항산화능의 증가(지현 등 2005) 및 한약재를 첨가한 발효식품에서 기능성 향 상효과가 다수 보고되고 있다(Shin HJ 등 1999, Kwon DJ 2004, Bang HY 등 2004, Kim YS 등 2003, Park SH 등 2004, Park CS 2003, Bae HC 등 2004). 따라서 본 연구는 산약, 행인, 산사자, 지실 등 4종류의 한약 재를 물과 에탄올로 추출하여 전자공여능과 아질산염 소 거능 및 암세포 증식억제능을 조사하여 이들을 이용한 기능성 식품제조에 필요한 기초자료를 얻고자 하였다.
제안 방법
- 암세포주에 대한 MIT assay는 Kim 등(Kim EJ 등 1998)이 행한 방법을 변형하여 사용하였다. 10% FBS를 함유한 RPMI 1640배지에 5xl03 4 cells/mL 농도로 96 well plate에 각각 180 uL씩 첨가하여 4시간 동안 항온기(37℃, 5% CO, 에서 배양시킨 후 각 추출물을 최종농도가 0.1, 0.3, 0.5, 1.0 mg/mL가 되도록 20 uL씩 첨가하여 48시간 동안 다시 배양시켰다. 대조구에는 동일한 양의 중 류수를 첨가하였으며 시료 당 각각의 실험군은 3개의 well을 동일조건으로 사용하였다.
- 0 mg/mL가 되도록 20 uL씩 첨가하여 48시간 동안 다시 배양시켰다. 대조구에는 동일한 양의 중 류수를 첨가하였으며 시료 당 각각의 실험군은 3개의 well을 동일조건으로 사용하였다. 여기에 5 mg/mL의 MIT용액 20 uL씩 첨가하여 4시간 동안 배양시켜 formazaii을 형성시킨 후 DMSO(dimethyl sulfoxide) 150 uL를 첨가하여 formazan을 녹인 다음 microplate reader (Molecular Device, Emax)를 이용하여 570 nm에서 흡광도를 측정하였다.
- 시료의 추출은 시료의 20배량의 용매로서 물 추출물 은 80℃, 에탄올 추출물은 70% 에탄올로서 70℃에서 3시간씩 2회 반복 추출하였다. 추출한 시료는 환류냉 각관을 가진 진공증발 농축기(EYELA, Japan)로 농축한 후 동결건조기(FD551OSPT, Ilshin, Korea)로 동결건조 (Temp.
- 본 실험에 사용한 세포주는 유방암세포인 MDA-MB- 231(KCLB 30026)과 폐암 세포인 A549(KCLB 10185)로서 세포주 은행에서 분양받아 사용하였다. 암세포주에 대한 MIT assay는 Kim 등(Kim EJ 등 1998)이 행한 방법을 변형하여 사용하였다. 10% FBS를 함유한 RPMI 1640배지에 5xl03 4 cells/mL 농도로 96 well plate에 각각 180 uL씩 첨가하여 4시간 동안 항온기(37℃, 5% CO, 에서 배양시킨 후 각 추출물을 최종농도가 0.
- 전자공여능(Electron Donating Ability, EDA)은 Blois (Blois MS 1958)의 방법을 변형하여 시료의 l, ldphenyl- 2-picryl hydrazyl(DPPH)에 대한 전자공여 효과로서 시료의 환원력을 측정하였다. 즉, 각 추출시료 0.
대상 데이터
- 본 실험에 사용한 세포주는 유방암세포인 MDA-MB- 231(KCLB 30026)과 폐암 세포인 A549(KCLB 10185)로서 세포주 은행에서 분양받아 사용하였다. 암세포주에 대한 MIT assay는 Kim 등(Kim EJ 등 1998)이 행한 방법을 변형하여 사용하였다.
- 재료는 2005년에 생산된 한국산 산약, 행인, 산사자 및 지실을 대구 남성로의 한약재 도매시장에서 구입하여 실험에 사용하였다.
- 시료의 추출은 시료의 20배량의 용매로서 물 추출물 은 80℃, 에탄올 추출물은 70% 에탄올로서 70℃에서 3시간씩 2회 반복 추출하였다. 추출한 시료는 환류냉 각관을 가진 진공증발 농축기(EYELA, Japan)로 농축한 후 동결건조기(FD551OSPT, Ilshin, Korea)로 동결건조 (Temp. -60℃, Vac. 10 mm Torr)하여 사용하였다
데이터처리
- 결과는 SPSS 통계분석 프로그램을 이용하여 각 실 험군 간 평균치의 통계적 유의성을 Duncan's multiple range test로 검증하였다.
이론/모형
- 아질산염 소거작용(Nitrite Scavenging Ability, NSA)은 Kato 등(Kato H 등 1987)의 방법에 따라 1 mM의 NaN6용액 1 mL에 각 추출시료를 0.2 mL 가하고 0.2 N 구연산 완충용액을 사용하여 반응용액의 pH를 각각 1.2, 3.0, 4.2, 6.0으로 조정한 후 반응용액의 부 피를 10 mL로 하였다. 이 용액을 37℃에서 1시간 반 응시킨 후 각 반응액 1 mL를 취하여 2% 초산용액 5mL 와 Griess reagent(l% sulfanilic acid : 1% naphthylamin =1:1) 0.
성능/효과
- 10에서 에탄올 추출물을 A549 cell에 투여한 결과 1,000 ppm의 경우 지실이 11% 및 나머지 약재는 모두 10% 미만으 로 4가지 약재 의 A549 cell에 대한 증식억 제 능은 미 약하였다. A549 cell에 대한 추출물의 증식억제능을 측정한 이상의 결과에서 물 및 에탄올 추출물 모두 가 지실이 가장 높았으나 에탄올 추출물의 증식억 제능은 매우 낮았고 물 추출물 1,000 ppm에서 45%의 증식억 제 능을 보여 가장 큰 효과를 나타내 었 다. 그러나 이 결과는 Kim 등(Kim EJ 등 1998)이 솔잎 추출물 1,000 pptn이 78%의 억제효과를 나타낸다고 보고한 결과보다 항암활성이 낮은 편이었으며 4가지 약재 추출물의 항암활성은 A549 cell에 비하여 MDA cell에서 더 높았다.
- Fig. 3은 산약추출물의 pH변화에 따른 아질산염 소 거능으로 pH 1.2의 추출물 1,000 ppm에서 아질산염 소거능이 물 추출물은 5%, 에탄올 추출물은 18%로 에탄올 추출물이 물 추출물에 비하여 3.6배 높았으나 그 수치는 낮아 pH 1.2의 에탄올 추출물 이외의 조 건에서는 아질산염 소거능에 있어서 기대할 수 없는 결과를 보였다. Fig.
- 2)에서 물 추출물 보다 에탄올 추출물이 높았던 것과 비교해 볼 때 아 질산염 소거능은 추출용매간의 차이가 없는 것으로 판단된다. Fig. 5는 산사자 추출물의 pH변화에 따른 아질산염 소거능으로 pH 1.2의 추출물 1,000 ppm에서 물 추출물이 55%, 에탄올 추출물이 69%로 실험 한 4가지 한약재 중 가장 높았으며 전자공여능과 같이 에탄올 추출물이 물 추출물보다 아질산염 소거능 이 높아 산사자의 기능성 물질 이용에는 에탄올 추 출물이 더 효율적인 것으로 판단되었다. Fig.
- 8은 에탄올 추출물의 유 방암세포인 MDA-MB-231(KCLB 30026) cell에 대한증식억 제 능을 나타낸 것이다. Fig. 7에서 물 추출물 을 MDA cell에 투여한 결과 1,000 ppm의 경우 산 약 24%, 행인 52%, 산사자 45% 및 지실 47%로 행 인의 증식억제율이 가장 높았고 산사자, 지실, 산약 의 순서였다. Fig.
- 7에서 물 추출물 을 MDA cell에 투여한 결과 1,000 ppm의 경우 산 약 24%, 행인 52%, 산사자 45% 및 지실 47%로 행 인의 증식억제율이 가장 높았고 산사자, 지실, 산약 의 순서였다. Fig. 8에서 에탄올 추출물을 MDA cell에 투여한 결과 1,000 ppm의 경우 행인 94%, 산사 자 69%, 지실 47% 및 산약 18%로 물 추출물과 동 일하게 행인이 가장 높았고 산사자, 지실, 산약의 순서였다. 행인은 폐암, 장암, 식도암 등에 치료효과를 가지고 있다는 보고도 있으나 행인의 유효성분인 amygdalin 은 장내 소화를 거쳐 cyanogenic glycoside로 변화하며 이것 때문에 1920년대 Ernst등은 항암작용을 주장하였고 이후 여러 차례의 동물실험과 약리학적 연구를 통하여 amygdalin의 항암 효과가 평가되었는데 그 독성에 의한 부작용을 주 의하여야 한다는 결론들이 대체적이다(Moertel CG 등 1982).
- 10은 에탄올 추출물의 폐암 세포인 A549 (KCLB 10185) cell에 대한 증식억제능의 측정 결과를 나타낸 것이다. Fig. 9에서 물 추출물을 A549 cell에 투여한 결과 1,000 ppm의 경우 산약 18%, 행인 6%, 산사자 7% 및 지실 43%로 지실의 효과가 가장 컸으며 산약, 산사자, 행인 의 순서 였으나 산사자, 행 인에 대한 중식억제 능은 지실에 비하여 매우 낮아 미미한 정도였다. 지실elimonene, linalool, p-cymen, a-cymen, a-pinene, caryophyllene, camphene 등의 정유성분과 hesperidine, neohesperidine, poncirin, naringin 등의 flavonoids, skimmianine 등의 alkaloid 등을 함유하고 있으며 (Shoji N 1984) 이들 성분의 항암 효과에 관한 연구는 거의 보고되어 있지 않다.
- 4는 행인추출물의 pH변화에 따른 아질산염 소거능을 나타낸 것이다. pH 1.2의 행인 추출물 1,000 ppm에서 아질산염 소거능이 물 추출물 31%, 에탄올 추출물 32%로 두 추출물간의 차이는 없었으며 전반적인 pH에서 물과 에탄올 추출물간의 소거능에 큰 차이를 나타내지는 않았다. 이는 행인의 전자공여능의 실험결과(Fig.
- 2에서 가장 높았고 동일한 pH에서는 농도 의존적 으로 아질산염 소거능도 증가하였다. 또한 물 및 에 탄올 추출물 모두에서 산사자가 가장 높은 아질산염 소거능을 보였고 지실, 행인 그리고 산약의 순서였으 며 산사자와 지실은 pH 1.2의 물 및 에탄올 추출물 모두 아질산염 소거능이 높아 Park 등(Park CS 등 2005)이 실험한 당귀, 목통, 골담초 등의 한약재 추출물 및 쑥(Park CS 2002a)과 동충하초(Park CS 2002b)의 1,000 ppm에서 아질산염 소거능이 30-45% 였던 결과보다 월등히 높은 결과를 나타내었다. Kim 등(Kim US 등 2004)이 음식재료의 전자공여능 및 아 질산염 소거능을 조사하고 이들 재료로 구성된 비빔 밥의 전자공여능 및 아질산염 소거능을 밥, 김밥, 햄 버거 등과 비교한 결과 비빔밥이 우수하였다는 연구 로 비추어 볼 때 본 연구에서 사용한 한약재들을 첨가하여 기능성을 가진 다양한 제품을 제조할 수 있을 것으로 판단된다.
- 2는 에탄올 추출물의 전자공여능으로서 100, 300, 500 및 1,000 ppm에서 산약은 10, 23, 36 및 62%, 행 인은 27, 36, 48 및 59%, 산사자는 33, 49, 58 및 89% 그리고 지실은 20, 29, 39 및 42%였다. 물 및 에탄올 추출물의 전자공여능에 관한 이상의 결과에서 지실을 제외하고는 물 추출물 보다 에탄올 추출물의 전자공여 능이 높았으며 산사자의 에탄올 추출물이 1,000 ppm 에서 89%를 나타낸 결과는 118종의 한약재를 80% 메 탄올 추출물로 전자공여능을 측정한 보고(Jeong SJ 등 2004)의 괴화(76.9%), 녹차(64.6%) 및 작약(57.1 %)보다도 높은 전자공여능을 가졌음을 알 수 있었다.
- 본 연구에 사용된 4가지 약재 모두에서 물 및 에탄올 추출물 농도가 올라 갈수록 전자공여능도 높아져 1,000 ppm에서 가장 높았고 1,000 ppm에서 물 추출물 은 산사자, 지실, 행인 그리고 산약의 순서였으며 에탄올 추출물은 산사자, 행인, 지실 그리고 산약의 순서로 산사자의 전자공여능이 가장 높았고 산약이 가장 낮았 다. 특히, 물과 에탄올 추출물 1,000 ppm의 전자공여능이 각각 72%와 89%인 산사자는 송화의 물과 에탄올 추출물에서 각각 74%와 67%(Kim ML 2005a), 적채 의 물과 에탄올 추출물에서 각각 64%와 76%(Kim ML 2005b)로 보고된 결과에 비하여 높은 전자공여능을 보 유하였고 Park(Park CS 2005)이 보고한 당귀와 골담초 에서 물과 에탄올 추출물의 전자공여능이 80%이상이 었다는 결과와도 유사하여 산사자의 지질 과산화에 의한 유리 라디칼의 분해 촉진 효과가 높을 것으로 판단된다.
- 2의 추출물 1,000 ppm에서 물 추출물 45%, 에탄올 주줄물 52%로 산사자 다음으로 아질산염 소거 능이 높았으며 산사자와 같이 에탄올 추출물의 효능 이 물 추출물보다 높았다. 아질산염 소거능에 관한 이상의 결과에서 물 및 에탄올 추출물 모두에서 pH가 낮아짐에 따라 아질산염 소거능은 증가하여 pH1.2에서 가장 높았고 동일한 pH에서는 농도 의존적 으로 아질산염 소거능도 증가하였다. 또한 물 및 에 탄올 추출물 모두에서 산사자가 가장 높은 아질산염 소거능을 보였고 지실, 행인 그리고 산약의 순서였으 며 산사자와 지실은 pH 1.
- 1은 물 추출물의 전자공여능으로서 100, 300, 500 및 1,000 ppm에서 산약은 3, 2, 7 및 14%, 행인은 14, 24, 27 및 36%, 산사자는 29, 42, 53 및 72% 그리고 지실은 14, 30, 35 및 43%였다. 이들 4종류의 시료중에서 산사자의 전자공여능이 가장 높았으며 이는 Park등(Park CS 2002a)이 보고한 쑥(57%)과 솔잎(70%), Park 등(Park CS 2002b) 의 동충하초 균사체(47%)와 자 실체(48%)에 비하여 우수한 전자공여능을 나타내었다. Fig.
- 그러나 최근까지도 amygdalin을 prodrug으로 사용하여 암을 치료하려는 연구가 계속되고 있다(Syrigos KN 등 1998). 이상의 MDA cell에 대한추출물의 중식억제능 결과에서 행 인과 산사자는 물 추출물보다 에탄올 추출물이 모든 농도에서 유의적 으로 높았고 산약과 지실은 에탄올 추출물보다 물 추출물이 높았으나 유의적인 차이는 없었다. 특히 에탄올 추출물 1,000 ppm에서 행인과 산사자의 증 식억제능이 94% 및 69%로 매우 높았으며 물 추출 물 500 ppm까지의 농도에서는 지실의 증식억제능이 높았으나 1,000 ppm에서는 행인이 52%로 가장 높 았다.
- 이상의 MDA cell에 대한추출물의 중식억제능 결과에서 행 인과 산사자는 물 추출물보다 에탄올 추출물이 모든 농도에서 유의적 으로 높았고 산약과 지실은 에탄올 추출물보다 물 추출물이 높았으나 유의적인 차이는 없었다. 특히 에탄올 추출물 1,000 ppm에서 행인과 산사자의 증 식억제능이 94% 및 69%로 매우 높았으며 물 추출 물 500 ppm까지의 농도에서는 지실의 증식억제능이 높았으나 1,000 ppm에서는 행인이 52%로 가장 높 았다. Do 등(Do JR 2005)은 지유, 감초, 정향 등의 추출물로서 위암세포 (SNU-1 cell) 에 대하여 1,000 ppm의 농도에서 물 추출물은 30-44%, 에탄올 추출 물은 30-36%의 항암활성을 나타내었으나 자궁암 세 포(HeLa cell)에 대하여는 동일한 농도에서 물 추출 물은 15-55%, 에탄올 추출물은 10-36%의 항암활성을 나타내어 생약재와 암세포의 종류에 따라 항암 활성에 큰 차이를 나타낸다고 보고한 바, 본 연구의 행인 및 산사자의 항암효과는 이들과 비교해 볼 때 매우 높은 것으로 판단되었다.
후속연구
- 2의 물 및 에탄올 추출물 모두 아질산염 소거능이 높아 Park 등(Park CS 등 2005)이 실험한 당귀, 목통, 골담초 등의 한약재 추출물 및 쑥(Park CS 2002a)과 동충하초(Park CS 2002b)의 1,000 ppm에서 아질산염 소거능이 30-45% 였던 결과보다 월등히 높은 결과를 나타내었다. Kim 등(Kim US 등 2004)이 음식재료의 전자공여능 및 아 질산염 소거능을 조사하고 이들 재료로 구성된 비빔 밥의 전자공여능 및 아질산염 소거능을 밥, 김밥, 햄 버거 등과 비교한 결과 비빔밥이 우수하였다는 연구 로 비추어 볼 때 본 연구에서 사용한 한약재들을 첨가하여 기능성을 가진 다양한 제품을 제조할 수 있을 것으로 판단된다. 추출물의 pH가 높아질수록 아 질산염 소거능이 감소하는 점은 Kim SM 등(Kirn SM 등 2001)의 결과와 일치하였으며 둥글레(Kim KT 등 2005), 녹즙추출물(Chung SY 등 1999), 페놀성 화합 물(Kang YH 등 1996), 한약재 등(Kim SM 등 2001)에서도 거의 같은 경향을 나타내었다.
- 우리나라를 비롯한 동양권에서 오랜 기간 동안 질병치료와 예방의 목적으로 사용되어온 한약재는 식물의 2차 대사산물이 가지는 생체에 대한 생리활성 효과를 이용하는 천연재 료로서 경험적으로 선택, 이용되면서 인체에 대한 안 전성은 대체로 검정된 것들이라 할 수 있다. 이러한 점에서 한약재 자체를 기능성 식품의 소재로 가공, 이용하는 방법이나, 함유된 생리활성 물질을 추출하여 목적 지향적 기능성 식품용 첨가제로 이용하는 방법에 대한 연구가 수행될 필요가 있다. 최근, 다양한 한약재의 기능성에 관한 보고로 Jeong 등(Jeong SJ 등 2004)의 118종의 한약재와 약용식물에 대한 항산화활성 검색 연구를 비롯하여, Nam과 Kang 등(Nam SH 와 Kang MY 2000)은 130종의 한약재로서 항산화효과를 검색한 결과 25종의 한약재에서 80%이상의 전자공여 능이 있음을 보고하였고, 택사와 백자인 등은 DNA손 상을 뚜렷하게 억제하는 것으로 보고하였다 또한 천 연물중의 생리활성을 갖는 배당체를 식용미생물로서 전환 후에는 세포독성이 줄어들고 배당체의 생리활성이 증가되어 아질산염 소거능과 항산화능의 증가(지현 등 2005) 및 한약재를 첨가한 발효식품에서 기능성 향 상효과가 다수 보고되고 있다(Shin HJ 등 1999, Kwon DJ 2004, Bang HY 등 2004, Kim YS 등 2003, Park SH 등 2004, Park CS 2003, Bae HC 등 2004).
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