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문제 정의
- 본 연구는 염색체 연구가 보고되지 않은 섬시호의 체세포분열과 감수분열을 통해 세포유전학적 연구의 기반을 마련하고 5S와 45S rDNA 탐침을 이용한 bicolor FISH기법을 이용하여 염색체상에서의 물리적 지도를 작성하고자 수행되었다.
제안 방법
- 3) 완충액으로 37℃에서 5분간 blocking한 후, 1%의 avidin-FITC (fluorescein isothiocyanate)와 anti-digoxigenin rhodamine0] 포함된 100“。의 1% BSA/4XSSC의 혼합액을 슬라이드에 가한 다음 3기 C에서 30분 동안 반응시켜 biotin과 digoxigenin으로 표지된 DNA 탐침을 동시에 검출하였다. 4xSSC/0.2% tween-20 완충액으로 37에서 5분씩 3번 수세 후, 1㎍/㎖ DAPI (4, 6- diamidine-2-phenylindole dihydrochloride) 용액을 포함한 Vectashield (Vector Lab.) 15㎖를 도포하여 커버를 덮은 후 cooled CCD 카메라 (Co이 SNAP, Photometries)牛 형광현미경을 이용하여 signal을 관찰하고 사진을 촬영하였다. 확인된 signal들은 Meta Imaging Semes TM 4.
- 27로 중부 염색체로 관찰되었다. 4번 염색체의 길이와 arm- ratio가 큰 차이를 보이지 않았으나 여러 개의 세포를 평균으로 하여 구분하였다.
- FISH를 위한 탐침으로는 biotin-16-dUTP로 표지된 45S rDNA와 digoxigenin-11-dUTP로 표지된 5S rDNA를 이용하였으며 bicolor-FISH는 Kim 등 (1998)의 방법을 변용하여 사용하였다.
- 30 ㎛로 나타났으며, 상염색법으로 인형성 염색체를 관찰할 수 없었다. 감수분열 염색체의 관찰결과 감수분열 제 1분열의 중기와 후기 세포를 각각 관찰 하였다. 중기 세포에서 8쌍의 2가 염색체가 중앙에 배열된 모습을 관찰할 수 있었고 후기세포에서는 8쌍의 상동 염색체들이 두 개의 딸세포를 형성하기 위해 분리되는 모습을 관찰하였다.
- 감수분열에서의 염색체 관찰은 화분 모세포 (PMC; Pollen Mother Cells)에서 수행하였다. 화분 모세포의 관찰을 위하여 6월 말에서 7월 초순 사이 개화할 무렵에 10-12시에 개화 전의 꽃봉오리 전체를 절취하여 고정액에 담가 냉장고에 보관하면서 재료로 사용하였다.
- 건조된 슬라이드상의 염색체 변성을 위하여 70% formamide/ 2xSSC 용액에 2분간 처리하고, 70% 에탄올 (-20℃)에서 급냉 후, 95%와 99% 에탄올에서 각각 5분씩 탈수하여 상온에서 30분 정도 건조시켰다. 탐침 혼합액 (biotin-16-dUTP와 digoxigenin-11-dUTP로 각각 표지된 100 ng의 probe DNA, 50% formamide, 2X SSC, 10% dextran sulfate, 10 ng ssDNA)은 9代에서 10분간 변성시킨 후, 급냉시켜 준비하였다.
- 재료로 이용하였다. 염색체 관찰을 위해 고정한 근단을 IN HC1 (60℃)에서 5분간 연화한 다음, 증류수로 수세하고 Feulgen 용액에서 염색한 후, 1% aceto-carmine을 이용하여 압착법으로 프레파라트를 만들어 염색체를 관찰하였다. 양호한 분열상은 촬영하여 핵형분석에 사용하였다.
- falcatume\ 세포유전학적 분석을 통해 2n = 20과 2n = 26 으로 염색체수를 밝힌 바 있다. 염색체의 구조와 행동을 관찰하기 위해 개화기에 채집하여 고정한 꽃밥의 화분 모세포에서 섬시호 감수분열을 관찰하였다. Aceto-carmine 용액을 이용하여 화분모세포를 확인한 결과 감수분열 제1분열의 중기과정 (Fig.
- 울릉도 특산 식물인 섬시호를 대상으로 체세포분열과 감수분열 그리고 bicolor FISH를 통해 염색체 분석을 수행하여 다음과 같은 결과를 얻었다. 섬시호의 체세포 염색체수는 2n = 2X=16이며, arm-ratio 비교를 통한 핵형분석에서 6쌍의 중부염색체와 2쌍의 차중부 염색체로 관찰되었다.
- 2)에 담가 30분간 처리 (37℃) 후, Farmer’s solution을 이용하여 가는 핀셋으로 슬라이드글라스 위에서 염색체를 전개 한 뒤 상온에서 2-3일간 건조시켰다. 위상차 현미경 하에서 분열상이 양호한 슬라이드를 선발하여 FISH에 이용하였다.
- 5% Tween-20, pH 8.3) 완충액으로 37℃에서 5분간 blocking한 후, 1%의 avidin-FITC (fluorescein isothiocyanate)와 anti-digoxigenin rhodamine0] 포함된 100“。의 1% BSA/4XSSC의 혼합액을 슬라이드에 가한 다음 3기 C에서 30분 동안 반응시켜 biotin과 digoxigenin으로 표지된 DNA 탐침을 동시에 검출하였다. 4xSSC/0.
- 감수분열 염색체의 관찰결과 감수분열 제 1분열의 중기와 후기 세포를 각각 관찰 하였다. 중기 세포에서 8쌍의 2가 염색체가 중앙에 배열된 모습을 관찰할 수 있었고 후기세포에서는 8쌍의 상동 염색체들이 두 개의 딸세포를 형성하기 위해 분리되는 모습을 관찰하였다. 5S와 45S rDNA유전자를 탐침으로 하여 bicolor FISH를 수행한 결과 3 번 염색체의 동원체 주변에서 한쌍의 5S signal과 2번 염색체의 단완 말단 부위에서 한쌍의 45S signal을 각각 관찰 할 수 있었고, 상염색법으로 관찰되지 않은 인형성 염색체를 FISH를 통해 확인할 수 있었다.
- 30분 정도 건조시켰다. 탐침 혼합액 (biotin-16-dUTP와 digoxigenin-11-dUTP로 각각 표지된 100 ng의 probe DNA, 50% formamide, 2X SSC, 10% dextran sulfate, 10 ng ssDNA)은 9代에서 10분간 변성시킨 후, 급냉시켜 준비하였다. 건조된 슬라이드상에 20成의 탐침 혼합액을 가한 다음, 커버글라스를 덮고 paper bond로 봉하여, 37℃에서 16시간 이상 혼성화 (hybridization) 하였다.
- 화분 모세포의 관찰을 위하여 6월 말에서 7월 초순 사이 개화할 무렵에 10-12시에 개화 전의 꽃봉오리 전체를 절취하여 고정액에 담가 냉장고에 보관하면서 재료로 사용하였다. 해부 현미경 하에서 꽃밥을 꺼내어 슬라이드에 놓고, 화분모세포를 끄집어 낸 다음, 1% aceto- carmine을 떨어뜨리고 잘게 부순 후 압착법으로 슬라이드를 만들어 감수분열 염색체를 관찰하였다.
- 핵형분석은 Levan 등 (1964)의 방법에 따라 염색체의 동원체를 중심으로 하여, 단완 (short arm, S)과 장완 (long arm, L)의 길이를 이용한 arm-ratio (L/S)® 비교하여, 그 비가 1.0~ 1.7일 경우 중부 염색체 (M, metacentric), 1.7~3.0일 경우 차중부 염색체 (SM, submetacentric), 3.0 ~ 7.0일 경우차단부 염색체 (ST, subtelocentric), 7.0 이상일 경우 단부 염색체 (T, telocentric)로 구분하여 분석하였으며, 염색체의 배열은 긴 것으로부터 짧은 순으로 하여 고유 번호를 부여하였다.
- 혼성화 시킨 슬라이드는 40℃의 2xSSC, 50% formamide/ 2xSSC, 2xSSC, 4xSSC 용액에서 각각 5분씩 수세하였다. 탐침의 비 특이적인 결합을 막기 위해 염색체 슬라이드를 5% BSA/BT (IM NaHCO3+0.
대상 데이터
- 본 연구에 사용한 섬시호는 울릉도 남양에서 채집하여 생명공학연구원 포장에 심어 근단과 꽃봉오리를 채취하여 체세포분열과 감수분열의 재료로 사용되었다.
- Cells)에서 수행하였다. 화분 모세포의 관찰을 위하여 6월 말에서 7월 초순 사이 개화할 무렵에 10-12시에 개화 전의 꽃봉오리 전체를 절취하여 고정액에 담가 냉장고에 보관하면서 재료로 사용하였다. 해부 현미경 하에서 꽃밥을 꺼내어 슬라이드에 놓고, 화분모세포를 끄집어 낸 다음, 1% aceto- carmine을 떨어뜨리고 잘게 부순 후 압착법으로 슬라이드를 만들어 감수분열 염색체를 관찰하였다.
이론/모형
- ) 15㎖를 도포하여 커버를 덮은 후 cooled CCD 카메라 (Co이 SNAP, Photometries)牛 형광현미경을 이용하여 signal을 관찰하고 사진을 촬영하였다. 확인된 signal들은 Meta Imaging Semes TM 4.6 (Universal Imaging Corporation) 소프트웨어를 사용하여 합성하였다.
성능/효과
- 18로 중부 염색체로 관찰되었다. 2번 염색체와 구별이 어려웠으나 여러 개의 세포를 관찰하여 비교한 결과 길이에서 약간의 차이를 보였다.
- 중기 세포에서 8쌍의 2가 염색체가 중앙에 배열된 모습을 관찰할 수 있었고 후기세포에서는 8쌍의 상동 염색체들이 두 개의 딸세포를 형성하기 위해 분리되는 모습을 관찰하였다. 5S와 45S rDNA유전자를 탐침으로 하여 bicolor FISH를 수행한 결과 3 번 염색체의 동원체 주변에서 한쌍의 5S signal과 2번 염색체의 단완 말단 부위에서 한쌍의 45S signal을 각각 관찰 할 수 있었고, 상염색법으로 관찰되지 않은 인형성 염색체를 FISH를 통해 확인할 수 있었다.
- 염색체의 구조와 행동을 관찰하기 위해 개화기에 채집하여 고정한 꽃밥의 화분 모세포에서 섬시호 감수분열을 관찰하였다. Aceto-carmine 용액을 이용하여 화분모세포를 확인한 결과 감수분열 제1분열의 중기과정 (Fig. 3A)과 후기과정 (Fig. 3B)을 각각 관찰할 수 있었다. 중기과정에서는 8쌍의 2가 염색체 (bivalents)를 관찰할 수 있었는데, 2가 염색체는 상염색체 쌍이 서로 짝짓기를 하여 세포 중앙에 배열된 모습으로 관찰되었다.
- 중기과정에서는 8쌍의 2가 염색체 (bivalents)를 관찰할 수 있었는데, 2가 염색체는 상염색체 쌍이 서로 짝짓기를 하여 세포 중앙에 배열된 모습으로 관찰되었다. 또한 감수분열 제1 분열의 후기세포에서는 8개의 상동 염색체들이 똑같이 나뉘어져양극으로 이동하여 각각의 딸세포를 형성함을 관찰할 수 있었다. 감수분열에 대한 연구로 성염색체의 행동과 구조 변화를 관찰하기 위해 Humuluse- 식물 (Shephard et al.
- (Leitch & Heslop-Harri- son, 1992). 본 연구에서 상염색법으로는 인형성 염색체를 관찰 할 수 없었으나, 45S rDNA유전자를 이용한 FISH 결과한 쌍의 부수체 염색체를 2번 염색체의 단완 말단 부위에서 관찰 할 수 있었다. 식물 종에서 염색체의 다양성 연구에 유용한 분자 유전학적 방법으로 FISH 기법이 보편적으로 사용되는데 (Heslop-Harrisson & Schwarzacher, 1993), 상염색법이 염색체의 형태적인 특징만을 보여주는데 반해 FISH기법과 같은 분자세포유전학적 방법은 다양한 반복서열을 탐침으로 하여 형광 염색을 이용하기 때문에 모양과 크기가 유사한 염색체를 구분하기에 용이하고, 게놈을 연구하는데 있어 매우 유용한 기술이라 할 수 있다.
- 체세포와 감수분열 염색체의 관찰로는 인 형성 부위를 갖는 염색체를 관찰할 수 없었으나 FISH를 통해 보다 정확한 위치를 확인하여 핵형을 수행 할 수 있었다. 섬시호의 염색체 상에서의 5S와 45S rDNA유전자의 물리적 지도를 작성하기 위해 digoxigenin-16dUTP로 표지한 5S rDNA는 rhodamine으로, biotin-lldUTP로 표지한 45S rDNA 는 FITC로 bicolor FISH를 수행한 결과 45S rDNA유전자는 3번 염색체의 동원체 주변에서 한 쌍의 signal을 5S rDNA유전자의 경우는 2번 염색체의 단완 부위에서 한 쌍의 signal을 각각 관찰할 수 있었다. 45S rDNA 유전자는 리보솜의 구성성분으로 그 위치가 인형성 부위를 포함하고 있는 부수체 염색체에서 관찰되며, 염색체 상에 반복적으로 위치하여 어느 식물 종에서 나 한 쌍 이상 존재 한다.
- 같은 결과를 얻었다. 섬시호의 체세포 염색체수는 2n = 2X=16이며, arm-ratio 비교를 통한 핵형분석에서 6쌍의 중부염색체와 2쌍의 차중부 염색체로 관찰되었다. 염색체의 길이는 2.
- 염색체 1: 길이가 가장 긴 염색체로 평균 길이가 4.20“m였으며, arm-ratio는 2.00으로 차중부 염색체로 관찰되었다.
- 염색체 2: 염색체의 평균 길이는 3.60 “m였으며, arm-ratio는 1.40으로 중부 염색체로 관찰되었다.
- 염색체 3: 염색체의 평균 길이는 3.50 倒였으며, arm-ratio는 1.18로 중부 염색체로 관찰되었다. 2번 염색체와 구별이 어려웠으나 여러 개의 세포를 관찰하여 비교한 결과 길이에서 약간의 차이를 보였다.
- 염색체 5: 염색체의 평균 길이는 3.18 您였으며, arm-ratio는 1.27로 중부 염색체로 관찰되었다. 4번 염색체의 길이와 arm- ratio가 큰 차이를 보이지 않았으나 여러 개의 세포를 평균으로 하여 구분하였다.
- 염색체 6: 염색체의 평균 길이는 3.00 “n였으며, arm-ratio는 1.50으로 차중부 염색체로 관찰되었다.
- 염색체 8: 염색체의 평균 길이는 2.40 側로 상동 염색체 쌍 중 가장 길이가 짧게 관찰되었으며, arm-ratio는 1.18로 중부염색체로 관찰되었다. 인형성 부위 (NOR, nucleolus organizer region)를 지니고 있는 염색체는 현미경 하에서 관찰되지 않았으나 FISH를 통해 알 수 있었다.
후속연구
- , 2003b). 본 연구 결과는 다른 시호속 식물이나 계통이 다른 식물을 대상으로 한 연구에 적용될 수 있을 거라 사료된다. 본 연구에서 확립한 핵형과 감수분열 그리고 rDNAs의 세포유전학적 지도 작성은 섬시호의 유전체 구조의 연구과 유전자의 물리적 위치 탐색을 통해 시호속의 다른 종들의 유연관계를 분석하기 위한 기본적 자료로 이용될 수 있을 것이다.
- 본 연구 결과는 다른 시호속 식물이나 계통이 다른 식물을 대상으로 한 연구에 적용될 수 있을 거라 사료된다. 본 연구에서 확립한 핵형과 감수분열 그리고 rDNAs의 세포유전학적 지도 작성은 섬시호의 유전체 구조의 연구과 유전자의 물리적 위치 탐색을 통해 시호속의 다른 종들의 유연관계를 분석하기 위한 기본적 자료로 이용될 수 있을 것이다.
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